Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов (стр. 7 )

Быстрое размораживание лейкоконцентрата производили в 20-литровой водяной ванне при температуре +38ºС в течение 35-50 с (в зависимости от объема биообъекта), а в опытах с температурой переохлаждения (–10°С) - в течение 2-3 сек при интенсивном покачивании контейнера (3-4 раза в секунду) до температуры биообъекта +2 ÷ +4ºС

2.6 Методы оценки структурно-функционального состояния лейкоцитов, подвергнутых воздействию отрицательных температур

Морфологические и функциональные параметры нативных лейкоцитов изучались в течение первого часа после выделения их из крови и в первые минуты после смешивания с хладоограждающим раствором, а также в первые минуты после отогрева. Оценивали следующие показатели.

Подсчет общего количества лейкоцитов проводили в камере Горяева общепринятым методом на световом микроскопе Nikon H550S (Япония) при увеличении объектива х40 и окуляра х10.

Популяционный (морфологический) состав лейкоцитных концентратов изучали на световом микроскопе Nikon H550S при увеличении объектива х100 и окуляра х10; мазки крови окрашивали вначале красителем Май-Грюнвальда (эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду «Минимед-стандарт», Россия) до замораживания в течении 45 сек, после размораживания - 6 сек, а затем Романовского (азур-эозин по Романовскому «Минимед-стандарт», Россия) до замораживания - 30 мин, после размораживания - 10 мин.

Определение популяции Т - и В-лимфоцитов в лейкоцитных концентратах оценивали с помощью моноклональных антител производства «Сорбент» (Россия) в непрямом иммунофлуоресцентном тесте. На подготовительном этапе в интактных лейкоконцентратах и в их смеси с хладоограждающими растворами проводили гемолиз эритроцитов. Для этого 9 частей 0,83% раствор хлористого аммония (-Хим» г. Москва) смешивали с 1 частью биообъекта. Инкубировали 15 мин при +37°С. Центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин. Осадок отмывали раствором Хенкса («ПанЭко», Москва) путем центрифугирования 10 мин 1000 об/мин. В 50 мкл содержалось не менее 1 млн клеток (определяли с помощью камеры Горяева). Далее 50 мкл клеточной взвеси смешивали с 5 мкл соответствующего моноклонального антитела (LT3 к антигену CD3 (для Т-лимфоцитов) или LT22 к антигену CD22 (для В-лимфоцитов) и инкубировали 30-45 мин при +4°С. После чего дважды добавляли по 150 мкл раствора Хенкса и центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин. Исключение составляли размороженные объекты, которые центрифугировали по 3 мин. Удаляли супернатант. К осадку отмытых клеток добавляли 50 мкл F(ab,)2-фрагментов овечьих антител к Ig мыши (Sigma, США), меченных ФИТЦ и разведенных 1:100 с помощью физраствора, забуференного фосфатами (PBS), содержащего 0,5% желатины и 0,1% азида натрия. Клетки вновь суспендировали, инкубировали 30 мин при +4°С и два раза отмывали раствором Хенкса (центрифугировали 5 мин или 3 мин – для размороженных клеток при 1000 об/мин). Суспензию клеток переносили на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и просматривали под иммерсией на флуоресцентном микроскопе (объектив х90) в затемненном помещении. Просматривали 100 лимфоцитов. Количество антиген позитивных клеток определяли как процент флуоресцирующих.

Ц Целостность клеточной мембраны лейкоцитов оценивали с использованием суправитального красителя эозина (Shreck R. A., 1936). На предметном стекле смешивали каплю 1% раствора эозина (молекулярный вес 692) Н «Лаверна» (Россия) с равной по объему каплей лейкоконцентрата. На световом микроскопе Nikon H550S при увеличении объектива х40 и окуляра х10 в течение 2-3 мин подсчитывали 100 клеток. Признаком повреждения клеточной мембраны считали диффузное окрашивание цитоплазмы в розовый цвет, клетки с неповрежденной мембраной – жизнеспособные - имели светло-зеленый цвет. Тем самым экспериментально устанавливали процент жизнеспособных клеток.

Степень активации мембраносвязанной NADPН-оксидазы нейтрофилов определяли с помощью регистрации супероксидного анион-радикала в НСТ-тесте ( и соавт., 1992). Тест основан на реакции спонтанного восстановления красителя нитросинего тетразолия (НСТ), который в окисленном состоянии бесцветен, а при восстановлении до диформазана (с образованием стабильного промежуточного продукта - частично восстановленного моноформазана) в клетках преципитирует в виде грубодисперсных гранул темно-синего цвета. Cмешивали 0,02 мл раствора НСТ (2 мг сухого НСТ фирмы «Sigma» (США), растворенного в 1 мл буфера) 0,02 мл буфера и 0,05 мл лейкоконцентрата. Смесь термостатировали в термостате Гном («ДНК-Технология» Россия) при +37°С в течение 30 мин. Из нее готовили мазки, которые последовательно фиксировали в метиловом спирте (5-7 мин), высушивали и окрашивали 2% раствором метилового зеленого (20 мин). На микроскопе Nikon H550S при увеличении объектива х100 и окуляра х10 подсчитывали 100 нейтрофилов и устанавливали долю клеток с гранулами темно-синего цвета.

Фагоцитарную активность нейтрофилов по модифицированному методу и соавт. (1977) с использованием инертных частиц латекса диаметром 0,08 мкм («Sigma-Aldrich» Германия), которые в соотношении 1:10 разводили средой Хенкса («Биолот» Россия). Разведенный латекс (0,05 мл) смешивали с 0,1 мл лейкоконцентрата, помещали в термостат при +37°С на 30 мин и через каждые 10 мин встряхивали. Затем готовили мазки, которые последовательно окрашивали красителями Май-Грюнвальда (эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду «Минимед-стандарт», Россия) и Романовского (азур-эозин по Романовскому «Минимед-стандарт», Россия). Клетки до замораживания окрашивали в течение 40 с и 30 мин соответственно, а размороженные - 6 с и 10 мин. При микроскопировании (объектив х100, окуляр х10) подсчитывали 100 нейтрофилов, определяли долю клеток с поглощенными частицами латекса.

Содержание соединений, обеспечивающих микробицидность нейтрофилов без участия кислорода (дефензины, серпроцидины, кателицидин), в гранулах нейтрофилов, определяли с помощью лизосомально-катионного теста по методике и (1999). При этом гранулы, содержащие катионные белки, окрашиваются в синий цвет. На световом микроскопе Nikon H550S (объектив х100, окуляр х10) подсчитывали 100 нейтрофилов и по формуле Астальди-Верга вычисляли средний цитохимический коэффициент в условных единицах (у. е.). Для этого каждый из 100 нейтрофилов по содержанию гранул относили к одной из четырех групп: а - клетки без гранул, b - клетки с единичными гранулами, с - гранулы занимают около 1/3 клетки и d - гранулы занимают большую часть клетки. Средний цитохимический коэффициент (в у. е.) находили по формуле (0а + 1b + 2с + 3d)/100.

Определение содержания кислорода в лейкоцитных концентратах определяли с помощью амперометрического метода на анализаторе Эксперт-001-4 (Эконикс-эксперт» г. Москва) в режиме работы «термооксиметр». Амперометрический датчик растворенного кислорода с термоэлектрическим преобразователем представляет собой гальваническую ячейку герметичного исполнения, заполненную жидким щелочным, кислотным или солевым электролитом, в котором находятся два электрода, отделенные от анализируемой среды полупроницаемой мембраной. Молекулы растворенного в биосреде кислорода диффундируют через газопроницаемую мембрану датчика и восстанавливаются на катоде. На аноде происходит реакция окисления. При условии постоянства температуры генерируемый при этом электрический ток пропорционален концентрации кислорода в биосреде. С помощью встроенного сопротивления электрический ток преобразуется в напряжение. Зависимость концентрации кислорода от температуры учитывается микропроцессором при выдаче окончательного результата. Сигналы с датчика по кабелю поступают в измерительный преобразователь, а затем нормированные сигналы преобразуются в цифровую форму и отображаются на дисплее (в мг/л.)

Для определения содержания кислорода в лейкоцитном концентрате в стеклянную колбу наливали 12,5 мл биообъекта, помещали в него амперометрический датчик и снимали показания с дисплея прибора до температуры среды +25°С.

Определение интенсивности процесса перекисного окисления липидов и антиоксидантной активности у лейкоцитов методом индуцированной хемилюминесценции. Метод индуцирования хемилюминесценции перекисью водорода с сульфатом железа основан на том, что в представленной системе происходит каталитическое разложение перекиси ионами металла с переходной валентностью - двухвалентным железом по реакции Фентона. Образующиеся при этом свободные радикалы (R-, OH-, RO-, RO2-, O2-) вступают в процесс инициирования свободно радикального окисления (СРО) в исследуемом биологическом субстрате. На последней стадии СРО при рекомбинации RO2- происходит образование неустойчивого тетроксида (R-O-O-O-O-R), распадающегося с выделением кванта света. Протекающий процесс СРО регистрируется в течении 30 сек - это время наибольшей информации о его интенсивности.

Измерения проводили на биохемилюминометре БХЛ-07 (ЦНИЛ НГМА; «ИМБИО» Н. Новгород, Россия). Регистрировали: Imax (мВ) - максимальную интенсивность быстрой вспышки - отражает потенциальную способность биологического объекта к СРО; S (мВ×сек) - светосумму за 30 сек – площадь под кривой свечения пробы отражает содержание радикалов RO2, соответствующих обрыву цепи СРО, показатель дает возможность оценить систему ПОЛ-АОА; антиоксидантный потенциал обследуемой пробы коррелирует: с показателем tg(-2α) - тангенс угла наклона кривой оси времени (характеризует максимальную крутизну спада кривой, со знаком «-»; с коэффициентом a (S/Imax × t) - безразмерный параметр, характеризует полную относительную интенсивность излучения за время измерения; с коэффициентом Z (S/Imax) - нормированная светосумма за время измерения. Чем выше показатель tg(-2α), тем выше антиоксидантная активность (активность ферментативных систем, регулирующих уровень гидроперекисей) в исследуемой пробе, и наоборот чем выше a и Z, тем ниже антиоксидантная активность.

Для определения ХЛ в измерительную кювету вносили 0,1 мл лейкоцитного концентрата и 0,4 мл фосфатного буфера (рН=7,5), добавляли 0,4 мл 0,01 мМ раствора сульфата железа (-Хим» г. Москва) и помещали кювету в измерительное гнездо прибора. Затем в кювету быстро вносили 0,2 мл 2% раствора перекиси водорода ( Химпром» г. Самара) и регистрировали сигнал ХЛ в течение 30 сек.

2.7 Методы статистического анализа

При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение ± среднее квадратичное отклонение (M±δ). Для выявления статистической значимости различий между группами применяли непараметрический критерий Уилкоксона ( 1998) с использованием компьютерной программы для медико-биологической статистики «BIOSTAT».

Фотосъемку биологического объекта проводили с помощью видео-окуляра (х15) марки DSM 130 (Китай) и программного обеспечения ImageBase 1.1 DCM 130.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие температуры переохлаждения (–10ºС)

3.1.1 Сохранность лейкоцитов, перенесших воздействие температуры переохлаждения (–10°С) без применения криозащитного раствора

На начальном этапе исследования оценивали функциональные показатели лейкоцитов крови человека, подвергнутых воздействию отрицательной температуры –10°С без применения хладоограждающих сред. Установлено (М±σ; n=10), что уже через 1 сутки хранения абсолютное количество лейкоцитов статистически значимо (р<0,05) снижается с 15530±656 до 12110±625 в 1 мкл, что составляет 78,1±1,5% от уровня до охлаждения. При этом число клеток с неповрежденной мембраной (эозиноустойчивой) составляет 88,7±1,7% от исходного количества жизнеспособных клеток. Значительно снижается количество гранулоцитов, после отогрева оно составляет 17,1±2,9% относительно исходного уровня. Остальные показатели лейкоцитов определить не удалось.

3.1.2 Структурно-функциональная сохранность лейкоцитов, перенесших воздействие температуры переохлаждения (–10°С) в течение 1 суток в криоконсервирующих растворах №1-7

На следующем этапе исследования оценивали функциональные показатели лейкоцитов крови человека, подвергнутых воздействию отрицательной температуры –10°С в течение 1 суток в предложенных хладоограждающих растворах №1-7 (табл. 2.2.1) с целью выбора наиболее эффективного.

При подсчете количества лейкоцитов в камере Горяева установлено (табл. 3.1.2.1), что абсолютное и относительное число клеток статистически значимо (р<0,05) снижается только в опытах с раствором №7, а относительное - №3 и №5. Остальные варианты раствора обеспечивают сохранность лейкоцитов исходного уровня.

Оценка эозинорезистентности лейкоцитов показала (табл. 3.1.2.2), что только при использовании консервирующего раствора №6 количество клеток с неповрежденной мембраной после отогрева соответствует исходному уровню. В опытах с растворами №2 и №4 жизнеспособность отогретых клеток составляет более 90% от числа клеток до охлаждения.

Таблица 3.1.2.1 Количество лейкоцитов (М±σ), перенесших воздействие температуры переохлаждения (–10°С) в течение 1 суток в предложенных хладоограждающих растворах

Примечания. * - различие со значением до охлаждения p<0,05; + - различие с исходным 100% уровнем p<0,05.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27