Таким образом, при использовании хладоограждающего раствора №9 показатели функционального состояния лейкоцитов при –20°С остаются на высоком уровне в течение 21 суток, после чего отмечается их ухудшение.

Данные полученные в лизосомально-катионном тесте свидетельствуют о том, что уровень среднего цитохимического коэффициента (СЦК) у размороженных нейтрофилов при их хранении в растворе №9 после 21 суток холодового воздействия (–20°С) не изменяется - исходный уровень СЦК составляет 2,3±0,6 у. е (n=10, М±σ), после отогрева - 1,9±0,4 у. е. Следовательно содержание микробицидных белков в клетке остается на прежнем уровне (рис. 3.2.3.2).

Под защитой хладоограждающего раствора №9 после размораживания через 21 сутки сохранялась тенденция к увеличению численности популяции Т-лимфоцитов (85,2±3,3%; М±σ, n=5) в сравнении с уровнем до замораживания (75,0±8,4%), однако количество В-лимфоцитов уменьшалось (р<0,05): исходно - 8,7±2,7% (М±σ, n=5), после отогрева 1,7±0,9%, т. е. данная популяция лимфоцитов теряет свою стабильность.

Определение содержания растворенного в биосреде кислорода показало, что через 21 сутки нахождения лейкоцитов при –20°С отмечается снижение (р<0,05) концентрации кислорода в среднем на 0,7 мг/л (рис. 3.2.3.3).

Рисунок 3.2.3.3 Содержание растворенного кислорода в смеси лейкоцитных концентратов (ЛК; n=10) с криопротекторным раствором (КР) №9 до и после хранения при –20°С в течение 21 суток

+ - p<0,05.

Применение хладоограждающего раствора №9, содержащего в исходной концентрации ГМБТОЭМ - 28%, ОМЭПС - 0,15% и бидистиллированную воду до 100 мл позволяет сохранить лейкоциты в условиях субумеренно-низкой температуры (–20°С) в течение 21 суток.

Рисунок 3.2.1.1 Эозинположительный (красный)

и эозинотрицательный лейкоциты до температурного воздействия

Рисунок 3.2.2.1

Сегментоядерный нейтрофил

с фагоцитированными микрочастицами латекса

до воздействия отрицательной

температуры

Рисунок 3.2.3.1

Сегментоядерный нейтрофил с фагоцитированной микрочастицей латекса после 21 суток экспозиции при –20°С в хладоограждающем растворе №9

Рисунок 3.2.3.2

Сегментоядерные нейтрофилы

с активными гранулами, содержащими катионные белки после 21 суток экспозиции при

–20°С в хладоограждающем растворе №9

3.2.4 Определение интенсивности процесса перекисного окисления липидов и антиоксидантной активности методом индуцированной хемилюминесценции в лейкоцитных концентратах, перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (–20ºС) в криоконсервирующем растворе №9 разной продолжительности

При изучении влияния каждого ингредиента хладоограждающего раствора №9 на уровень ПОЛ-АОА лейкоцитов показано (табл. 3.2.4.1), что ОМЭПС (0,15%) снижает ПОЛ и АОА, а криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ (28%) повышает (р<0,05) уровень ПОЛ и АОА.

Таблица 3.2.4.1 Влияние ингредиентов хладоограждающего раствора №9 на уровень ПОЛ и антиоксидантный потенциал ядросодержащих клеток крови (n=6, М±σ)

Исследуемый субстрат

Показатели хемилюминограммы

Imax

S

tg(-2α)

a

Z

Лейкоцитный концентрат

115,0±26,6

843,8±142,9

26,2±5,5

0,25±0,02

7,5±0,5

Лейкоцитный концентрат 1:1

с ГМБТОЭМ 28%

160,2±23,6

*

1065,0±172,1

*

40,2±5,5

*

0,21±0,02

*

6,6±0,5

*

Лейкоцитный концентрат 1:1

с ОМЭПС

0,15%

80,5±10,8

*

675,2±88,2

*

20,9±3,2

*

0,26±0,04

7,6±0,6

Примечание. * - различие с величиной показателя лейкоцитных концентратов p<0,05.

Установлено (таблица 3.2.4.2), что при смешивании лейкоцитов с криоконсервирующим раствором №9 уровень ПОЛ не изменяется, т. к. максимальная интенсивность быстрой вспышки (Imax), отражающая потенциальную способность биологического объекта к свободно радикальному окислению и светосумма (S) за 30 сек, свидетельствующая о содержание радикалов соответствуют уровню клеток без раствора. Повышение (р<0,05) показателя tg(-2α) свидетельствует об увеличении антиоксидантного потенциала клеток перед замораживанием.

Таблица 3.2.4.2 Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (n=6, М±σ), перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (–20°С) под защитой криоконсервирующего раствора №9 в течение 21 суток

Лейкоцитный концентрат

Показатели

Imax

S

tg(-2α)

a

Z

до

замораживания

117,7±20,3

899,3±181,5

23,4±2,2

*

0,25±0,01

*

7,6±0,2

*

до

замораживания

с раствором №9

139,0±30,6

939,7±150,3

32,9±7,0

0,22±0,01

6,6±0,4

через 21 сутки хранения

158,0±27,4

1022,0±182,6

30,9±3,9

0,22±0,005

6,5±0,2

Примечание. * - различие с величиной показателя до замораживания с хладоограждающим раствором p<0,05.

У клеток отогретых через 21 сутки хранения при –20°С уровень ПОЛ и АОА не отличаются от таковых до замораживания с хладоограждающим раствором.

3.3 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (–40ºС)

3.3.1 Сохранность лейкоцитов, перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (–40ºС) без применения криозащитного раствора

Подсчет количества клеток в камере Горяева показал (М±σ; n=10) что в первые минуты после отогрева сохранность лейкоцитов по сравнению с исходным уровнем (до замораживания) составляет 68,2±1,1% и продолжает стремительно ухудшаться с увеличением времени экспозиции отогретых клеток при комнатной температуре. Количество клеток с неповрежденной мембраной (устойчивой к эозину) после отогрева в первые минуты составляет 15,2±3,2%, через 5 минут - снижается до 10,1±2,5%.

Анализ морфологического состава лейкоцитного концентрата (рис. 3.3.1.1), подвергнутого воздействию умеренно-низкой температуры (–40ºС) без применения криоконсервантов, показал, что в отогретых биообъектах во всех случаях преобладают «голые» ядра. Сохранность гранулоцитов после отогрева в первые минуты составляет 16,2±1,1%. Другие показатели клеток, в ввиду их низкой жизнеспособности определить не удалось.

3.3.2 Структурно-функциональная сохранность лейкоцитов, перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (–40ºС) в течение 1 суток в криоконсервирующих растворах №12-18

На следующем этапе исследования оценивали функциональные показатели ядерных клеток крови, подвергнутых воздействию умеренно-низкой температуры –40°С в течение 1 суток в предложенных хладоограждающих растворах №12-18 (табл. 2.2.1) с целью выбора наиболее эффективного.

Установлено (табл. 3.3.2.1), что абсолютное и относительное число клеток снижается (р<0,05) только в опытах с раствором №17 и не изменяется при использовании растворов №15 и №16.

Хладоограждающие растворы №13 и №16 обеспечивают устойчивость клеточных мембран к витальному красителю эозину более чем у 80% (от исходного уровня) лейкоцитов.

Анализ морфологического состава отогретых лейкоцитов показал, что сохранность гранулоцитов исходного уровня отмечается в опытах с растворами №13 (абсолютное значение) и №16 (абсолютное и относительное значения). В тех случаях, когда уровень гранулоцитов снижался, отмечалось соответствующее повышение уровня лимфоцитов и моноцитов (т. к. подсчет производился на 100 клеток).

Сохранность фагоцитарной активности нейтрофилов в опытах с раствором №13 была самая высокая - у 95,9±4,5% (от исходного уровня) отогретых клеток отмечалась способность фагоцитировать частицы латекса (рис. 3.3.2.1). При использовании раствора №16 более 70% гранулоцитов сохраняли фагоцитарную активность.

Таким образом, оценивая морфофункциональное состояние отогретых лейкоцитов по примененным методикам, лучшие результаты из всех испытуемых хладоограждающих растворов были получены в опытах с раствором №13, содержащим в исходной концентрации криопротектор ГМБТОЭМ - 30%, антигипоксант фумарат натрия - 2,8%, лимонную кислоту - 0,06 % и бидистиллированную воду до 100 мл.

Исследование содержания в нейтрофилах активированных кислородных метаболитов с помощью НСТ-теста показало (М±σ, n=9), что у нейтрофилов, находящихся под защитой хладоограждающего раствора №13 после 1 суток воздействия температуры –40°С наблюдается существенное повышение содержания АКМ. Так, если исходное количество НСТ-положительных клеток составляло 21,7±4,0%, то после размораживания оно увеличивалось (p<0,05) до 67,3±6,2%, т. е. возросло примерно в 3 раза.

Таблица 3.3.2.1 Показатели лейкоцитов (М±σ), перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (–40°С) в течение 1 суток в предложенных хладоограждающих растворах

Номер раст-

вора

n

Показатели

до замораживания

после

отогрева

после отогрева в % от уровня до замораживания

Количество лейкоцитов в 1 мкл

12

13

8538±460

8507±372

97,1±3,0

13

12

9356±1585

9056±1399

94,2±3,7

14

14

6520±1807

5950±1324

91,6±9,3

15

6

6850±1917

7050±1785

99,3±1,6

16

6

11350±1369

11130±1227

98,3±4,1

17

6

20600±8654

17300±5305*

88,3±14,0+

18

5

27240±4053

23140±2442

85,4±7,1+

Количество эозинорезистентных лейкоцитов в %

12

13

98,1±0,7

51,9±4,9*

52,8±5,1+

13

12

96,1±4,6

80,9±9,3*

84,3±6,6+

14

14

98,4±0,7

62,6±9,7*

54,9±8,4+

15

6

97,5±2,7

58,2±4,2*

60,4±2,9+

16

6

98,5±0,5

80,4±3,8*

82,0±4,1+

17

6

97,5±2,7

43,5±16,4*

51,0±7,4+

18

5

97,4±0,5

77,0±10,1*

79,0±10,1+

Количество гранулоцитов в %

12

13

27,7±6,5

15,1±3,1*

61,3±6,1+

13

12

28,5±6,4

26,4±4,9

88,9±9,0+

14

14

30,1±4,1

17,4±3,7*

57,1±6,5+

15

6

15,5±1,6

12,8±1,3*

85,0±11,5+

16

6

34,5±14,8

36,4±15,9

96,2±8,5

17

6

18,5±0,5

16,3±1,4*

88,2±7,1+

18

5

42,1±2,7

31,2±1,3*

74,6±6,6+

Количество фагоцитарноактивных нейтрофилов в %

12

5

37,4±4,3

17,3±2,1*

49,8±6,8+

13

12

41,9±4,7

39,8±3,6

95,9±4,5

14

6

49,1±2,3

27,2±3,7*

50,4±4,7+

15

6

70,0±0,0

23,2±6,5*

33,5±9,0+

16

6

60,5±9,3

43,7±7,9*

72,0±7,6+

17

6

44,5±2,7

21,2±2,1*

47,8±6,6+

18

5

52,3±2,1

34,7±3,7*

66,4±4,6+

Примечания. * - различие со значением до замораживания p<0,05; + - различие с исходным 100% уровнем p<0,05.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27