Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов (стр. 2 )

Степень и скорость повреждения клеток предопределяется целым рядом условий, среди которых наиболее важную роль играет скорость охлаждения биообъекта (, , и др., 1973; , , М, 1975; , , и др., 1975; , Х, и др., 1975).

Так, при ускоренном прохождении биообъектом зоны фазовых превращений (Mazur Р., 1963, 1984) снижается уровень дегидратации и время нахождения клеток в дегидратированном состоянии. При этом, наблюдается образование множества мелких кристаллов льда ( и др., 1972) и сокращается время действия гиперконцентрированных растворов солей (Ре Луи, 1962; , 1983; Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. et al., 1976), однако при больших скоростях замораживания биообъекта возрастает частота образования внутриклеточных кристаллов льда (Shimada K., Asahia E., 1975) и повреждений, вызванных его воздействием. Кроме того, сохранность быстро замороженных клеточных суспензий сильно снижается при медленном отогреве, который сопровождается рекристаллизацией (то есть укрупнением) внеклеточного льда (Morris G. J., 1981), нарушением физиологических концентраций растворов солей вне и внутри клеток, способствующих вакуолизации, обводнению и осмотическому лизису клеток (Merymen H.T., 1974).

При медленном охлаждении клеток идут зарождение, формирование и рост внеклеточных кристаллов льда, жидкое содержимое клетки достаточно сильно концентрируется за счет вымораживания свободной воды (Mazur P., 1970; Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. et al., 1976). При этом, клетки могут захватываться растущими кристаллами льда и повреждаться при их механическом сдавливании (, 1969; Лозина-, 1972; , 1972, 1983; и др., 1975, 1976, 1977, 1981; , 1986; и др., 1988; Luyet B. J. et al., 1960, 1970; Rapatz G. и Luyet B. J., 1971, 1975; Diller K. R. et al., 1975), а также подвергаться неблагоприятному воздействию концентрированных растворов солей (, , 1975, 1981; и др., 1985, 1987; , , 1988; , , 2002; Polge C., Lovelock J. E., 1952; Lovelock J. E., 1953; Smith А.U., 1953; Rey L., 1959; Smith A. U., 1961, 1963). Показано (, , , 1975), что в липидной части биомембраны в условиях медленного замораживания активируются цепные перекисные процессы, что вызывает потерю холестерина и нарушение функций митохондрий.

В процессе эволюции клетка унаследовала от первичной жизнеспособной структуры способность обратимо снижать содержание воды, что способствует сохранению структуры клетки и ее функций (, 1968; , 1969, 1971; Лозина-, 1972; , 1974; Mazur P., 1960; Farrant J., 1965, 1977; Karrow A. M. et al., 1965; Levitt J., 1966, 1967; Meryman H. T., 1966, 1970; Rapatz G., Luyet B., 1971; Burke M. J. et al., 1974; Williams W. P., 1985; Bernard A. G. et al.,1990). При замораживании дегидратация может стать как причиной повреждения в результате гипертонического стресса, так и способом предотвращения внутриклеточного кристаллообразования (Meryman H.T., 1971).

Изменения осмотического давления внеклеточной среды, вызываемые процедурой криоконсервирования, отражаются на содержании внутриклеточной воды в клетках, величине клеточного объема и степени деформации мембранных структур (, , Ф, 1987; , , 1992). При замораживании биообъекта с криопротекторомом клетки могут погибнуть от гипертонического стресса (Mazur P., 1965; Meryman H.T., 1971), на этапе удаления – в результате постгипертонического стресса (, , 1994). Поэтому определение коэффициентов проницаемости клеток для криопротекторов и воды является необходимым условием прогнозирования осмотического поведения клеток в процессе криоконсервирования.

Мишенью приложения факторов криоповреждения клетки в зоне фазовых превращений преимущественно является плазматическая мембрана (, , 1975; Lyons J.M., 1972; Farrant J., Morris G.J., 1973). Развитие этой концепции привело к гипотезе, согласно которой дегидратация является фактором, управляющим состоянием мембранного цитоскелета, а охлаждение индуцирует в нём дополнительные напряжения, способные привести к нарушению мембранной проницаемости (, 1988; , 1990; и др., 1990; , 1995; , , 2008).

Форму и объем клеток, а также состояние поверхности мембраны, регулирует белковый цитоскелет, который играет важную роль в сохранении важнейших физиологических процессов: реализацию генетической программы развития и роста, динамику структурной интеграции метаболизма, пространственное расположение молекулярных и субклеточных компонентов клетки, цитокинез, динамику хромосом и биотрансформацию энергии АТФ в клетке (, , 1994). А поскольку развитие температурного шока (, , 2004; Lyons J.M., 1972; Farrant J., Morris G.J., 1973) тесно связано с модификацией белков цитоскелета, то, прежде всего, имеют значение те ионы, которые влияют на структурно-функциональное состояние биополимеров (Na+, Ca2+, К+, Mg2+, Н+). Если нарушается соотношение указанных выше катионов внутри клетки, то это приводит к изменению структуры и функции белков цитоскелета, стабилизирующих ее структуру.

Изменение рН в щелочную сторону (с максимумом до 8,0) сопровождается увеличением микровязкости внутриклеточных белков. Механизмы, при помощи которых рН оказывает влияние на компоненты мембран и белки цитозоля при замораживании клеток, остаются до конца неясными.

Различают несколько типов мембранных белков, которые могут по-разному повреждаться при охлаждении, замораживании и отогреве: белки, погруженные в липидный бислой будут с большей вероятностью сохранять свои специфические свойства, чем белки, гидрофильная часть которых направлена во внешнюю среду, где она будет подвергаться действию «эффекта растворов» и кристаллов льда. Отмечено, что при охлаждении лимфоцитов в мембранах наблюдается «вымораживание» белков из одного монослоя липидов в другой перпендикулярно плоскости мембраны. Белковые агрегаты, «выдавленные» в наружный монослой, наиболее подвержены действию высокой осмотической активности среды, рН и дегидратации (, , 1994).

Весьма чувствительным к величине рН, которая может изменяться в жидких микро-фазах ледяных канальцев при замораживании, является липидный бислой мембран (, , 1975). Это связано с тем, что протонирование головок липидов играет важную роль в их упаковке и фазовых переходах. Например, в смешанных фосфолипидных везикулах фазовый переход при рН 7,4 происходит при 0°С, а при рН 2,5-при 26°С, т. е. в случае сильного протонирования карбоксильных группировок липидов они разделяются по фазам и затвердевают. При криоконсервации биообъектов часто используют различные буферные растворы, которые могут влиять на величину рН в жидких микроканальцах по мере концентрирования замороженного раствора (Mazur P., 1970). Чем сильнее деформируется клеточная мембрана под влиянием рН и тоничности среды, тем больше создается условий для открепления от мембраны и элиминации цитоскелетных и других внутриклеточных белков из клеток. Инкубация клеток при кислых значениях рН (4,0-5,0) может приводить к формированию поперечных сшивок мембранных белков в результате окисления их SH-групп и уменьшению «микровязкости» внутриклеточных белков.

Степень нарушения структурно-фазового состояния липидов отличается при разных температурах (, , 1982). Так, при снижении температуры окружающей среды от +37°С до 0°С фазовым переходам в первую очередь подвергаются анулярные липиды. Наблюдается латеральное разделение липидов в мембранах с высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот и низким содержанием холестерина. Чем меньше холестерина, тем при более высокой температуре происходит кристаллизация липидов (, 1976). В результате ослабевания гидрофобных взаимосвязей в мембране, угнетаются функции ферментов, нарушаются проницаемость мембраны, транспорт ионов и биомолекул, что приводит к нарушению синтеза веществ и энергопродукции и соответственно к гибели клетки. С другой стороны, к такому результату приводит и развивающаяся гипоксия, которая способствует изменению рН, накоплению недоокисленных продуктов, падению уровня макроэргов, накоплению Са2+ в гиалоплазме, в результате чего активируются мембранные фосфолипазы, нарушается проницаемость мембраны для ионов, разобщаются процессы дыхания и окислительного фосфорилирования. Следствием гипоксии является также активация ПОЛ, которая приводит к повышению проницаемости мембран лизосом, выходу в цитоплазму лизосомальных гидролаз и повреждению систем синтеза белков и нуклеиновых кислот.

При дальнейшем снижении температуры (0° ¸ –30°С) в следствие кристаллизации водной фазы (первичная кристаллизация) гибель клетки может быть вызвана: механоэлектрическими эффектами образующихся кристаллов; гиперконцентрацией ионов и метаболитов в жидкой фазе микроканальцев - изменяются рН и ионные силы среды, свойства воды жидкой фазы как растворителя; дегидратацией клетки – ее осмотическое сжатие, структурно-биохимическая модификация субмембранного ретикулума, деформация мембраны, кренирование клетки. Кроме того, в данном температурном диапазоне наблюдаются фазовые переходы основной массы мембранных липидов, латеральное разделение которых приводит к образованию структурных дефектов, нарушению проницаемости мембраны и перераспределению ионов и биомолекул, элиминации лизосомальных гидролаз в цитоплазму клетки и повреждению систем синтеза белков, нуклеиновых кислот и биоэнергетики. Фазовые переходы основной массы мембранных липидов вызывают также конформационные превращения и изменения активности ферментов, блокирование клеточных и гормональных механизмов регуляции метаболизма; образование различных по стабильности белок-липидных и липид-липидных комплексов в плоскости мембраны, пространственное сближение субстратов и активаторов ПОЛ, агрегацию поверхностных рецепторов и трансмембранных белков. Результатом описанных событий является гибель клетки.

В настоящее время известны следующие теории (гипотезы, концепции) криоповреждения клеток.

Механическая гипотеза. Впервые о механической гипотезе повреждения цитоплазматических мембран и межклеточных контактов растущими кристаллами льда упоминается в работах (1913), в дальнейшем она рассматривается рядом исследователей ( и др., 1983; , , 1994). Т. Nеi (1962) и С. Lusena (1965) считали, что плазматические мембраны клеток проявляют устойчивость только к медленно растущим кристаллам льда и сильно повреждаются в случае взрывного роста кристаллов внутри клетки, что приводит к механическому разрыву мембраны.

Эти явления проявляются и при рекристаллизации (укрупнении кристаллов льда при отогреве).

Рекристаллизационная гипотеза. При изучении механизмов морозоустойчивости растительных и животных клеток показано (Asachina Е., 1966), что некоторые клетки могут выживать при возникновении внутриклеточного льда при условии формирования мелкозернистых кристаллов, не способных к росту. Если, при этом, отогрев клеток проводить очень быстро, то они полностью сохраняют свои биологические свойства ( и др., 1981). Н. Moor (1964) полагает, что внутриклеточные кристаллы льда, размер которых не превышает 0,01 мкм, безвредны для клеток. В литературе (Лозина-, 1963; Rapatz G., Sherman J., 1964; Asahina E. et al., 1970) имеются ссылки на то, что образование льда внутри форменных элементов не всегда вызывает грубые морфологические изменения и не ухудшает функциональные свойства при пересадке клеток. Многие авторы считают, что повреждение клеточных структур в основном происходит не в процессе замерзания воды, а во время отогревания и рекристаллизации, когда наблюдается укрупнение кристаллов льда. Избежать это возможно при высокой скорости отогревания, тогда под влиянием роста кристаллов льда структура плазматических мембран не успевает разрушиться и удаётся избежать дополнительной дегидратации клеток и связанных с ней повреждений ( и др., 1975, 1976, 1977; Лозина- и др., 1972, 1986; Asahina E. M., 1966, 1970; Meryman H. T., 1970; Sakai A., 1971; Rall W. F. et al., 1980). Рекристаллизационная гипотеза криоповреждений имеет место также при гибели криоконсервированных клеток при проведении технологических операций в низкотемпературном банке, вызывающих колебания температуры хранения биологических объектов ( и др., 2005). При этом, количество погибших клеток увеличивается с повышением температуры и увеличением количества циклов ее колебания.

Концепция гиперконцентрированных растворов. Повреждающее действие может оказывать и концентрация солей, возникающая при вымораживании чистой воды в лед (Lovelock J.E., 1953). Согласно этой концепции разрушение замораживаемого биообъекта происходит за счет воздействия гиперконцентрированных растворов электролитов на структуру плазматической мембраны клеток: нарушаются водородные, ионные и гидрофобные связи между компонентами мембран, в результате чего мембраны теряют часть фосфолипидов и холестерин. Изменяется поток ионов и метаболитов, осмотическая устойчивость мембран клеток резко снижается, и они могут лизировать. Гипотеза, выдвинутая J. Е. Lovelock (1953), претерпела ряд модификаций (Doebbler D., 1966; Mazur P., 1966; Nei T., 1968; Meryman H., 1971).

Двухфакторная концепция. P. Mazur (1970) выдвинул и математически смоделировал двухфакторную концепцию криоповреждений клеток, в которой отметил, что гибель клеток происходит в результате роста внеклеточного льда и действия «эффектов раствора», а также большую роль играет быстрая скорость замораживания биообъекта, когда переохлажденные клетки не успевают дегидратировать и повреждаются в основном внутриклеточными кристаллами льда. Экспериментальные данные, полученные для тканевой культуры почки китайского хомячка (Mazur P. et al., 1969, 1972), эритроцитов (Rapatz G. еt al., 1968; Miller R. H. et al., 1976; Nei N., 1976) и миелокариоцитов (Leibo S. P., 1980) укладываются в рамки этой гипотезы.

Получены данные, о том, что определяющим криоповреждение фактором служит объём потерянной клеткой воды (, 1968; Farrant J., 1965; Karrow A. M. et al., 1965; Meryman H. T., 1968, 1970; Burke M. J. et al., 1974).

Концепция минимального объема клетки. Согласно H.T. Meryman (1971), обезвоживание клеток сопровождается уменьшением их объема и развитием механического напряжения на мембране. H.T. Meryman выдвинул концепцию “минимального объема клетки”, при достижении которого процесс дегидратации приостанавливается и дальнейшее увеличение осмотичности среды способствует потере барьерных свойств плазматической мембраны, а затем разрушению клетки. В основе лежит способность плазматической мембраны сжиматься до определенного уровня, после которого она начинает испытывать сопротивление внутриклеточного содержимого. В результате максимального сжатия на мембране возникает градиент гидростатического давления, который приводит к ее разрыву. Однако это не было подтверждено последующим биофизическим моделированием ( , 2003). Известно, что повреждение плазматической мембраны при охлаждении носит более сложный характер, связанный с развитием перекисного окисления липидов, их фазового разделения в плоскости мембраны, нарушением структурно-функционального состояния белков цитоскелета. Гипотеза минимального объема аналогична гипотезе J. E. Lovelock (1953) и предполагает необходимость наличия криопротектора как внутри, так и вне клеток для эффективной криозащиты.

Сульфгидрильная теория. Некоторые положения концепции минимального объема были дополнены сульфгидрильной теорией криоповреждений биообъектов (Levitt J., 1966; , , 1994), согласно которой в результате пространственного сближения микромалекул и взаимодействия реакционно способных группировок формируются ковалентные дисульфидные связи в белках типа S-S-сшивок, которые устраняют функцию активных SН-групп ферментов и тем самым нарушают биологические свойства белков мембран и цитозоля. Подобное утверждают и др. (2004), указывая, что даже при успешном криоконсервировании и получении стеклообразного состояния материала, замороженный биологический объект будет подвергаться термомеханическим напряжениям.

Мембранная концепция. Выявление механизмов криоповреждений клеток позволило сформулировать (, 1994) мембранную концепцию криоповреждений. Показано, что основным механизмом повреждения мембраны в условиях охлаждения, замораживания и отогрева являются фазовые превращения липидов и белков, приводящие к нарушению барьерных свойств мембраны и утечке из цитоплазмы ионов и биомолекул через трансмембранные дефекты (ТМД). Формирование и судьба ТМД зависят от условий и способов замораживания, а также структурного состояния белков цитоскелета, которые контролируют прочность ассоциативных связей в мембране, поддерживая тем самым нативную форму и объем клеток. Существует температурная зависимость криоповреждения мембран, которая характеризуется различной степенью нарушения гидрофобных свойств плазматических мембран, что приводит к нарушению барьерных параметров мембраны при неадекватных режимах криоконсервации, аномальному перераспределению ионов по обе стороны мембраны и потере свойств белкового цитоскелета, поддерживающего структуру мембраны (, , 1994). При этом, теряются упруго эластические свойства мембраны, возникают ТМД и клетка может разрушиться. В данной концепции главным является формирование ТМД в плазматической мембране, эволюция которых зависит от степени модификации белкового цитоскелета и липидного бислоя мембраны.

Потеря клетками цитохрома С с последующим снижением биоэнергетических реакций - основной механизм криоповреждения ядерных клеток костного мозга и крови (, , 1976), дрожжей (Mori Y., Suzuki H., Nei T., 1986), гепатоцитов крыс (Petrenko A.Yu, Subbota N.P., 1986). Выход из повреждённых митохондрий цитохрома С, взаимодействующего с цитозольным белком Аpaf-1, обеспечивает переход каспазы 3 (остаток аспарагиновой кислоты) в каталитически активную форму (, 2001), что является одним из пусковых механизмов процесса апоптоза. На клетках яичника китайского хомячка показано (Pritchard D.E. et al., 2000), что проникающая способность митохондрий играет важную роль в регуляции освобождения митохондриального цитохрома С. Это может быть наиболее существенным моментом на пути апоптоза, который приводит клетки к смерти.

Концепция резонансной гидродинамической волны. Помимо повреждений клеток при температурном шоке, вызываемых осмотическими процессами, и (2004) указывают в своей работе на разрушительную силу удара резонансной гидродинамической волны, которая появляется в результате внезапных изменений скорости движения в закрытую полость клетки потока воды и его внезапной остановки напряженной до критического (резонансного) уровня цитоплазматической мембраной, утратившей свойство упругой деформации.

Наряду с указанными концепциями криоповреждений клеток большое внимание в криобиологии и криомедицине уделяется концепциям криообновления (программам реабилитации и перевода клетки на более высокий уровень гомеостаза).

Цитохром С, несомненно, играет ведущую роль в механизме криообновления путём непосредственного включения его во внешнюю и внутреннюю митохондриальные мембраны и взаимодействия с ними (, , 2005). Роль цитохрома С в механизме криообновления обусловлена действием низких температур, которые: регулируют гены, под контролем которых находятся цитохром С и НАД. Н, участвующий в его транспортной функции через наружную митохондриальную мембрану (Storey K.B., 1998); увеличивают концентрацию цитохромов (, В., 1977); усиливают митохондриогенез; лабилизируют клеточные мембраны ( и др., 1981); повышают проницаемость гематоэнцефалического барьера (, , и др., 1995), облегчая тем самым прохождение молекулы цитохрома С, являющегося индуктором пиноцитоза (, 1968), через эти барьеры; изменяют структуру митохондрий, что обеспечивает наиболее благоприятное взаимодействие с ними цитохрома С (Loncar D., Bedrica L., Mayer J. et al., 1986). Способность цитохрома С встраиваться в митохондриальные мембраны и снижать процессы ПОЛ является одним из механизмов его лечебного действия ( В, , 1974; , 1987; , , 1990; , 1990).

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27