При изучении «острой» и «хронической» токсичности, и пирогенности растворов №4, №9, №13 и №20 на лабораторных животных, а также переносимости животными аутотрансфузий, консервированных с растворами клеток, установлено, что все указанные растворы соответствуют требованиям, предъявляемым к трансфузионной среде для внутривенного введения, в том числе и к криозащитной среде (ГФ XII, 2007). При определении «острой» токсичности хладоограждающих растворов все белые мыши по истечении 5 суток остались живы. При выявлении «хронической токсичности» растворов белые мыши и кролики перенесли без осложнений и реакций многократное введение хладоограждающих растворов, что подтверждается данными об их состоянии и гистологическими исследованиями внутренних органов. В эксперименте на пирогенность растворов ни у одного из использованных кроликов не было зафиксировано суммарного изменения температуры тела, превышающего норму (1,4°С). При изучении переносимости собаками аутотрансфузий отогретых клеток без отмывания определенного хладоограждающего раствора установлено, что у животных отсутствуют отклонения от нормы в поведении, изменения температуры и массы тела, в норме также показатели гемограммы и урограммы, частоты дыхания и частоты сердечных сокращений.

Таким образом, хладоограждающие растворы №4, №9, №13 и №20 нетоксичны, апирогенны, благоприятно переносятся животными. Следовательно, их применение в медицинской практике не требует дополнительной трудоемкой и травмирующей клетки процедуры удаления фракций связанного криопротектора из биологической системы после цикла замораживания-отогревания.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые комбинированные криозащитные растворы, содержащие криопротекторы непроникающего, проникающего, смешанного типа действия и реставрирующие компоненты, не требующие отмывания после отогрева биообъекта.

2. В присутствии предложенных комбинированных растворов у лейкоцитов на всех этапах криоконсервирования и при варьировании сроков хранения не происходит активация ПОЛ

3. При –10°С сохранность более 75% лейкоцитов по разным тестам в течение 9 суток обеспечивает незамерзающий криозащитный раствор, содержащий глицерин (в исходной концентрации 7%), желатин со средней молекулярной массой 16 000 (7,5%) и антигипоксант-антиоксидант ОМЭПС (0,3%).

4. Комбинирование в замораживаемой клеточной среде ГМБТОЭМ (28%) с ОМЭПС (0,2%) обеспечивает полноценность лейкоцитов крови человека при –20°С в течение 21 суток.

5. Структурно-функциональные параметры у более 75% лейкоцитов сохраняются в условиях температуры –40°С в течение 30 суток в среде криозащитного раствора, содержащего ГМБТОЭМ (30%), фумарат натрия (2,8%) и лимонную кислоту (0,06%).

6. Сохранность лейкоцитов при –80°С в течение 180 суток обеспечивает криозащитный раствор, содержащий ГМБТОЭМ (22%), ДМСО (8%) и ОМЭПС (0,2 %).

7. Криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ, обладающий выраженной криозащитной активностью в широком диапазоне температур (от –20°С до –80°С) и характеризующийся низкой токсичностью среди подобных веществ, может рассматриваться в качестве универсального протектора.

8. Предложен новый вид непроникающего криопротектора - растительный полисахарид лемнан, который в исходной концентрации 0,3% совместно с глицерином (7%) и ОМЭПС (0,3%) обеспечивает сохранность исходных морфофункциональных параметров у лейкоцитов при –10°С в течение 1 суток.

9. Разработанные комбинированные криозащитные растворы по физико-химическим и биологическим свойствам не токсичны, апирогенны и без осложнений переносятся лабораторными животными в смеси с размороженными аутологичными лейкоцитными концентратами.

10. Способы электрорефрижераторного криоконсервирования ядросодержащих клеток периферической крови в нетоксичных ограждающих растворах при температурах от –10°С до –80°С являются эффективными, доступными для широкого круга учреждений медицинского и биологического профиля и могут быть рекомендованы в качестве альтернативы криоконсервированию биообъектов в жидком азоте.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Предложены доступные способы криоконсервирования лейкоцитов крови человека под защитой комбинированных криозащитных растворов, обеспечивающих высокую сохранность морфологических и функциональных свойств клеток. Рекомендуются в качестве альтернативы замораживанию биообъектов в жидком азоте.

2. Для эффективного консервирования лейкоцитов:

а) при –10°С в течение 7 суток клетки смешивают (1:1) со свежеприготовленным криозащитным раствором, содержащим глицерин (в исходной концентрации 7%), желатин со средней молекулярной массой 16 000 (7,5%) и ОМЭПС (0,3%). Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 1300 руб. Смесь выдерживают 20 мин при комнатной температуре и помещают для охлаждения и последующего хранения в заполненную антифризом (45%-ным этиловым спиртом) и охлажденную до –10°С емкость. Деконсервирование клеток производят покачиванием контейнера в емкости с водой, нагретой до +38°С до температуры биообъекта +2 ÷ +4ºС. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 2-3 мин.

б) при –20°С в течение 21 суток - клетки смешивают (1:1) с криозащитным раствором, содержащем ГМБТОЭМ (28%) и ОМЭПС (0,2%), и выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 900 руб. Биообъект на 10 мин для замораживания помещают в охлажденную до –20°С емкость с 96%-ным этиловым спиртом, после чего переносят в воздушную камеру для последующего хранения. Деконсервирование клеток производят аналогично пункту 2.а. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 40 сек.

в) при –40°С в течение 30 суток - клетки смешивают (1:1) с криозащитным раствором, содержащем ГМБТОЭМ (30%), фумарат натрия (2,8%) и лимонную кислоту (0,06%), выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 300 руб. Для замораживания смесь помещают на 15 мин в охлажденную до –28°С емкость с 96%-ным этиловым спиртом, после чего переносят для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную камеру электрического морозильника на –40°С. Деконсервирование клеток производят аналогично пункту 2.а. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 45 сек.

г) при –80°С в течение 180 суток - клетки смешивают (1:1) со свежеприготовленным криозащитным раствором, включающем в себя ДМСО (8%), ГМБТОЭМ (22%) и ОМЭПС (0,2%). Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 1300 руб. Смесь выдерживают 20 мин при комнатной температуре и помещают для замораживания на 15 мин в охлажденную до –28°С емкость с 96%-ным этиловым спиртом, после чего переносят для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную камеру на –80°С. Деконсервирование клеток производят аналогично пункту 2.а. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 45 сек.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. , Леонтович белых клеток периферической крови для длительного хранения при ультранизких температурах // Проблемы гематологии и переливания крови. 1966. № 9. С. 24-30.

2. Аванов антифризы и механизм их активности // Молекулярная биология. 1990. Т.24. №3. С. 581-597.

3. , , Ермакова гранулоцитов с раствором «лейкокриодмац» // Гематология и трансфузиология. 1986. №12. С. 26-29.

4. , Тибилова растворы для крови и ее компонентов // Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга: Справочник / Под ред. . М.: Медицина, 1997. С. 150-161.

5. , , Ермолович свойства криоконсервированных лейкоцитов и их клиническое применение // Проблемы гематологии и переливания крови. 1982. №4. С. 6-10.

6. Адо фагоцитов. Москва. 1961. С.6-293.

7. Алексеев режим растений в связи с обменом веществ и структурированностью цитоплазмы // Тимирязевские чтения. 1969. Т.28. С.3-36.

8. О молекулярной структуре внутриклеточной воды и ее возможном биологическом значении // Состояние воды и водный режим культурных растений. Москва: Наука. 1971. С.11-23.

9. Алексеев аспекты лейкопений, нейтропений и функциональных нарушений нейтрофилов. СПб.: Фолиант. 20с.

10. , , Салихов водных растворов в присутствии липосом // Биофизика живой клетки. 2000. Т.9. С.20.

11. , Ожовян метод оценки целостности цитоплазматической мембраны клеток эукариот // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2002. Т.134, №7. С. 118-120.

12. , , К механизмам регуляции проницаемости гематоэнцефалогического барьера охлаждённого мозга. Сообщение 1 // Проблемы гематологии. 1995. №1. С.10-19.

13. , , Зубова метод криоконсервирования кордовой крови: оценка популяционного состава ядросодержащих клеток // Проблемы криобиологии. 2008. Т.18, №3. С.348-351.

14. , , Зубова подходы к криоконсервированию и оценки жизнеспособности ядросодержащих клеток кордовой крови // Украинский химиотерапевтический журнал. 2008. №С.85-87.

15. Балашов трансфузии гранулоцитов для лечения тяжелых инфекционных осложнений у пациентов с нейтропенией: Автореф. дис. … канд. мед. наук. Москва, 20с.

16. Барабой стресса и перекисное окисление липидов // Успехи современной биологии. 1991. Т.111, вып. 6. С. 21-28.

17. , , Кудряшов окисление и стресс. СПб.: Наука. 19с.

18. Бауст Дж. Г., Бауст Дж. М., Биосохранение - уменьшение отрицательных последствий консервирования на молекулярном уровне // Проблемы криобиологии. 2008. Т.18,№2. С. 163.

19. , , Гулевский проблемы криобиохимии // Криобиология и криомедицина. Киев. 1975. С. 8-15.

20. Белоус изменения биологических мембран при охлаждении. Киев: Наукова думка. 19с.

21. , , Бабийчук механизм повреждения клетки при термальном шоке, замораживании и постгипертоническом лизисе // Криобиология. 1985. № 2. С. 25-32.

22. , , Биохимия мембран: замораживание и криопротекция. М.: Высш. школа, 19с.

23. , Гулевский свойства биомембран при низких температурах. Киев: Наукова думка. 19с.

24. , Грищенко . Киев: Наукова Думка, 19с.

25. Белоус криобиохимии мембранных структур // Проблемы криобиологии. 1997. №.1-2. С. 19-23.

26. Берсенев и кома как осложнения, связанные с токсичностью криопротектора (ДМСО) при инфузии гемопоэтических клеток в клинике трансплантации костного мозга // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006. №1(3). С.31-32.

27. Биохимия / Под ред. . М.: ГЭОТАР-МЕД., 2003. С. 36-296

28. , , Щетинский насыщения ткани плаценты глицерином и 1,2-пропандиолом // Проблемы криобиологии. 2005. Т.15, №.2. С. 147-152.

29. , О девитрификации в суспензии эритроцитов кордовой крови при охлаждении и нагреве с 1,2-пропандиолом и глицерином // Проблемы криобиологии. 2002. №1. С. 122-123.

30. , , Белоус разных режимов замораживания - оттаивания на хемилюминесценцию митохондрий печени щук // Украинский биохимический журнал. 1975. Т. 47. № 6. С. 746-783.

31. Бондаренко и предупреждение температурного шока эритроцитов: Автореф. дис. … докт. мед. наук. Харьков, 19с.

32. , , Эффекты дегидратации в контроле холодовой и осмотической чувствительности клеток // Проблемы криобиологии. 1992. №4. С. 14-25.

33. , , Жуйкова клеток в неизотонических условиях: дифференцированный подход к механизмам структурных нарушений и адаптации // Проблемы криобиологии. 2008. Т.18, №2. С.209.

34. Буряк криоповреждений дрожжей флуоресцентными методами // Проблемы криобиологии. 2007. Т.17, №2. С.197.

35. , Маянский реакции восстановления нитросинего тетразолия для оценки функционального состояния нейтрофилов человека // Казан. мед. журн. 1997. Т. 55, №5. С.99-100.

36. Вильянинов консервирование эритроцитов под защитой комбинированного криопротектора на основе пропиленгликоля и диметилацетамида: Автореф. дис….канд. мед. наук. Санкт-Петербург, 19с.

37. Виноград–, Киселев проблемы замораживания крови // Проблемы гематологии и переливания крови. 1970. №4. С. 3-4.

38. Виноград-, , . , Обшивалова эритроцитов и их функциональная полноценность // Проблемы гематологии и переливания крови, 1973. Т.18, №9. С.3-10.

39. Владимиров , сопровождающее биохимические реакции // Соросовский образовательный журнал. 1999. №6. С.25-32.

40. Воротилин эритроцитов человека под защитой криопротекторов на основе низкомолекулярных диолов: Автореф. дис….докт. биол. наук. Харьков, 19с.

41. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода "Ускоренного старения" при повышенной температуре: И: утв. М-вом мед. пром-сти, М-вом здравоохранения СССР в 1982 г. М.: 19с.

42. , , Кощий колебаний температуры хранения на жизнеспособность консервированных клеток про- и эукариот // Проблемы криобиологии. 2005. Т.15, №.1. С. 33-41.

43. , , Бояринцев реакции перекисного окисления липидов и физиологические процессы антиоксидантной защиты организма плотоядных. Киров: ВГСХА. 2001. с.37.

44. Галеева , лечение и прогноз бронхитов у детей раннего возраста на основе ХЛ нейтрофилов крови: Автореф. дис … канд. мед. наук. Москва, 20с.

45. , . Карелин исследования подвижности нейтрофилов // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. №1. С. 22-33.

46. , Игнатов неравнозначность нейтрофилов крови человека: генетика активных форм кислорода // Цитология. 2001. Том 43, №5. С. 432-436.

47. , Калуцкая реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами крови человека // Цитология. 2000. Том 42, №2. С. 160-165.

48. Медико–биологическая статистика. Москва: Практика, 19с.

49. , , Шахов культуры ткани в гематологии. Томск: Изд-во Томского гос. ун-та, 19с.

50. , Горбачевский современных препаратов гидроксиэтилированного крахмала в ряду плазмозамещающих инфузионных растворов // Вестник службы крови России. 1998. №3. С. 41.

51. , Браузе тест для определения иммунологической совместимости тканей // Вестник хирургии. 1966. №6. С. 69-73.

52. , , Кожина криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека // Проблемы криобиологии. 2010. Т.20, №1. С. 66-72.

53. , Кудокоцева функционального состояния митохондрий в клеточных суспензиях, экспонированных в растворе криопротектора // Криобиология и криомедицина. 1980. Вып. 7. С. 32-34.

54. , Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий. Киев: Наук. думка, 19c.

55. , , Гаташ режимов замораживания на диэлектрические свойства сыворотки кордовой крови // Проблемы криобиологии. 2004. №2. С. 4-10.

56. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. М.: Медицина, 19с.

57. Государственная Фармакопея Российской Федерации. 12-е изд., ч.1 - М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 20с.

58. , Алексеевская механизмы мембранного транспорта белков: перенос цитохрома С через митохондриальные мембраны и его роль в механизме криообновления // Проблемы криобиологии. 2005. Т15, №1. С. 42-49.

59. Токсическая гибель клетки: свободнорадикальное повреждение ДНК и апоптоз // Лікування тадіагностика. 2001. №4. С.8-13.

60. . , Белоус свойства биомембран при низких температурах. Киев: Наукова думка. 19с.

61. , Релина шапероны и холодовая адаптация организмов // Проблемы криобиологии. 2003. №1. С. 26-37.

62. К, Релина белки. Сообщение I. Классификация и механизм действия // Проблемы криобиологии. 2009. Т.19, №1. С.18-24.

63. , Релина белки. Сообщение II. Распространение в природе // Проблемы криобиологии. 2009. Т.19, №2. С.121-236.

64. , Релина белки. Сообщение II. Регуляция, происхождение, стабильность и применение // Проблемы криобиологии. 2009. Т.19, №3. С.273-282.

65. , И Белки-нуклеаторы бактериального происхождения. Сообщение I. Общая характеристика и классификация // Проблемы криобиологии. 2010. Т.20, №1. С. 18-24.

66. Гурвич излучение. М.: Госмедиздат. 19с.

67. , Федорова лейкоцитов из крови доноров для экспериментальных и клинических целей // Проблемы гематологии и переливания крови. 1963. №4. С. 52-55.

68. , Верховская влияния 1,2-пропандиола на свертывающую систему крови и целостный организм // Научно-технический прогресс в медицине и фундаментальные проблемы биологии: Тез. докл. обл. научно-практич. конф. (сентябрь 1987). Харьков. 1987. С.18-19.

69. Деветьярова активность лейкоцитов, перенесших криоанабиоз при –20°С: Автореф. дис. … канд. биол. наук. Киров, 20с.

70. Диллер и моделирование осмотического поведения клеток при замораживании // Криобиология. 1990. №1. С.11-17.

71. Добрецов зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. Москва: Наука. 19с.

72. , , Смирнов в профилактике и терапии патологий ЦНС. М., 19с.

73. , сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение в комплексной диагностике. Москва. Медицина. 1975. С. 5-51.

74. , , Щетинский ДМСО на фазовые переходы и стеклование в суспензии эритроцитов кордовой крови ниже 0°С // Проблемы криобиологии. 2003. №2. С. 16-21.

75. , , О возможных факторах повреждения биологических объектов и их ДНК при криоконсервации // Цитология. 2004. Т. 46, №9. С. 796.

76. Иткин некоторых биофизических процессов, происходящих в клетках костного мозга при замораживании: Автореф. дис. … канд. мед. наук. Харьков, 19с.

77. , , Бронштейн -математический анализ механизмов криоповреждения и криозащиты клеток // Актуальные проблемы криобиологии. Киев: Наукова Думка. 1981. С.300-344.

78. , , Марценюк : факторы, механизмы и гипотезы криоповреждения биологический суспензий // Консервирование клеточных суспензий. Киев: Наукова Думка, 1983. С. 26-34.

79. Ишков исследование процесса замораживания клеточных суспензий в градиенте температуры: Автореф. дис. … канд. биол. наук. Харьков, 19с.

80. , Горбунова гетерозидов - эффективные добавки к криозащитным средам // Проблемы криобиологии. 2004. №2. С. 28-35.

81. Калинин и применение концентрата тромбоцитов и лейкоцитов // Проблемы гематологии и переливания крови. 1980. №10. С. 50-56.

82. , Гахова концентрация глюкозы в гемолимфе адаптированного к зиме озерного бокоплава // Биофизика живой клетки. 2003. Т.7. С. 38-41.

83. , , О возможных криопротекторах пресноводной рыбы Dallia pectoralis // Биофизика живой клетки. 2003. Т.7. С. 34-37.

84. Кичигин функционального состояния лейкоцитов по количеству ореолообразующих клеток крови // Научные доклады Коми НЦ УрО РАН. Сыктывкар. 19с.

85. , , Владимиров свойства производных 3-оксипиридина: мексидола, эмоксипина и проксипина // Вопросы медицинской химии. 2001. Т47. №3. С.288-300.

86. , , . Полярографическое определение кислорода в организме. Москва: Медицина. 1975. С.132-136.

87. , , Кощий многоатомных спиртов и их метоксипроизводных через мембраны эритроцитов крысы и кролика // Проблемы криобиологии. 2009. Т.19, №4. С. 413-420.

88. , Бондаренко использования комбинированных криопротекторов при замораживании компонентов крови одноступенчатым способом при температуре –196°С // Проблемы криобиологии. 2008. Т.18, №2. С.248.

89. Костяев консервирование гемопоэтических стволовых клеток при –80°С в режиме быстрого двухступенчатого замораживания: Автореф. дис….докт. мед. наук. СПб, 20с.

90. , Цитохром С-фосфолипидный комплекс (получение и изучение в эксперименте) Цитохром С и его клиническое применение. // Сб. науч. трудов НИИ гематологии и переливания крови. Л.,1990. С.74-78.

91. Кузнецов тромбоцитов замораживанием при –80°С по экспоненциальной программе: Автореф. дис….канд. мед. наук. СПб, 20с.

92. Кулешова льдообразования в живых клетках и модельных системах: Автореф. дис. … канд. биол. наук. Харьков, 19с.

93. , Розанов структуры внеклеточного льда в процессе криоповреждения клеток // Моделирование криобиологических процессов: Сб. науч. Тр. Харьков, 1988. С. 25-34.

94. Лаврик поливинилпирролидона в качестве защитной среды для консервирования костного мозга глубоким замораживанием // Врачебное дело. 1966. №32. С.63-68.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27