Одним из общих свойств клеток всех типов живых организмов является то, что в ответ на снижение температуры они включают синтез специфического набора белков, которые помогают клетке выжить в условиях температурного стресса и вернуться после его прекращения к нормальной жизни (, 2003; Siegenthaler R.K., Christen P., 2005). Установлено, что недостаток кислорода, повышение концентрации тяжелых металлов и этанола (Miller D., 1989), а также низкие температуры (Lee R. E., 1990) могут индуцировать синтез этих белков. Показана также активация апопотоза после криоконсервирования (Borderie V., Lopez M., Lombet A. et al., 1998). В частности, через 6-18 ч после оттаивания в культивированных фибробластах человека (Baust J., Van Buskirk R., Baust G., 2000) увеличивалась транскрипция вовлеченных в апоптоз ферментов (каспаз), что предполагает возможность участия апоптоза в уничтожении сублетально поврежденных клеток.

В настоящее время большой интерес вызывает изучение белков, индуцируемых теплом (белков теплового шока - БТШ) (Pennell C.A., 2005; Srivastava P.K., 2005) или холодом (белки холодового шока – БХШ) (, , 2003).

Считают, что молекулярные шапероны обеспечивают ренатурацию белков после стрессового воздействия и убиквитин-зависимый протеолиз белков, не подлежащих ренатурации. Две группы белков, с молекулярной массой 70 и 90 кДа (БТШ-70 и БТШ-90) являются одними из самых консервативных белков в природе (Lindguist S., 1986). Экзогенный БТШ-70 обладает защитными и антисептическими свойствами (, , 2010). БТШ-70 блокирует агрегацию денатурированных белков, связываясь с гидрофобными областями, которые становятся доступными при денатурации, и ускоряет АТФ-зависимую ренатурацию белков. Во время нормальных физиологических процессов молекулярные шапероны принимают участие в транспортировке белков сквозь мембраны, особенно сквозь мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и митохондрий, помогают полипептидам сворачиваться и облегчают сборку белковых комплексов (Miller D., 1989).

Представители семейства белков холодового шока (БХШ) обнаружены у многих эубактерий. Полагают, что белки действуют, как РНК-шапероны, препятствуя сворачиванию РНК во вторичную структуру (Wouters J. A., Rombouts F. M., Kuipers O. P. et al., 2000). Они участвуют в различных клеточных процессах, включая адаптацию к низким температурам, рост клеток, стационарную фазу и др. В БХШ открыт домен – домен холодового шока, который обнаруживает удивительно высокую гомологию и сходные РНК-связывающие свойства со все более многочисленным рядом эукариотических белков, способных связывать нуклеиновые кислоты, что указывает на древнее происхождение этих белков (Graumann P. L., Marahiel M. A., 1998).

В настоящее время выделено три класса белков, контролирующих процессы нуклеации и рекристаллизации (, , 2009): белки-нуклеары – индуцируют кристаллизацию, являясь матрицей формирования льда, и препятствуют переохлаждению (обнаружены у бактерий, насекомых, лягушек и черепах); антинуклеирующие белки – ингибируют формирование зародышевых кристаллов льда при гетерогенной нуклеации (обнаружены у бактерий); антифризные белки (АФП; новый термин – белки, структурирующие лед) снижают температуру замерзания, модифицируют или останавливают рост кристаллов льда, ингибируют рекристаллизацию и защищают клеточные мембраны от повреждений. Антифризные протеины (АФП) найдены у позвоночных, беспозвоночных, у растений, бактерий и грибов (Barrett J., 2001).

АФП по степени активности делятся на три группы: очень слабые – их основная функция ингибирование рекриталлизации, вследствие их чрезвычайно слабой термогистерезисной активности (представители – белок паслена горько-сладкого, белок многолетнего плевела); умеренно-активные – блокируют рост кристаллов за пределами базальных поверхностей (Scotter A.J., Marshall C.B., 2006); к ним относится большинство известных антифризных пектинов и гликопротеидов рыб (, 1990), бактерий; гиперактивные – предотвращают рост кристаллов льда на базальной поверхности (белок плазмы крови камбалы массой 16,7 кДа).

Накопленные сведения (, , 2009) пока не позволяют сформировать гипотезу о едином механизме действия антифризных пектинов и гликопротеидов. Можно перечислить лишь те признаки, по которым эти вещества были выделены в отдельную группу. Биологические антифризы понижают температуру замерзания неколлигативно, т. е. функция зависимости снижения температуры замерзания их растворов от их концентрации не прямая, а подобна гиперболе с плато в области высоких концентраций АФП, что свидетельствует об эффективности насыщения. При этом АФП понижают температуру замерзания растворов в несколько сотен раз эффективнее, чем другие макромолекулы сопоставимых размеров. Понижая температуру замерзания антифризы практически не влияют на температуру плавления, в результате равновесие между твердой и жидкой фазами антифризных систем отсутствует. Молекулы АПФ не концентрируются в жидкой фазе при замерзании растворов, они равномерно распределяются между твердой и жидкой фазами, молекулы АПФ адсорбируются на поверхности зародышевых кристаллов льда в виде монослоя и блокируют дальнейший рост кристалла.

Накопленный за последние 10 лет опыт, свидетельствует о том (, , 2009), что эффект АФП на жизнеспособность клеток и термодинамических свойств среди растворов во время низкотемпературного консервирования сложен и противоречив. АФП могут проявлять и защитное и цитотоксическое действие в зависимости от протокола хранения, дозы и типа АФП, состава консервирующей среды, типа биоматериала (Wang J.H., Bian H.W., Zhang Y.X et al., 2001). При достижении интенсивности взаимодействий комплексов АФП-лед с клеточными мембранами и другими молекулярными комплексами определенного уровня, указанные комплексы могут агрегировать, теряя способность ингибировать рекристаллизацию (Wang J.H., 2000). Наряду с природными АФП создаются их синтетические аналоги, например, АФП камбалы (Chakrabartii A., Yang D.S., Hew C.L., 1989), которые применяют для исследования механизмов действия биологических антифризов. Предпринята попытка использования АФП при хранении сердца при –1,3°С (Amir G., Horowitz L., Rubinsky B. et al., 2004), при этом в присутствии АФП орган не замерзал и имел лучшие показатели деятельности (скорость сокращения, коронарный ток и давление). В настоящее время изучение биологических антифризов продолжается.

1.2 Криопротекторы и криоконсерванты

Криопротекторы – вещества, обладающие способностью предупреждать развитие криоповреждений биологических объектов и обеспечивать их сохранность в жизнеспособном состоянии после замораживания. К таким веществам относятся (, , 1994) различные классы соединений: спирты, оксиды, аминоксилоты, амиды кислот, углеводы, белки, полимерные соединения. Коллигативные криопротекторы природного происхождения представляют собой низкомолекулярные соединения, содержащие гидроксильные группы. К ним относятся, например, полигидрооксиспирты (глицерин, инозитол, сорбитол, маннитол, рибитол и др.), сахара (глюкоза, фруктоза, арабиноза, манноза, трегалоза и др.) и другие (, 2003).

Несмотря на то, что криопротекторы являются предметом исследований на мировом уровне более 50 лет, механизмы их действия и взаимодействия с различными биологическими структурами окончательно не выяснены (, 2009). Выделяют следующие механизмы: подавление возрастания концентрации солей в растворах (Moiseyev V.A., Nardid O.A., Belous A.M., 1982), снижение повреждения клеток и клеточных мембран при дегидратации (, , 1994), уменьшение количества кристаллов образовавшегося льда внутри клетки (, , 1994) и другие (Бауст Дж. Г., Бауст Дж. М., и др., 2008).

Криопротекторы, по предложению J. E. Lovelock (1954), разделяются на экзоцеллюлярные (непроникающие в клетку) и эндоцеллюлярные (способные проникать в клетку). Позднее (1978) предложил еще хладоограждающие растворы смешанного типа.

К проникающим в клетку относятся: гицерин, диметилсульфоксид – ДМСО (, , ., 1978; Makino M., Baba M. A, 1997), диметилацетамид – ДМАЦ (, , 1977), 1,2-пропандиол – 1,2-ПД.

Непроникающие криопротекторы: поливинилпирролидон – ПВП (, , 1971), полиэтиленоксид – ПЭО-1500 и с более высокой молекулярной массой (, , 1974).

К криопротекторам смешанного действия относятся ПЭО-400 (, , 1978; , , 1994), ГМБТОЭМ (, 1995 – 2005), которые обезвоживают клетки, обволакивают их мембраны и могут в небольшом количестве проникать в клетки.

Защитное действие внутриклеточных криофилактиков выражается в том, что, обладая низкой молекулярной массой, эти вещества легко проникают в клетку, связывают воду, способствуют переохлаждению клеток, изменяют кристаллообразование, стимулируя образование преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании. Кроме того, являясь хорошими растворителями, они снижают концентрацию солей внутри и вне клеток, этим самым, предохраняя их от обезвоживания и уменьшая повреждение белковых структур клеток (, 1983; , , 1987). Также эти вещества образуют связи со структурными компонентами мембраны клеток, что ведет к снижению степени ее повреждения при замораживании (Виноград – , , 1970; , , 2004; Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. et al., 1976).

Механизм действия экзоцеллюлярных криопротекторов основан на их способности образовывать прочные связи с внеклеточной водой, вызывать дегидротацию клеток, замедлять скорость образования кристаллов и изменять их структуру, взаимодействовать с клеточной мембраной, следствием чего является повышение ее устойчивости к повреждающему действию кристаллов (, 1983; Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. et al., 1976). Однако применение непроникающих криопротекторов связано с трудностями выбора условий эквилибрации: температуры, скорости введения криопротектора, его концентрации и др. (Mazur P., Cole K.W., 1989; Dutheil D., Underhaung G., Petit-Paris I. et al., 2009).

Всего в мире обнаружено и создано более 120 криофилактических соединений, однако выраженными криопротекторными свойствами обладаю всего 6: глицерин, ДМСО, ДМАЦ, 1.2-ПД, вещество А-378 или ГМБТОЭМ и ПЭО-400. Слабее указанные свойства у ПВП. Самые слабые у многоатомных спиртов, сахаров, гидроксиэтилкрахмала, сывороточных белков и других органических соединений. К сожалению, у всех названных выше криопротекторов выявлено свойство оказывать токсическое действие на клетки. Так, например, ЛД50 при внутривенном введении ГМБТОЭМ для мышей составляет 15,5±0,6 г/кг массы тела животного (м. т.) ( и др., 1987; 1999). 1,2-ПД ЛД50 для мышей – 15-18 г/кг м. т. ( и др., 1984, 1987). Летальная доза ПВП для мышей при внутривенном введении 25% раствора препарата составляет от 12 до 15 г/кг м. т. (, 1975, 1979; и др., 1978, 1981). ЛД50 глицерина составляет 4,57±0,14 к/кг м. т. (Andersen K. C. et al., 1950), ЛД50 ДМСО – 3,8±0,1 г/кг м. т. (Ashwood-Smith M. G., 1961), для ПЭО-400 ЛД50=12,5 г/кг м. т. ( и др., 1978), для ДМАЦ ЛД50=4,2 г/кг м. т. ( и др., 1983).

В настоящее время к криопротекторам предъявляют следующие требования (, 2010): эффективный криозащитный эффект; хорошо растворяться в воде и стабилизировать ее молекулы; способствовать образованию мелких кристаллов льда и стеклованию вне - и внутриклеточной воды; участвовать в процессах метаболизма; должен быть нетоксичным (не требующим отмывания от размороженного биообъекта); не накапливаться в организме и быстро выводится из него; не разрушать клеточные мембраны и органеллы; не приводить к развитию побочных эффектов при гемотрансфузиях и др.

Ниже приведена краткая характеристика наиболее часто применяемых криопротекторов.

Глицерин – многоатомный спирт с молекулярной массой 92,1. C3H8O3. Чаще всего для замораживания используют 15% раствор. К положительным эффектам глицерина относят ( и др., 1978; и др., 1981) его способность уменьшать размер кристалла льда, так как способность глицерина сжиматься при замерзании способствует тому, что превращение воды в лед не сопровождается увеличением его объема. При этом идет образование мелкокристаллического льда с переходом в стеклование. Защитные свойства глицерина связаны также с его способностью поддерживать переохлажденное состояние клетки, поскольку его молекулы образуют стабильные водородные связи с водой. При обычных температурах (22-37°С) глицерин легко проникает в клетки и защищает мембрану и внутриклеточные структуры, действуя как противосолевой буфер. Кроме того, глицерин уравнивает осмотическое давление по обе стороны мембраны, то есть предупреждает развитие осмотических градиентов на мембране. А также он формирует комплексы с солями и металлами и с активными центрами ферментов, вызывая временную блокаду функциональной активности ряда ферментных систем в клетке. Образует гидратную и частично из молекул глицерина защитную оболочку вокруг молекул белков, что предотвращает их коагуляцию.

Однако при действии глицерина на ядросодержащие клетки было замечено набухание митохондрий, отрыв внутренних мембран и их частичный лизис, а иногда появление «вуали» и сглаживание структуры ядра ( и др., 1966). Существует мнение, что глицерин не обеспечивает полноценной криозащиты лейкоцитов, вызывает их необратимую агрегацию и лизис, требует применения отмывающих растворов ( и др., 1995). В связи с токсичностью глицерина, для его удаления из клеток используют разнообразные методы: диализ, отмывание гипертоническими растворами глюкозы, хлорида натрия и цитрата, непрерывное отмывание и центрифугирование, разведение или осаждение декстраном, агломерацию с неэлектролитами или дисагрегацию в солевых растворах. В процессе отмывания глицерина в клетках возникают дополнительные повреждения, которые устраняют с помощью различных реабилитационных средств.

В настоящее время глицерин широко используется в качестве моноэндоцеллюлярного криоконсерванта для эритроцитов при –196°С ( и др., 2005), в диапазоне от –60°С до –80°С (Виноград-, , и др., 1973), от –25°С до –38°С (, , 1995), а также для консервирования клеток косного мозга при –70°С (, 1967).

Диметилсульфоксид (ДМСО). Соединение относится к классу оксидов, молекулярная масса которого 78,13. C2H6SO. Представляет собой бесцветную, прозрачную жидкость с неприятным специфическим запахом и горьковатым вкусом, разлагается на открытом воздухе и при автоклавировании. ДМСО хорошо проникающий в клетки, реорганизует структуру образующегося льда - происходит мелкоячеистая кристаллизация, близкая по своей природе к аморфной (, , 1966; 1985; , 1993; Takahashi T., Hirsh A., 1985; Tsvetkov T. et al., 1986; Makino M., Baba M., 1997). Силы взаимодействия между молекулами ДМСО и воды в 1,5 раза больше, чем между молекулами воды ( и др., 1978). Однако, при исследовании фазовых переходов и стеклования в бинарных водных растворах ДМСО и в клеточных суспензиях эритроцитов кордовой крови с добавками ДМСО установлено (, , 2003), что в системах, содержащих ДМСО, в отличие от систем с криопротекторами из ряда полиолов наблюдается кристаллизация эвтектических составов. Это явление, наряду с девитрификацией, может представлять собой дополнительный криоповреждающий фактор. ДМСО обладает высокой способностью вступать в реакции с солями и оксидами фосфата, серы, формировать связи с глицерином, сахарозой, мочевиной, стеариновой кислотой и другими органическими соединениями. Известны противоишемическое и антиоксидантное свойства ДМСО (, 1989). Однако ДМСО является токсичным (Klein E. et al., 1967) и обуславливает необходимость его удаления после размораживания, что существенно усложняет процедуру получения качественных деконсервированных клеток и приводит к потере части клеток в процессе отмывания. В РФ ДМСО под названием «Димексид» разрешен до 2003 г только для наружного применения (, 2002). Для консервирования тромбоцитов при –196°С ДМСО применяется в концентрации 5-11% (Djurassi J., Roy A., Kim J., Cavins J., 1971), при этом, сохранность клеток составляет 30-80%. Однако при переливании размороженных тромбоцитов у 33% реципиентов наблюдались озноб и лихорадка, а само переливание сопровождалось резким запахом ДМСО (, , и др., 1991). Для консервирования лейкоцитов при –196°С ДМСО применяется в концентрации 6-15%, при этом, лимфоциты переносили замораживание удовлетворительно (Rowe A., Cohen E., 1965), а в мембранах гранулоцитов наблюдались сильные нарушения (Crowley J.R., Rene A., Valery R.C., 1974). Применяется ДМСО и для криоконсервирования ядросодержащих клеток кордовой крови (Laroche V., McKenna D., Moroff G. et al., 2005). Например (, , 2008), применение 4-х этапной программы замораживания и ДМСО в конечной концентрации 3,5% (приготовленного на растворе полиглюкин) способствует сохранности до 95% жизнеспособных клеток.

Диметилацетамид (ДМАЦ) относится к классу амидов, молекулярная масса 87. C4H9NO. В отличие от глицерина и ДМСО и ряда других криопротекторов, способность которых образовывать водородные связи (в частности с водой) связана с атомом кислорода, в молекуле ДМАЦ водородным акцептором является атом азота. При сравнении эффективности 3-х криофилактиков проникающего действия - глицерина, ДМСО и ДМАЦ оказалось, что последний обеспечивает лучшую морфофункциональную полноценность размороженных гранулоцитов. Например ( и др., 1977, 1981; и др., 1982, 1986), при консервировании лейкоцитов с криозащитным раствором «лейкокриодмац» (содержащим 6,7% ДМАЦ в конечной концентрации) через 2 года хранения при (–196°С) сохранность лейкоцитов составляет 78%. Кроме того, ДМАЦ химически стоек, менее токсичен и лишен свойственного ДМСО неприятного запаха. Применяется ДМАЦ в конечной концентрации 3% для криоконсервирования (–196°С) костного мозга (, 1996).

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27