Пропиленгликоль (1,2-ПД). Эндоцеллюлярный криопротектор с м. м. 76. C3H8O2. Впервые описан в 1987 г (, 1987). Являясь двухатомным спиртом, легко проникает в клетки и за счет своих функциональных групп (-ОН; СН3+-) связывает фракции свободной и связанной воды, тем самым снижает эвтектическую температуру замерзания и способствует формированию мелкозернистых кристаллов льда. Кроме того, он связывает и соли, защищая мембраны от гиперосмотического шока. Обнаружен в мозге крыс, мышечной ткани кролика. В организме подвергается распаду до лактата. Обладает слабым антиоксидантным и антибактериальным свойствами. Используется (, 1997; и др., 2005) для консервирование эритроцитов при –80ºС и –140°С в конечной концентрации 18,5%-й раствор ПД в смеси с 5%-м ДМАЦ; или в концентрации 7% при криоконсервировании репродуктивных клеток животных (, , 1994). Применяется также как основа гидрофобных мазей, растворитель лекарственных средств.
Гексометиленбистетрагидроксиэтилмочевина (ГМБТОЭМ или вещество А-378) - криопротектор смешанного действия (, 1987, 2010). Молекулярная масса 378. (НОСН2СН2)2NСОNН(СН2)6 NНСОN(СН2 СН2ОН)2. Представляет собой мелкокристаллическое вещество белого цвета без запаха, горьковато-сладковатого вкуса, хорошо растворимое в воде, а при нагревании – в метаноле, этаноле, хлороформе, четыреххлористом углероде. Температура плавления +89° ¸ +91°С. Водные растворы ГМБТОЭМ (10-40%) прозрачны, имеют рН=7,8-7,9. Обладает выраженным хладоограждающим действием, образует прочные связи с внеклеточной водой, замедляет скорость образования кристаллов и изменяет их структуру. Точка эвтектики 15-25% водных растворов составляет –8,1°. Взаимодействует с мембраной клеток, следствием чего является повышение ее устойчивости к повреждающему действию кристаллов, тем самым, проявляя экзоцеллюлярное воздействие. Так же он оказывает и эндоцеллюлярное воздействие: проникает в клетку, связывает воду, способствует образованию преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании, снижает концентрацию солей внутри и вне клеток, предохраняя их от чрезмерного обезвоживания и уменьшая повреждение белковых структур клеток, образует связи со структурными компонентами мембраны клеток, что ведет к снижению степени ее повреждения при замораживании. Впервые вещество синтезировано в 1974 году в Казанском химико-технологическом институте ( и соавт.) и после открытия у него криопротекторных свойств в 1982 году новым способом в бидистиллированной воде. На основе данного протектора разработаны эффективные мало токсичные консервирующие растворы, позволяющие сохранять в жизнеспособном состоянии ядросодержащие клетки костного мозга при –196°С в криоконсерванте «гекмолит» (Svedentsov E.P., Archireyev V.P., Simkin D.S et al., 1997), тромбоцитов при –196°С в растворе «кримолит» (, 1996), при –80°С - в «кримолит-М» (, 2006) в течение 12 мес (срок наблюдения), при –40°С - в «кримолит-Ф» (, 2007) 4 мес, а также лейкоцитов при –80°С в растворе ГМБТОЭМ с конечной концентрацией 15% (, 2005) в течение 12 мес (срок наблюдения).
Полиэтиленоксид (ПЭО) – искусственное полимерное соединение с молекулярным весом от 400 до 15000. HOCH2-(CH2-CH2-O-)n-CH2-OH. Криозащитный эффект ПЭО заключается в его способности стабилизировать молекулы воды, кроме того, он может способствовать сохранению структуры биополимеров мембран в процессе замораживания – оттаивания, а также изменять характер кристаллизации водного раствора с образованием аморфного льда ( и др., 1975; и др., 1978). В отличие от ранее применявшихся криофилактиков, ПЭО - это биологически инертное вещество, не требующее отмывания. В настоящее время ( и др., 2008) разработан эффективный безотмывочный метод криоконсервирования (–196°С) ядросодержащих клеток кордовой крови, в том числе и гемопоэтических, с использованием 30% раствора ПЭО-1500, приготовленном на физиологическом растворе. Данный метод обеспечивает высокую сохранность и жизнеспособность (в том числе по ДНК красителю 7ААD) после криоконсервирования популяции лимфоцитов, моноцитов, а также гемопоэтических (CD34+) клеток. Низкомолекулярные ПЭГ и ПЭО с молекулярной массой 300-600 и их производные применяются в качестве синтетической основы для мазей, таблеток, солюбилизаторов и стабилизаторов суспензий и эмульсий.
Поливинилпирролидон (ПВП) – относится к классу искусственных полимеров. Растворы ПВП обладают высокими адсорбционными свойствами к воде и различным веществам, способностью комплексообразования по отношению к лекарственным препаратам, токсинам, красителям и солям. Поэтому ПВП в составе с различными препаратами, особенно антибиотиками и гормонами, способствует их пролонгированному действию в организме. В медицинской практике препараты ПВП используют в качестве плазмозаменителя (, 1999). Механизм криозащитного действия ПВП связан с его коллигативными свойствами и способностью влиять на структуру воды, в результате чего формируется аморфный лед. Растворы ПВП в довольно низкой концентрации в большей степени, чем другие криопротекторы – полиэтиленгликоль (ПЭГ), ДМСО, сахароза тормозят формирование кристаллов льда в системе вплоть до –20°С. Опыты показали, что в качестве криопротектора эффективнее всего применять водный раствор ПВП с м. м. 12600 (, 1966). Однако по данным рассеяния света в растворах ПВП, даже при очень низких концентрациях полимера существует агрегация, что затрудняет определение его точной молекулярной массы ( 1985). В настоящее время ПВП используется для криоконсервирования (от –80°С до –196°С) ГСК кордовой крови ( и др., 1998), замороженная взвесь гемопоэтических стволовых клеток в 17% (исходная концентрация) низкомолекулярном ПВП может храниться при –196°С в течение 10 лет без снижения жизнеспособности.
Гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) - соединение, получаемое в результате оксиэтилирования водорастворимой фракции крахмала, представляет собой полидисперсную систему, охватывающую довольно широкий диапазон фракций с молекулярной массой 250—500 кД. Растворы ГЭК так же, как и ПВП и ПЭО, формируют водородные связи с водой и стабилизируют ее решетку. При этом, структурированность воды изменяется, и в процессе замораживания повышается способность ее молекул формировать аморфные кристаллы льда. Растворы ГЭК также оказывают стабилизирующее влияние на плазматическую мембрану клеток, однако механизм этого взаимодействия остается неисследованным. ГЭК считается биологически инертным препаратом, поэтому его используют в качестве плазмозаменителя или разделителя форменных элементов крови. В РФ используется как трансфузионная среда (6% и 10% растворы с ММ 200000). В качестве криопротектора ГЭК используется в 6% конечной концентрации совместно с 5% ДМСО для консервирования эритроцитов и ядерных клеток кордовой крови при –196ºС (Stiff P.J., Murgo J.A., Zarolus C.G., 1987). ГЭК не токсичен, поэтому не требует отмывания после отогрева биообъекта. Вопрос о криопротекторных свойствах ГЭК окончательно не решен, так как результаты криоконсервирования клеток под защитой этого полимера весьма противоречивы. Необходимо дальнейшее изучение его криопротекторных свойств.
В настоящее время перспективным направлением является (, , 2008) применения комбинированных хладоограждающих растворов, состав которых по причине видоспецифичности биологического материала вариабелен: экзо - и эндоцеллюлярные протекторы, а также антиоксиданты и стабилизаторы биологических мембран (витамин Е, глутатион восстановленный, сывороточный альбумин и др.), усиливающим устойчивость клетки к эндо - и экзогенным факторам физико-химического воздействия (Dalvit G.C., Cetica P.D., Beconi M.T., 1988; Carrol J., Wood M.J., Whittinham D.G., 1993). В состав консервантов часто вводят сахара: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, рафинозу и их комбинации. Сахара являются соединениями, регулирующими осмотические и метаболические процессы в клетках, способствуя тем самым более эффективной репарации нарушенных структур клеток крови в цикле замораживания – отогрева. Кроме того, в раствор для замораживания вводится какой – либо антикоагулянт (например, ЭДТА Nа2, цитрат натрия и др.), так как при хранении in vitro клетки приобретают способность образовывать необратимые агломераты. В состав консервантов часто вводят предшественников нуклеиновых кислот (инозин, аденин) в комбинации с фосфатами и глюкозой, которые служат веществами, также способствующими активации восстановительных процессов, присутствуют такие вещества, как антиоксиданты и антигипоксанты.
Для сохранности и восстановления активности энергопродуцирующих ферментов (сукцинат-, малат-, лактатдегидрогеназа) в условиях криоконсервирования клеток (+4°С; сперматозоиды быка) в состав консервирующих сред рекомендованы (, , 2004) добавки - гетерозиды (К321 или 7-метил-N-малеогетерозид; К322 – N-малеогетерозид), которые обладают криопротекторным действием и являются активаторами энергетического метаболизма клетки.
Показана целесообразность использования в качестве дополнительных компонентов криозащитных составов веществ биологического происхождения. В частности, и др. (2008) предлагают использовать для замораживания биообъектов наряду с классическими криопротекторами антифризные протеины и гликопротеины из крови полярных рыб, а также липиды замораживаемого организма. Последние, кроме того, что активно влияют на форму и размеры микрочастиц льда, могут также участвовать в репарации поврежденных при замораживании – отогреве клеточных мембран.
Новым направлением в криобиологии является комбинирование криопротекторов и наночастиц ферромагнетика (ФМ) – Fe3O4. Например (, , 2008), показано, что в присутствии частиц ФМ (50-100 нм) повышается температура кристаллизации сахарозной среды, содержащей 10% ДМСО на 1,7°С в сравнении со средой без ФМ, т. е частицы ФМ становятся центрами нуклеации, вследствие чего снижается степень переохлаждения растворов. Кроме того, связывание наночастиц ФМ с клеточной мембраной и внутриклеточными структурами способствует повышению чувствительности к магнитным и электрическим полям. В следствии способности нагреваться под влиянием электромагнитного излучения присутствие наночастиц ФМ в клеточных суспензиях открывает перспективу разработки не только контролируемых методов замораживания, но и отогрева.
Малоизученным до настоящего времени является применение клатратных соединений азота, кислорода, аргона, криптона, ксенона, а также некоторых клатратов смешанного типа в качестве газовых клатратных криопротекторов. Эффективность замораживания (–196°С) биологических объектов (сперматозоиды, кровь, сердце крысы) в барокамере-капсуле при давлении и в тяжелых инертных газах была показана в исследованиях П. В Щербакова и (2006). Подтверждено защитное действие клатратного ксенона при криоконсервировании (–196°С) кардиомиоцитов мышей (Sheleg S. et. al., 2008).
1.3 Методы оценки функционального состояния клеток, подвергнутых криовоздействию
Для определения степени сохранения жизнеспособности клеток после замораживания – отогрева используют биохимические, морфологические, физико-химические и физиологические методы оценки. Все методы оценки структурно – функционального состояния клеток условно можно разделить на две категории: во-первых, это экспресс-методы, позволяющие оценить состояние биообъекта после замораживания – отогрева (микроскопические методы с использованием суправитальных красителей); во-вторых, методы, позволяющие оценивать специфические структурные и функциональные изменения в биообъекте с помощью более тонкого биохимического, физиологического, биофизического и электронно – микроскопического тестирования биообъектов (Белоус, Грищенко, 1994).
Одним из наиболее часто применяемых методов оценки состояния клеток после замораживания – оттаивания является исследование проницаемости плазматической мембраны для различных веществ, в том числе красителей. Для этого используют чаще всего красители типа трипанового синего или эозина (лейкоциты с поврежденной мембраной окрашиваются в розово-красный цвет), а также люминесцирующие красители (акридиновый оранжевый, тетрациклин). В последние годы для выявления повреждений мембран клеток применяют флуоресцентные зонды (, 1989). Например, флуоресцентный краситель К8-3010 окрашивает цитоплазму и внутриклеточные органеллы поврежденных клеток в ярко-зеленый цвет (, 2007). 3-гидрокси-4-(N,N-диметиламино)флавон ( и др., 2007) при электронном возбуждении (внутримолекулярный фотоперенос протона) образует изомеры: N-форму (зелено-голубая полоса эмиссии) и Т-форму (желтая полоса), положение и интенсивность полос зависят от способности образовывать межмолекулярные водородные связи, от полярности и вязкости микроокружения.
Одним из наиболее адекватных методов оценки проницаемости плазматических мембран клеток для молекул воды и криопротекторов является метод волюмометрии ( и др., 2009). В сочетании с физико-математическим моделированием процессов трансмембранного переноса этот метод позволяет определить значения коэффициентов проницаемости мембран индивидуальных клеток для молекул воды и криопротектора путем сопоставления экспериментальных зависимостей объема клетки от времени с адекватным решением теоретической модели для условий конкретного опыта. В качестве исходных параметров теоретическая модель включает, в частности, поверхностно-объемное отношение клетки и ее относительный осмотически неактивный объем (, , 1994), который определяет долю внутриклеточных веществ, неспособных покинуть клетку без повреждения мембраны: нуклеиновые кислоты, белки, связанная вода, мембранные структуры, структурные элементы цитоскелета.
К морфологическим тестам относится изучение лейкограмм. Исследования ученых ( и др., 1978; , 1999; и др., 2004; Grant C.K., 1976; Taylor M.J., Bank H.L., 1988; Vingerhoets J., 1995; Lund P.K, 2000) показали, что наиболее чувствительными к замораживанию и оттаиванию являются гранулоциты, а наиболее устойчивыми оказались лимфоциты и моноциты.
Изменение ультраструктуры клеток устанавливают при использовании электронно-микроскопических методов ( и соавт., 1978; Livesey S.A. et al., 1989): например, исследование изменений субмикроскопического строения гранулоцитов человека при их хранении как в обычной глюкозоцитратной плазме, так и в специальном растворе. Ультратонкие срезы готовили стеклянным ножом на ультрамикротоме. Изучение срезов производили в электронном микроскопе УВМ-100 при ускорении 75 кв. уже через сутки хранения лейкоцитов в глюкозоцитратной плазме крови наряду с интактными клетками в некоторых из них обнаруживали заметное изменение ультраструктур цитоплазмы. Наблюдали образование значительного количества полостей, лакун и цистерн, свидетельствующих о значительном развитии эндоплазматической сети. Также был заметен активный пиноцитоз клеток, на что указывало наличие большого числа вакуолей. В отдельных клетках в этот срок хранения находили изменения в строении специальных гранул – отслоение содержимого гранул, расплывание их пограничной мембраны, лизис гранул. Показано (, , и др., 1982), что у оттаянных лейкоцитов наблюдается уменьшение размера клетки, увеличение базофилии и вакуолизация цитоплазмы, уплотнение ядра и др.
К функциональным тестам относится изучение фагоцитарной активности.
Например, и (, 2002) для реакции фагоцитоза использовали 18-24 часовую агаровую культуру золотистого стафилококка. После 30 мин инкубации стафилококка при +37°С с лейкоцитами готовили мазки и определяли фагоцитарную активность, фагоцитарный индекс – среднее количество стафилококков, захваченных одной клеткой и количество клеток, находящихся в стадии аттракции. Аналогичные исследования проводили с нативными и криоконсервированными ядросодержащими клетками лейкоконцентрата кордовой крови человека ( и др., 2010). В окрашенных азур-эозином мазках определяли количество фагоцитирующих и нефагоцитирующих клеток среди 200 подсчитанных. Определяли число клеток в стадии аттракции и поглощения, фагоцитарное число (количество фагоцитированных микроорганизмов одним фагоцитом).
По методике и др. (1977) функциональную активность исследуемых нейтрофилов оценивают по поглотительной способности клеток с использованием инертных частиц латекса. Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) определяют процент фагоцитировавших клеток, а по количеству захваченных частиц латекса клеткой – фагоцитарный индекс.
Известен также метод оценки состояния деконсервированных клеток – реакция бласттрансформации – культивирование in vitro в присутствии неспецифического стимулятора – фитогемагглютинина (ФГА) (например, по методике и , 1966). Этим способом оценивается функциональное состояние лимфоидных клеток крови. Так, установлено (, , 1966) при изучении способности лимфоцитов пролиферировать в культуре тканей, что способность трансформироваться в этих условиях достаточно хорошо сохраняли молодые формы лимфоцитов даже после замораживания. Прежде всего, к 24 часам культивирования появлялись лимфоциты больших размеров с рыхлой структурой хроматина и нуклеолами, при нарастании сроков культивирования (48 ч) число таких клеток увеличивалось, и появлялись клетки в 2-3 раза превышающие нормальные лимфоциты с крупным рыхлым ядром, нуклеолами и нежно-голубой цитоплазмой. Они напоминали бластные клетки. К 72 ч число трансформированных клеток уменьшалось, а нормальных лимфоцитов – увеличивалось.
К биофизическим методам определения жизнеспособности клеток и тканей можно отнести следующие: криомикроскопия, рентгенография, вискозиметрия, термография, электрометрия и другие. Ценность этих методик заключается в том, что ряд из них позволяет исследовать состояние биообъекта при отрицательных температурах, без его отогрева, не нарушая целостности клеток.
Частота диэлектрической релаксации молекул воды является параметром, характеризующим подвижность молекул в СВЧ поле, и, следовательно, степень их взаимодействия с окружением. Структурные нарушения и конформационные изменения компонентов крови влекут за собой отличия в соотношении свободная-связанная вода в системе и сопровождаются изменением диэлектрических параметров, которые можно обнаружить методом СВЧ-диэлектрометрии в диапазоне частот, соответствующих области дисперсии молекул воды ( и др., 2004; , , 2005). Это позволяет использовать значение диэлектрической проницаемости биологических объектов как физический критерий при оценке структурных нарушений макромолекул и клеток, вызванных различными факторами (Batyuk L. V., Gatash S. V., Gorobchenko O. A., Nikolov O. T, 2002).
Метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) являются двумя взаимодополняющими методами, которые применяются в криобиологии для исследования насыщения тканей криопротектором (КП), количественного определения концентраций и времени, позволяющих описать процесс проникновения КП в ткань. Указанные методы используются для определения температур стеклования, величин скачка теплопоглощения при стекловании, а также температур фазовых переходов (, , 2005).
В качестве показателей сохранения структурно-функциональной полноценности митохондрий деконсервированных клеток можно использовать такие критерии жизнеспособности, как дыхание и окислительное фосфорилирование. Для изучения дыхательной и фосфорилирующей активности лимфоцитов применяется полярографический метод (, , 1975). Регистрация кинетики потребления кислорода лимфоцитами проводится на полярографе с применением закрытого электрода типа Кларка.
Для выявления специфических криоповреждений мембран клеток исследуют активность мембраносвязанных маркерных ферментов, таковыми могут быть холинэстераза либо Na+-K+ - АТФ, принизывающая липидный бислой. Например, появление в супернатанте повышенного количества К+ может свидетельствовать о нарушениях регуляции таких важных функций в клетке, как синтез белков, ДНК и РНК, в биоэнергетике клетки и работе транспортных АТФаз. Эти методы в сочетании с суправитальной окраской могут оказаться весьма информативным диагностическим приемом при оценке состояния деконсервированных клеток и указывать на глубину и топографию клеточных криоповреждений (, , 2002).
Криоповреждения внутриклеточных структур можно определять с помощью гистологических, гистохимических и электронно-микроскопических методов.
с соавторами (1981) предлагают энзиматическую диагностику криоповреждений клеток лейкоконцентрата.
К функциональным тестам относится цитохимическое выявление катионных белков в гранулах нейтрофилов (, , 1999). Данные белки обеспечивают кислороднезависимую микробицидность клеток (, 1978). Для их выявления зафиксированные в парах неразбавленного нейтрального забуференного формалина мазки крови окрашивают 0,2% раствором амидо черного 10Б в боратном буфере. Гранулы катионных белков окрашиваются в синий цвет. По формуле Астальди-Верга вычисляется средний цитохимический коэффициент (СЦК).
Для выявления уровня сохранения функции генетической системы клеток, биосинтеза специфических белков и нуклеиновых кислот применяют соответствующие меченые предшественники и по уровню их включения судят о нарушениях в обмене белков, нуклеиновых кислот либо других биополимеров в размороженной клетке в динамике. Достаточно информативным является авторадиографический метод специфического мечения тех или иных структур в клетках, срезах, тканях с помощью 3Н –предшественников, позволяющих проявить треки с помощью фоточувствительной эмульсии (Hayhoe F.G., Quaglino D., 1980). Путем микроскопического подсчета числа треков судят о функциональной активности ДНК, РНК или белков.
Количество популяций, субпопуляций лимфоцитов, моноцитов и предшественников зрелых клеточных типов в консервированных клеточных суспензиях определяют с помощью моноклональных антител в флюоресцентном тесте ( и др., 2010).
Гранулоциты и моноциты являются мощными генераторами активных форм кислорода (АФК). Одним из инструментов изучения АФК, определения степени генерации супероксидного анион-радикала (Babior B.M. et al., 1973), является реакция восстановления нитросинего тетразолия – НСТ – тест, который отражает, прежде всего, функцию гексозомонофосфатного шунта (ГМФШ) и связанную с ним наработку свободных радикалов. Данный тест не только позволяет выявить фагоцитирующие нейтрофилы, но может характеризовать и состояние их ферментных систем, использоваться для дифференциального диагноза бактериальных и вирусных инфекций, а так же для оценки резервной функции системы фагоцитоза. Принцип метода состоит в том, что в активированных нейтрофилах НСТ восстанавливается посредством супероксидного анион-радикала в диформазан, который в виде грубодисперсных темно-синих гранул откладывается в клетках, по концентрации которого и судят об АФК (, 1989; , 1999; , , 2000; , , 2001; Clark R.A., 1983, 1990, 1999; Dang P.M. et al., 1999).
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 |
