Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов (стр. 18 )

Количество Т - и В-лимфоцитов (М±σ, n=5), хранившихся при –80оС в течение 180 суток под защитой хладоограждающего раствора №20 не изменялось. Содержание Т-лимфоцитов до замораживания составляло 80,0±14,1%, после отогрева 83,7±9,8%, В-лимфоцитов соответственно 8,5±2,1% и 8,5±2,1%.

Определение уровня растворенного в биосреде кислорода показало, что через 180 суток экспозиции лейкоцитов в растворе №20 при –80°С значимого снижения концентрации кислорода не происходит (рис. 3.4.3.3).

Рисунок 3.4.3.3 Содержание растворенного кислорода в лейкоцитных концентратах (ЛК; n=10) в смеси с криопротекторным раствором (КР) №20 до и после хранения при –80°С в течение 180 суток

Применение хладоограждающего раствора №20, содержащего в исходной концентрации криопротектор ГМБТОЭМ - 22 %, криопротектор ДМСО - 8%, реставрирующий компонент ОМЭПС - 0,4 % и бидистиллированную воду до 100 мл позволяет сохранить ядерные клетки крови в условиях низкой температуры (–80°С) в течение 180 суток.

Для сравнения эффективности указанной технологии с традиционной (применение жидкого азота) в дополнительной серии исследований лейкоциты в криозащитном растворе №20 были заморожены по линейной программе в программном аппарате УОП 00.00.00 (Украина): на 1-м этапе со скоростью 1°C/мин от +22 до –7ºC, на 2-м этапе - 10°C/мин от –7 до –40°C, на 3-м этапе - 20°C/мин от –40 до –80°C. Общее время замораживания составило 37 мин. После этого образцы переносили для хранения в электроморозильник на –80ºС MDF-3086S «Sanyo» (Япония) где хранили в течение суток.

Установлено (табл. 3.4.3.2), что замораживание клеток по нелинейной программе способствует большей сохранности гранулоцитов и повышению количества нейтрофилов с гранулами диформазана, по остальным показателям различий не выявлено. Следовательно оба режима замораживания являются альтернативными.

Необходимо отметить, что применение нелинейной технологии замораживания клеток требует меньших экономических затрат. (2003) показано, что на реализацию низкотемпературного (–80°С) консервирования гемопоэтических стволовых клеток по нелинейному режиму без учета стоимости криоконсерванта требуется в 2 раза меньше средств, чем на криоконсервирование по линейным программам с использованием жидкого азота (–196°С). Себестоимость соответственно составила 33631,98 и 64083,82 $. При этом 98% себестоимости любого метода составляют затраты на технические средства, остальные 2% приходятся на оплату труда, затраты на электроэнергию, перевязочные средства и медикаменты.

Таким образом, для эффективного консервирования ядросодержащих клеток при низкой температуре (–80°С) целесообразным является нелинейное замораживание биообъекта в криозащитном растворе №20, содержащем протектор смешанного действия ГМБТОЭМ в исходной концентрации 22%, протектор эндоцеллюлярного действия ДМСО (8%) и антиоксидант, противогипоксант ОМЭПС (0,2%). Применение указанной технологии позволяет сохранять лейкоциты при –80°С в течение 180 суток.

Таблица 3.4.3.2. Влияние режимов замораживания (–80°С) лейкоцитов в криозащитном растворе №20 на показатели жизнеспособности клеток (n=10, М±σ), отогретых через сутки консервирования.

Примечания. # - данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%. * - различие с показателем до замораживания p<0,05. Л - различие с показателем сохранности при использовании линейного режима замораживания p<0,05.

3.4.4 Определение интенсивности процесса перекисного окисления липидов и антиоксидантной активности методом индуцированной хемилюминесценции в лейкоцитных концентратах, перенесших воздействие низкой температуры (–80ºС) разной продолжительности в криоконсервирующем растворе №20

При изучении влияния ингредиентов хладоограждающих растворов №20 и 22 на уровень ПОЛ-АОА лейкоцитов установлено (табл. 3.4.4.1), что криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ (30%) и криопротектор эндоцеллюлярного действия ДМСО повышают (р<0,05) уровень ПОЛ и АОА, а криопротектор проникающего действия ПД (6%) снижает. Водорастворимый антиоксидант ОМЭПС увеличивает ПОЛ и снижает АОА.

Таблица 3.4.4.1 Влияние ингредиентов хладоограждающего раствора №20 и №22 на уровень ПОЛ и антиоксидантный потенциал ядросодержащих клеток крови (n=12, М±σ)

Примечание. * - различие с величиной показателя лейкоцитных концентратов p<0,05.

При смешивании лейкоцитов с криоконсервирующим раствором №20 (табл. 3.4.4.2) уровень ПОЛ и АОА достоверно повышаются. Однако, через 1 сутки экспозиции клеток при –80°С с хладоограждающим раствором показатели ПОЛ и АОА (по показателю tg(-2α)) снижаются (р<0,05) по сравнению с величинами до замораживания; через 180 суток интенсивность ПОЛ повышается, а АОА возвращается к уровню до замораживания.

Таблица 3.4.4.2 Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (n=6, М±σ), перенесших воздействие низкой температуры (–80°С) в хладоограждающем растворе №20 в течение 1 и 180 суток

Примечание. * - различие с величиной показателя до замораживания с хладоограждающим раствором p<0,05.

3.5 Физико-химические и биологические свойства эффективных криозащитных растворов

3.5.1 Влияние длительного хранения эффективных хладоограждающих растворов на их криозащитные свойства

Стерильные хладоограждающие растворы №4, №9, №13 и №20 разливали по флаконам объемом по 50 мл и подвергали ускоренному старению, при котором образцы выдерживали в течение 45 суток при +60°С, что соответствовало двум годам хранения при +4°С (согласно «Временной инструкцией по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре (1983)» и оценивали прозрачность и рН растворов. Результаты исследований показали, что все растворы по истечении срока хранения оставались прозрачными. Изменение кислотности наблюдали только в серии с раствором №20 (исходное значение рН=7,29; после хранения - 6,05). В виду того, что рН данного раствора изменяется в кислую сторону, его приготовление необходимо осуществлять непосредственно перед процедурой замораживания.

После проведения метода ускоренного старения со всеми хладоограждающими растворами (в растворе №20 перед использованием уровень рН доводили до 7,2) были заморожены лейкоциты и оставлены на хранение при соответствующих температурах (раствор №4 при –10°С; №9 при –20°С; №13 при –40°С; №20 при –80°С) в течение суток.

Полученные результаты показали, что растворы №9, №13 и №20 сохраняют морфологическую полноценность клеток и их функциональную активность на том же уровне, что и соответствующий раствор, не подвергавшийся «старению».

В опытах с раствором №4 после «ускоренного старения» функциональная активность лейкоцитов снижалась. Было выдвинуто предположение, что это связано с возможным гидролизом ингредиента раствора - желатина - при хранении (45 суток при +60°С). Была проведена дополнительная серия исследований, в которой «ускоренному старению» подвергался раствор без желатина, последний добавляли в раствор непосредственно перед охлаждением клеток и хранением в течение 1 и 12 суток. В этом случае морфологические и функциональные показатели клеток соответствовали показателям лейкоцитов, хранившихся при –10°С в растворе, не подвергавшемуся «старению» как в течение одних, так и в течение 12 суток.

Таким образом, результаты проведенных исследований демонстрируют стабильность хладоограждающих растворов №9 (в конечной концентрации ГМБТОЭМ 14% и ОМЭПС 0,075%) и №13 (ГМБТОЭМ 15% и фумарат натрия 1,4%) в течение 2 лет.

3.5.2 Изучение биологических особенностей эффективных хладоограждающих растворов

3.5.2.1 Изучение «острой токсичности» эффективных хладоограждающих растворов №4, №9, №13 и №20

Испытание на мышах проведены согласно методике XII-ой Государственной Фармакопеи РФ (2007). Тест-дозу (табл. 3.5.2.1.1), в количестве 0,5 мл одного из исследуемых хладоограждающих растворов (с конечной концентрацией ингредиентов) вводили однократно внутрибрюшинно белым лабораторным мышам (по 5 животных для каждого раствора) со скоростью 0,1 мл/с. Срок наблюдения за животными после введения хладоограждающего раствора составил 5 суток. Установлено, что все животные оставались живыми, каких-либо отклонений в поведении и внешнем виде не выявлено. На основании полученных данных сделано заключение об отсутствии «острой токсичности» у криозащитных растворов №4, №9, №13 и №20 при однократном внутривенном введении лабораторным мышам.

Таблица 3.5.2.1.1 Конечная концентрация (в перерасчете на «сухое вещество») основных ингредиентов хладоограждающих растворов, используемых при изучении токсичности на животных

3.5.2.2 Изучение «хронической токсичности» эффективных хладоограждающих растворов №4, №9, №13 и №20

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27