Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов (стр. 23 )

Сохранность функциональной активности нейтрофилов в условиях отрицательных температур является главным критерием оценки эффективности используемой криотехнологии. Это связано с тем, что мембраны гранул весьма чувствительны к любого рода воздействиям и, получая незначительные повреждения, способствуют выходу в цитоплазму активных компонентов и лизису самой клетки.

Степень криоустойчивости различных популяций лейкоцитов определяли с помощью метода световой микроскопии (окраска мазков по Май-Грюнвальду и Романовскому), а субпопуляции лимфоцитов (Т, В) - с помощью моноклональных антител (LT3 к антигену CD3 для Т-лимфоцитов и LT22 к антигену CD22 для В-лимфоцитов) в непрямом иммунофлуоресцентном тесте. С помощью метода световой микроскопии (Nikon H550S) оценивали общее количество лейкоцитов в камере Горяева.

Из существующего арсенала методов оценки полноценности биологических мембран возможными были следующие.

Ц Целостность клеточной мембраны лейкоцитов оценивали с использованием 1% раствора суправитального красителя эозина (молекулярный вес 692) методом световой микроскопии. Признаком повреждения клеточной мембраны считали диффузное окрашивание цитоплазмы в розовый цвет, клетки с неповрежденной мембраной - жизнеспособные - имели светло-зеленый цвет.

Степень активации мембраносвязанной NADPН-оксидазы нейтрофилов определяли с помощью регистрации супероксидного анион-радикала в НСТ-тесте ( и соавт., 1992). Тест основан на реакции спонтанного восстановления красителя нитросинего тетразолия (НСТ), который в окисленном состоянии бесцветен, а при восстановлении до диформазана (с образованием стабильного промежуточного продукта - частично восстановленного моноформазана) в клетках преципитирует в виде грубодисперсных гранул темно-синего цвета.

Нестимулированные нейтрофилы (,2002) потребляют очень мало кислорода, однако при контакте с опсонизированными частицами в течение нескольких секунд резко возрастает потребление кислорода в 50-100 и более раз. Этот феномен называется «респираторной бурстой» и представляет процесс превращения кислорода в супероксид (О2-) путем передачи одного электрона от NADPН, ключевую роль в этом и играет связанная с плазматической мембраной и мембраной секреторных гранул NADPН-оксидаза. Генерация супероксид-аниона наблюдается и в нефагоцитирующих клетках при их стимуляции: Т-лимфоцитах (Sekkat C. et al, 1988), В-лимфоцитах (Leca G. et al, 1991). Определение содержания кислорода в лейкоцитных концентратах осуществляли с помощью амперометрического метода на анализаторе Эксперт-001-4 (-эксперт» г. Москва) в режиме работы «термооксиметр». Полученные данные свидетельствовали как о степени активности NADPН-оксидазы мембран нейтрофилов при воздействии отрицательных температур, так и о митохондриальном «дыхании» лейкоцитов. Интенсивность потребления клетками кислорода свидетельствует о активном синтезе АТФ в цикле трикарбоновых кислот в его присутствии. С другой стороны, снижение кислорода в окружающей среде (при нормальном барометрическом давлении) является причиной нормоксической гипоксии, которая имеет место при криоконсервировании клеточных суспензий.

Бактерицидная система нейтрофилов на ряду с кислородзависимым бактерицидным механизмом представлена также кислороднезависимым. Ряд ферментов и белков гранул (первичных и вторичных) обеспечивает киллерный эффект. Активность указанных соединений (дефензины, серпроцидины, кателицидин и др.) определяли в лизосомально-катионном тесте по методике и (1999). Данный метод исследования также свидетельствует о глубине низкотемпературных повреждений нейтрофилов - мембраны лизосом весьма чувствительны к замораживанию (особенно к тоничности среды и рН) и теряют свои барьерные свойства, что сопровождается выходом гидролаз в цитоплазму и развитием вторичных «латентных» повреждений, вплоть до гибели клетки.

Одновременно с процессом дегрануляции нейтрофила на поверхности мембраны, направленной в сторону объекта фагоцитоза, формируется участок с пластинчатым строением и высокой концентрацией рецепторов, участвующих в этом процессе. Объект фагоцитоза фиксируется с помощью рецепторов к мембране и окружается псевдоподиями с образованием фагосомы. Согласно современным данным (, 2002), фагоцитоз – специализированная, рецепторопосредованная форма эндоцитоза без участия цитоскелета. Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по модифицированному методу и соавт. (1977) с использованием инертных частиц латекса. Определяли процент фагоцитирующих клеток. Данный показатель является основным критерием оценки жизнеспособности криоконсервированных гранулоцитов.

Развитию низкотемпературной деструкции мембран способствует перекисное (свободнорадикальное) окисление липидов (ПОЛ), которое заключается в непосредственном переносе кислорода на субстрат с образованием перекисей, кетонов, альдегидов … и имеет цепной, самоиндуцирующий характер ( и соавт., 2001). При криоконсервировании клеток ПОЛ может возникнуть: в условиях гипоксии, действии гиперконцентрированных солей или веществ экзогенного происхождения (ксенобиотики, криопротекторы), при нарушении структурной интеграции мембраны при замораживании-отогреве (, 1997). Высокая биологическая активность различных продуктов ПОЛ обусловила необходимость возникновения на самых ранних этапах эволюции живых организмов на Земле и постоянного функционирования специальных механизмов противоокислительной (антиоксидантной) биологической защиты - ферментативного и неферментативного контроля за содержанием активных форм кислорода, свободными радикалами и молекулярными продуктами ПОЛ. Интенсивность ПОЛ и антиоксидантную активность (способность регулировать концентрацию гидроперекисей) у нейтрофилов (согласно мнению и др.,(2005) именно эти клетки крови являются основными индукторами хемилюминесценции) определяли методом индуцированной (перекисью водорода с сульфатом железа) хемилюминесценции на биохемилюминометре БХЛ-07 (ЦНИЛ НГМА; «ИМБИО» Н. Новгород, Россия). По показателям хемилюминограммы Imax (мВ) и S (мВ×сек) - судили о степени активности ПОЛ, антиоксидантный потенциал оценивали по показателю tg(-2α) и коэффициентам a (S/Imax × t) и Z (S/Imax); чем выше показатель tg(-2α), тем выше антиоксидантная активность в исследуемой пробе, и наоборот чем выше a и Z, тем ниже антиоксидантная активность.

Для различных температурных диапазонов были разработаны комбинированные консерванты (табл. 2.2.1), при этом учитывались основные требования, предъявляемые к их компонентам. Вещество должно быть нетоксичным (не требующим отмывания от биообъекта), хорошо растворяться в воде и стабилизировать ее молекулы, способствовать образованию мелких кристаллов льда и стеклованию воды, не откладываться в клетках и тканях организма и быстро выводиться из него, не должно иметь неприятного запаха (, 2010). Необходимо учитывать также и степень влияния веществ на уровень ПОЛ и АОА клеток, т. е. компонент криозащитной среды не должен вызывать разрушения биологических мембран. Показано (, , 1980; , , 2005), что криопротекторы в зависимости от используемой концентрации могут снижать устойчивость мембран к перекисному окислению. В связи с этим у предполагаемых ингредиентов криозащитных растворов изучено влияние на интенсивность ПОЛ и антиоксидантную систему клетки.

Установлено (табл. 4.1), что при смешивании лейкоцитов с любым криопротектором (исключение лемнан) в указанных концентрациях отмечается совместное изменение показателей ПОЛ и АОА, причем АОА, как правило, в большей степени. Выявлено также, что с увеличением молекулярного веса криопротектора до определенного значения отмечается повышение активности процессов ПОЛ-АОА, а затем их совместное снижение (рис. 4.1).

На основании полученных данных обозначена группа протекторов, не только ускоряющих процессы липопероксидации, но и оказывающих стимулирующее действие на антиоксидантные системы клетки. Это глицерин, ГМБТОЭМ и желатин-16000, в меньшей степени - ГЭК и желатин-20000.

Протекторы ПД, ДМСО замедляют процессы ПОЛ и снижают АОА у лейкоцитов. Данное подавление метаболической активности клеток криопротекторами известно, как проявление их псевдотоксического эффекта, который устраняется при удалении протектора из клетки (, , 1994).

Установлено, что дополнительный компонент криозащитной среды фумарат натрия не изменяет уровень ПОЛ и АОА у лейкоцитов, тогда как ОМЭПС в зависимости от используемой концентрации ведет себя неравнозначно: в концентрации 0,15% - снижает интенсивность ПОЛ и АОА, в концентрациях 0,2% и 0,3% - повышает ПОЛ на фоне сниженной АОА, т. е. во всех случаях ОМЭПС ингибирует собственные антиоксидантные системы клеток.

Таблица 4.1 Влияние веществ, входящих в состав хладоограждающих растворов, на интенсивность ПОЛ (по показателю хемилюминограммы S) и АОА (по tg(-2α)) у лейкоцитов

Примечание. М±σ, * - p<0.05.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27