Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов (стр. 5 )

Клетки животных и растений обладаю собственным слабым свечением – митогенетическими лучами (, 1934). На основе этого в настоящее время разработаны методы биохемилюминесценции, позволяющие регистрировать слабое излучение клеток, возникающее, в первую очередь, в связи с образованием активных форм кислорода (, , 1975; , 1999). Данный метод применяется для анализа функциональной активности как нейтрофилов (, 2000), так и фагоцитов (, , 2004).

Экспериментальные исследования подвижности нейтрофилов ведутся с середины XIX века (, 1961). В 1962 году S. Boyden описал метод количественной оценки подвижности лейкоцитов, который получил широкое применение в экспериментальных и клинических исследованиях (Boyden S., 1962). Суть метода состоит в миграции лейкоцитов через поры мембранного фильтра с диаметром: для нейтрофилов – 3 мкм, для эозинофилов 5 мкм, для макрофагов 8 мкм из верхнего отсева камеры в нижний. В 1975 году был описан метод исследования подвижности под агарозой (Nelson R.D., Quie P.G., Simmons R.L., 1975), а в 1988 году – визуальный метод или метод изучения подвижности на стеклах (Haston W.S., Wilkinson P.S., 1988). Прогресс в этой области исследования связан с разработкой методов регистрации разнообразных параметров движения. В целом методы исследования подвижности лейкоцитов позволяют оценивать среднюю подвижность по всей популяции, неоднородность двигательной активности клеток внутри популяции, регистрировать поведение индивидуальных клеток с целью изучения механизмов движения и минимизируют время, затраченное на исследование (, , 2003).

Для оценки физиологического состояния лейкоцитов крови человека, клеток иммунокомпетентных тканей (костного мозга, селезенки, тимуса, лимфатических узлов), лимфоцитов на высоте иммунной реакции, сперматоцитов и др. определяется также количество ореолообразующих клеток, которые по причине высокого отрицательного заряда отталкивают эритроциты от своей поверхности (, 1988; и др., 1984).

Существуют и другие методы, которые могут быть применены для оценки жизнеспособности размороженной ядросодержащей клетки. Однако наиболее эффективным будет комплексный подход.

1.4 Методы криоконсервирования лейкоцитов

1.4.1 Способы получения лейкоцитного концентрата и его практическое применение

Лейкоконцентрат (, , 1997; , 1999; Bux J., 1996) — трансфузионная среда с высоким со­держанием лейкоцитов периферической крови от 10х109 до 40-50х109 лейко­цитов в 200—500 мл суспензионной среды с незначительной примесью эритроцитов, тромбоцитов, стволовых клеток и плазмы.

Лейкоцитные концентраты нашли свое применение при лейкоцитопениях, когда количество лейкоцитных клеток в периферической крови больного менее 1,5×109/л, при различных патологических состояниях с угрозой развития или развивающимися инфекционными осложнениями; гипо - и апластических состояниях кроветворения, медикаментозных агранулоцитозах; тяжелом сепсисе, онкологических и гематологических заболеваниях с резким угнетением лейкопоэза в результате применения химио - и лучевой терапии (, 1995); токсической и терминальной фазах разлитого перитонита с выраженными признаками иммунодефицита ( и др., 1992; , , 1995); гнойных заболеваниях плевры и легких, обширных глубоких ожогах в стадии генерализации инфекционного процесса с признаками иммунодефицита тяжелой степени и при неэффективности проводимого лечения ( и др., 1993); нейтропениях (, 2001) и выраженном сепсисе у новорожденных (Сairo M.S. и др., 1992; Nеррert J., 1996).

Абсолютными противопоказаниями к применению лейкоконцентрата служат свежие тромбозы и эмболии различного генеза, тяжелые аллергические реакции и острые нарушения мозгового кровообращения. Переливание лейкоконцентрата относительно противопоказано при тяжелых формах сердечной недостаточности, инфаркте миокарда, гипертоническом кризе. Так же противопоказаниями являются: наличие антилейкоцитарных тел у больного и невозможность подобрать совместимый концентрат лейкоцитов по системе HLA; концентраты лейкоцитов, заготовленные от больных хроническим миелолейкозом. Не имеет смысла переливать концентрат лейкоцитов, в котором число лейкоцитов не соответствует лечебной дозе или лейкоциты нежизнеспособны (, 1999).

Критерием эффективности трансфузий концентрата лейкоцитов является повышение эффективности проводимой антибактериальной терапии и снижение активности воспалительного процесса при одновременном увеличении числа лейкоцитов в периферической крови (, 1995).

В настоящее время для получения данного компонента крови на ряду с классическими методами (, , 1963; , , 1971; , 1980; , 1995): снятие лейкоцитной пленки, остающейся над эритроцитами после отделения плазмы при спонтанном оседании эритроцитов; сбор из флаконов с кровью, в которых наблюдают спонтанно ускоренное оседание эритроцитов при получении плазмы, обогащенной лейкоцитами; ускоренное осаждения эритроцитов с применением коллоидных осадителей и получение плазмы, обогащенной лейкоцитами все шире применяют аппаратные методы: гравитационный лейкоцитаферез на фракционатарах крови с непрерывным и прерывистым током крови и фильтрационный лейкоцитаферез с пропусканием гепаринизированной крови через специальные фильтры (нейлон, дакрон, и др.), задерживающие лейкоциты. Последние методы позволяют выделить от одного здорового донора до 30хх109 лейкоцитов (, 1995).

Российским НИИ гематологии и трансфузиологии предложены методы получения лейкоцитной взвеси путем повторного двойного и тройного лейкоцитаферезов с применением контейнеров «Гемакон-500/300», «Компопласт-300», лабораторных центрифуг К-70 или ЦЛ-4000. При двойном лейкоцитаферезе от донора получают 200 мл лейкоцитной взвеси, содержащей до 4,0´109 лейкоцитов. В тройном лейкоцитаферезе получают 300 мл взвеси, содержащей до 6,0´109 лейкоцитов. В лейкоцитной взвеси, заготовленной приведенным методом, содержатся 47% нейтрофильных гранулоцитов, 5% моноцитов и 43% лимфоцитов. За рубежом применяют аппаратный лейкаферез с использованием центрифужных сепараторов непрерывного («Amico», IMB-2997, «Fenwal-3000») и прерывистого («Hemonetics-30», «Hemonetics-50» и др.) потока. Получают лейкоцитные концентраты, содержащие от 14,0´109 до 24,0´109 клеток, среди которых гранулоциты составляют 70% ( Л и др., 2003).

1.4.2 Методы низкотемпературного консервирования лейкоцитов

На основании проведенного анализа опубликованных данных можно отметить превалирующий подход к решению проблемы сохранности ядросодержащих клеток крови с использованием жидкоазотной технологии при ультранизкой температуре –196°С.

и (1966) предложили использовать для длительного хранения лейкоцитов крови человека при ультранизких температурах следующие криопротекторы: 15% глицерин, 15% ДМСО и 20% ПВП. В любом случае, фоном являлся следующий раствор: сахароза или лактоза, глюкоза и ЭДТА Na2. Перед замораживанием лейкоциты, взвешенные в плазме, смешивали с равным объемом одного из названных ограждающих растворов. Использовали термоизолированный сосуд с налитым в него этиловым спиртом и алюминиевые контейнеры. Режим замораживания был следующий: 1°С/мин до –15°С, затем по 10°С/мин до –79°С. Далее переносили для хранения при –196°С. Быстрое размораживание проводили в водяной бане при +40°С без перегрева препарата выше 10-15°С. Перед трансфузией осуществляли 5-10 минутное разбавление (в 2 раза) изотоничным раствором сахарозы с ЭДТА Na2 в спаренных пластикатных мешках закрытым способом. При изучении морфофункциональных свойств лейкоцитов установлено, что жизнеспособность при использовании глицерина составила 70%, ДМСО - 75%, а ПВП - 92%. Фагоцитарная активность гранулоцитов - 50%. Реакция бласттрансформации, т. е. процент трансформированных клеток после замораживания составил 80-90%. В 1973 году этими же авторами для замораживания гранулоцитов и лимфоцитов человека под защитой 15% глицерина была предложена следующую программа замораживания: 1°С в минуту до –13°С и далее по 10°С в минуту как в камере, так и в биопродукте. Эффективность метода определялась по суправитальной окраске: эозинорезистентных гранулоцитов наблюдалось 79%, лимфоцитов 83%.

с соавторами (1975) предложил режим замораживания гранулоцитов человека с постоянной скоростью охлаждения при использовании 30% глицерина в углеводно-солевом растворе. При этом за 30 мин до замораживания взвесь гранулоцитов обрабатывали криоконсервантом. Замораживание с переменной скоростью проводили в аппарате конструкции Института кибернетики АН Грузинской ССР. Определено лучшее условие охлаждения камеры - со скоростью 2°С/ мин. Суправитальная окраска эозином, при этом, была на 10% ниже, чем при предыдущей программе.

с соавторами (1975) провели замораживания лейкоцитов под защитой 9% ПВП, 7,5% и 15% глицерина, 10% и 20% ДМСО и 15% ПЭО в оригинальном аппарате «Тбилиси» по одноэтапной программе (1-10°С/мин) и двухэтапной программе (2-10°С/мин). Наилучшие результаты по жизнеспособности клеток получены при использовании 9% ПВП и 15% ПЭО по обеим программам замораживания.

Наиболее подробное изучение влияния отрицательной температуры –196° и 10% криопротектора ПЭО-400 на сохранность клеток лейкоконцентрата и лимфоконцентрата периферической крови провела (1975). После 30 минутной экспозиции клеток с протектором проводилось замораживание по двухэтапной программе: 1°/мин до –10° далее -400° /мин (для гранулоцитов) и 5°/мин до –10˚ далее -400˚ /мин (для лимфоцитов). Хранились замороженные клетки при ультранизких температурах до 3-х лет. Быстрое размораживание осуществлялось в водяной бане со скоростью 540-500°/мин при температуре +40°С и +30°С. Установлено, что лимфоциты, консервированные данным способом, наиболее устойчивы, чем гранулоциты.

с соавторами (1978) предложили замораживание лейкоцитов с 10% ПЭО-400 в аппарате «Биокомплекс». Время экспозиции клеток с протектором - 30 мин. Замораживание 2-5°С/мин до тепловой остановки (5-10 мин) далее 400˚ С/мин до –196°С. Размораживание - на водяной бане при температуре +40°С (скорость 500° С/мин). При этом количество незрелых клеток снизилось на 45%, зрелых гранулоцитов и агранулоцитов соответственно на 14% и 7%. Фагоцитарная активность уменьшилась на 8%, фагоцитарное число не изменилось, а количество клеток, находящихся в состоянии аттракции, повысилось на 6,4%. Двигательная активность лейкоцитов не изменилась (индекс миграции 1,08±0,22). Сохранилась также способность к трансформации.

В практической трансфузиологии известен способ консервирования лейкоцитов, предложенный с соавторами (1986) под защитой хладоограждающего раствора «Лейкокриодмаца» (приказ Минздрава СССР № 000 от 25.12.85): ДМАЦ - 20,0 мл, глюкоза - 20,0 г, ЭДТА Na2 - 0,4 г, вода для инъекций - до 100 мл. Соотношение лейкоконцентрат: 3:1, т. е. конечная концентрация ДМАЦ - 5%. При замораживании по линейной программе (3°С/ми до –1°С; 5°С-10°С до –100°С с перемещением в жидкий азот) через 2 года хранения жизнеспособными остаются 78% отогретых лейкоцитов.

Q. Zhang, T. R Tiersch (1995) замораживали лейкоциты канального сома с глицерином, ДМСО и метанолом с их последующим цитогенетическим анализом, хранили 7 сут. Выявили снижение жизнеспособности клеток, консервированных с глицерином на 24-27%, с ДМСО – на 25-43%, с метанолом на 67-100%; при медленном замораживании (-2.7°С/мин) жизнеспособность была выше, чем при быстром (-45°С/мин).

С 2003 г. в России (приказ Минздрава РФ № 000 «О развитии клеточных технологий» от 01.01.2001) для криоконсервирования (–150°С) концентрата стволовых клеток пуповинной/плацентарной крови человека в научных целях начали применять высокоочищенный ДМСО (10%) в «полиглюкине». Некоторым крупным НИИ было разрешено применять деконсервированные ГСК для аутотрансплантаций в клинических целях. Согласно методическим рекомендациям «Заготовка гемопоэтических стволовых клеток» (Утв. ФМБА России 30.05.2007) замораживают биообъект в парах жидкого азота: на первом этапе со скоростью 1,1°С-2,5°С/мин до –40°С, на втором по 3°С-5°С/мин до –120°С. Хранение осуществляют при –196°С в течение многих лет в физиологически полноценном состоянии.

Для консервирования лейкоцитов также был использован диапазон низких температур (–80°С).

J.P. Crowley (1974) исследовал восстановление структуры и функции различных видов лейкоцитов крови человека, охлаждённых с ДМСО в концентрации от 6 до 15%. При замораживании клеток до –80°С со скоростью 1°С/мин и хранении в течение недели жизнеспособность клеток составляла около 95%, а сохранность гранулоцитов – 29%. После отмывания протектора жизнеспособность снижалась до 50% и через 24 часа составляла 40%. При этом электронная микроскопия показала значительные изменения в морфологии гранулоцитов, но не лимфоцитов.

F.J. Lionetti (1975) используя ДМСО (5%, 10%) осуществил замораживание (2°C/мин до -80°С) и хранение лейкоцитов в течение 3 месяцев. При этом сохранность гранулоцитов составила 60,0±9,7%, после отмывания снижалась до 43%. Также автор применил комбинацию криопротекторов 10% ДМСО с 4% ГЭК и получил положительный результат.

Аналогичный подход использовал P. Boonlayangoor (1980). При использовании ДМСО (5, 10%) с ГЭК (4% для отмывания) и замораживании 2-3°С/мин –80°С через 2 месяца хранения 50% клеток оставались жизнеспособными, их фагоцитарная активность составляла 58% и снижалась по мере хранения клеток (максимальный срок – 4 мес).

с соавторами (1999) предложен метод консервирования лейкоцитов при –80°С с применением нелинейной программы замораживания и малотоксичного консерванта: криопротектор ГМБТОЭМ - 15%, лимонная кислота - 0,35% и бидистиллированная вода - до 200 мл. Через 12 месяцев хранения при низкой температуре сохраняется 52,5±10,2% функционально активных лейкоцитов.

Возможность консервирования лейкоцитов при температурах выше –80°С до настоящего времени остается не изученной.

Глава II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика объекта исследования

В работе использованы лейкоциты крови человека, полученные из цельной донорской крови (доноры-добровольцы 35,6 ± 5,2 лет) методом цитафереза (центрифуга «Sorvell» (США), 5 мин, 2500 об/мин, консервант цитратфосфатдекстроза) в отделении гравитационной хирургии ФГБУН Кировского НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России. Количество лейкоцитного концентрата (ЛК) в среднем составляло 22,7 ± 6,1 мл. Указанная трансфузионная среда с высоким со­держанием лейкоцитов (20 в 1 мкл) имела незначительную примесь эритроцитов, тромбоцитов, стволовых клеток и плазмы. Всего в работе использовано более 500 лейкоцитных концентратов. Проведено более 6000 исследований по изучению структурно-функциональных особенностей ядерных клеток крови до и после воздействия отрицательных температур под защитой комбинированных криозащитных растворов.

2.2 Разработка новых комбинированных криозащитных растворов, обеспечивающих сохранность лейкоцитов при различных отрицательных температурах

При разработке криозащитных растворов (табл. 2.2.1) в зависимости от температуры воздействия были использованы криопротекторы (глава 1.3) эндоцеллюлярного действия - глицерин ( г. Электрогорск), диметилсульфоксид (ДМСО; Sigma, США), пропандиол (1,2-ПД; Lancaster, Англия), слабого экзоцеллюлярного действия - гидроксиэтилкрахмал (ГЭК; рефортан Berlin-Chemie / Menarini Group Германия) и смешанного действия - гексометиленбистетрагидроксиэтилмочевина (ГБТОЭМ или вещество А-378; Казанский химико-технологический институт).

Таблица 2.2.1 Составы криозащитных растворов.

Примечания. * - молекулярный вес криопротектора; вещество обладает действием: АГ – антигипоксическим, АО - антиоксидантным, АТ – антитоксическим, М – мембранопротекторным; Р – регулятор энергетического метаболизма, А – антикоагулянт. Ингредиенты указаны в исходной концентрации (в %).

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27