Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов (стр. 22 )

До и после однократной трансфузии оценивали внешний вид и поведение собак, осуществляли термометрию, определяли массу тела животного, частоту дыхания и частоту сердечных сокращений, исследовали показатели крови и мочи.

Таблица 3.5.2.4.1 Результаты исследования крови собак до и после однократной трансфузии концентратов лейкоцитов, подвергнутых воздействию низких температур в хладоограждающих растворах №4 и №9

Во время переливания концентрата аутологичных лейкоцитов и после него собаки вели себя спокойно, отклонений в поведении и внешнем виде у животных не наблюдалось. Масса и температура тела, пульс животных после перенесенной ими трансфузии не изменились по сравнению с исходными.

Статистически значимых отличий от исходного уровня показателей крови животных (табл. 3.5.2.4.1, 3.5.2.4.2) не выявлено.

Таблица 3.5.2.4.2 Результаты исследования крови собак до и после однократной трансфузии концентратов лейкоцитов, подвергнутых воздействию низких температур в хладоограждающих растворах №13 и №20

Показатели мочи собак после трансфузий не изменились по сравнению с исходными данными (цвет – желтый, прозрачность – прозрачная, относительная плотность - 1,030±0,01, реакция - щелочная, белок и глюкоза - не обнаружены; в осадке мочи: лейкоциты - 0-1 в поле зрения, единичные трипельфосфаты).

На основании полученных результатов исследований, можно заключить, что крупные экспериментальные животные (собаки) перенесли переливание размороженных аутологичных лейкоцитных концентратов, криоконсервированных с разработанными и «неотмытыми» хладоограждающими растворами №4, №9, №13 и №20 без осложнений.

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для создания общей теории криоповреждения и криозащиты клеток, а также эффективных научно обоснованных методов их криоконсервирования важным является всестороннее изучение структурно-функциональных изменений биологических мембран (плазматических, ядерных, лизосомальных и др.) и метаболических процессов, протекающих с их участием.

Несмотря на большое функциональное многообразие мембран и значительную вариабельность их химического состава (зависит от типа клеток, уровня организации), все они имеют много общего. Основными структурными элементами биологических мембран ( и соавт., 2009) являются липиды и белки (соотношение от 4:1 до 1:4), в небольших (от 2 до 10%) количествах присутствуют также углеводы. Практически все мембраны, независимо от их происхождения, содержат (, , 1994) фосфорилированные производные липидов (фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит, кардиолипин, сфингомиелин и др). Обязательным компонентом плазматических мембран клеток животного происхождения является холестерин (присутствует, как правило, в значительных количествах и в свободном виде и в виде эфиров с жирными кислотами), который регулирует упаковку и контролирует подвижность липидов, их вращение (ротационную подвижность), латеральную диффузию (способность отдельных молекул фосфолипидов передвигаться вдоль своего слоя). Первыми воспринимают различного рода изменения окружающей среды (понижение температуры, вымерзание воды, рН, электролитный баланс, вязкость, появление чужеродных молекул и др.) плазматические мембраны. Повышенное содержание холестерина и полиненасыщенных жирных кислот (например, арахидоновой) в плазматических мембранах клеток обеспечивает их устойчивость к неблагоприятным факторам среды (в том числе изменению температуры), которая в первую очередь связана с тем, что фазовые переходы липидов (их модификация из жидкокристаллического состояния в гель-фазу с образованием жесткой мембранной структуры) при данном условии происходят в области умеренно-низких температур (–40°С ÷ –50°С). Фазово-структурные изменения липидов инициируют первичные повреждения мембран, которые проявляются в изменении их проницаемости для ионов и метаболитов, характере взаимодействия с рецепторами, активации процессов биохимической модификации липидов и их латеральному разделению в плоскости бислоя (нарушение ассиметричного распределения липидов в мембране, которое обеспечивает ее высокую пластичность и растяжение). Низкое содержание холестерина в мембранах внутриклеточных органелл обуславливает инициацию фазовых переходов липидов уже при положительных температурах.

На температуру фазово-структурного перехода липидов влияют также интегральные и периферические белки мембран. В их присутствии температура перехода снижается. При снижении рН, повышении молярности окружающей среды температура фазового перехода повышается, также как и при дегидратации.

С переходами липидных компонентов связаны фазово-структурные переходы воды, которые являются одним из факторов холодового шока клеток. Степень гидратации мембраны обуславливает ее важные параметры (плотность, упаковка, толщина) и свойства. Фосфолипидные молекулы способны удерживать большее количество воды чем белки, эта способность снижается в ряду фосфатидилсерин - фосфатидилхолин - фосфатидилэтаноламин. По характеру связи воды с клеточной мембраной условно (, , 1994) выделяют три фракции воды. На отдаленном расстоянии от биополимеров находится высокоподвижная метаболически активная свободная фракция. В близи с биополимерами за счет прочных связей расположена менее подвижная стабилизирующая структуру мембраны связанная фракция. На поверхности биомолекул би - или мономолекулярных слоев мембраны за счет сил сцепления с заряженными группировками белка находится фиксированная фракция. Каждая фракция имеет свою зону кристаллизации, в которой разная степень замедления метаболизма (, 2000). При температуре переохлаждения (–1°С ÷ –10°С (–13°С)) внеклеточная и все виды внутриклеточной (свободная, связанная, фиксированная) не замерзают, метаболизм в клетках незначительно замедляется. При субумеренно-низкой температуре (–15°С ÷ –20°С (–28°С)) внеклеточная вода и, как правило, свободная внутриклеточная замерзают, метаболизм имеет малое замедление. При умеренно-низкой температуре (–30°С ÷ –50°С (–52°С)) и при субнизкой (–55°С ÷ –65°С (–68°С)) наблюдается неустойчивая кристаллизация связанной воды и еще большее замедление метаболизма. Стабильная кристаллизация внеклеточной, свободной и связанной внутриклеточной воды характерна для низкой температуры (–70°С ÷ –90°С (–98°С)). Фиксированная вода остается в незамерзшем состоянии, наблюдается выраженное замедление метаболизма. При субультранизкой температуре (–100°С ÷ –130°С (–135°С)) начинается кристаллизация фиксированной фракции, которая заканчивается при ультранизкой температуре (–136°С ÷ –196°С (–272°С)), метаболизм в клетках останавливается, однако даже при –196°С наблюдается переход электронов в атомах молекул биообъекта с одной орбиты на другую.

Низкая точка замерзания фиксированной воды связана с ее способностью концентрировать большое число растворенных в клетке веществ (и ионов), в результате чего в мембранных структурах и белковых компонентах цитоплазмы формируются высоковязкая белково-минеральная смесь. Это своего рода защитный барьер к повреждающему воздействию гиперконцентрированных растворов солей, образующихся при вымораживании свободной воды. Кроме того, кристаллизация такой вязкой фракции воды будет протекать с формированием аморфных, не повреждающих клетку, структур льда. Следовательно, частичная дегидратация клеток перед замораживанием является защитой от действия «эффекта раствора» и внутриклеточных крупных гексагональных кристаллов льда. Этого можно достичь путем введения в замораживаемый биообъект криофилактического вещества, действие которого основано на способности создавать прочные связи с молекулами воды (вне и внутри клетки, более прочные, чем связи воды между собой) и способности снижать концентрацию солей, что делает минимальным риск повреждения белковых структур клеток (, 1983). В их присутствии соли либо вообще не концентрируются до повреждающих пределов, либо эти пределы достигаются в зоне температур, когда развитие повреждений протекает медленно. И, наконец, криозащитные вещества способны образовывать связи со структурными компонентами мембраны клеток, предохраняя их от разрушения кристаллами при замораживании (Виноград-, 1970; Pushkar N.S. et al. 1976; и соавт., 2004).

Полученные данные подтвердили необходимость введения криопротекторов в замораживаемую биосреду. Например, при определении проницаемости клеточной мембраны к витальному красителю эозину (молекулярная масса 960,8) установлено, что до воздействия отрицательной температуры 99-100% клеток имеют мембрану устойчивую к данному красителю. После отогрева лейкоцитов, находящихся в условиях температуры переохлаждения (–10°С) без криопротектора в течение 1 суток, число клеток с неповрежденной мембраной (эозиноустойчивой) составляет 88,7±1,7% (от исходного уровня), в условиях субумеренно-низкой (–20°С) и умеренно-низкой (–40°С) температур соответственно 28,2±4,8% и 15,2±3,2%, в условиях низкой температуры (–80°С) мембраны всех клеток имеют повреждения и являются проницаемыми для витального красителя.

Сохранность клеточной мембраны зависит также и от скорости замораживания и отогрева. Для замораживания лейкоцитарной взвеси была выбрана медленная нелинейная (экспоненциальная) программа, которая позволяет разным популяциям лейкоцитов в зависимости от скорости снижения температуры окружающей среды постепенно замедлять степень текучести многокомпонентного состава мембран, связанной с «вымораживанием» фракций воды и ее аморфной (менее травматичной) кристаллизацией, что, в свою очередь, обеспечивает стабильное снижение метаболических процессов. При использовании данного режима замораживания на термограммах не отмечается выброса кристаллизационного тепла, следовательно, не происходит роста гексагональных крупных кристаллов, вызывающих механическое повреждение мембран. При выбранном режиме замораживания целесообразным является быстрый отогрев биообъекта, позволяющий избежать активации процессов рекристаллизации вне - и внутриклеточной воды.

В качестве объекта исследования использованы лейкоцитные концентраты из крови здоровых доноров-добровольцев. Эта биологическая среда содержит в 4-8 раз большее чем периферическая кровь количество ядросодержащих клеток с незначительной примесью эритроцитов, тромбоцитов, стволовых клеток и плазмы. Базофилы и эозинофилы обладают тромболитической активностью. Лимфоциты, являясь иммунокомпетентными клетками, содержат большое количество тканевых антигенов. Стволовые клетки, попав в благоприятные условия среды, проявляют гемопоэтическую активность. Ведущей ролью нейтрофилов (, 2002) является защита организма от инфекции, которая тесно связана с функцией лимфоцитов и системой мононуклеарных фагоцитов. Последние быстро покидая сосудистое русло, функционируют как резидентные клетки в тканях (легкие, печень и др.), где осуществляют профилактический антимикробный надзор в тесном взаимодействии с лимфоцитами в иммунном ответе. Обе группы фагоцитов разрушают опсонизированные частицы путем их поглощения и разрушения во внутриклеточных вакуолях. Под действием ферментов, бактерицидных белков, активированных кислородных метаболитов происходит деструкция этих частиц. Исследования последних лет показали, что нейтрофилы не только уничтожают бактерии, но и играют ключевую роль в воспалении благодаря веществам, содержащимся в азурофильных, специфических, желатинозных и секреторных гранулах клеток (Borregaard N., Cowland J., 1997). Эти клетки могут вовлекаться в первоначальную фазу образования отека, мигрируя в очаг воспаления, стимулировать миграцию моноцитов в данный воспалительный очаг, образовывать многие важные цитокины и хемокины, способные увеличивать распространение воспалительного очага и привлекать в этот очаг еще большее число нейтрофилов и других клеток. Таким образом, нейтрофилы на каждой стадии воспаления выполняют определенную роль, контролируют распространение воспаления на неповрежденные ткани и способствуют прекращению воспаления, репарации тканей и восстановлению в них нормальной гомеостатической функции после ликвидации бактериальной инвазии.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27