Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов (стр. 24 )

Показано, что в условиях целого организма, также как и фумарат натрия (, 1993), ОМЭПС обладает выраженным антигипоксическим действием (, 1990), но способен также ингибировать стадию инициации ПОЛ (, 1991; и соавт., 2001) путем взаимодействия с водорастворимыми радикалами и с ионами двухвалентного железа, хелатируя или окисляя последние в катион железа (III). Описанное выше действие выявлено только для концентрации ОМЭПС 0,15%.

Рисунок 4.1 Динамика уровня ПОЛ (по показателю S) и АОА (по tg(-2α)) у лейкоцитов в зависимости от молекулярного веса криопротектора

о - p>0,05.

Таким образом, для получения эффективной криозащитной среды целесообразным, по-видимому, является использование протекторов, обладающих выраженным стимулирующим действием антиоксидантных систем клеток: глицерин, ГМБТОЭМ, желатин-16000, – а также веществ, повышающих устойчивость клеток к гипоксии: фумарат натрия и ОМЭПС. Последний в концентрации 0,15% способен также ингибировать ПОЛ.

Установлено, что при воздействии на мембраны лейкоцитов комбинированных криозащитных растворов характер ответной реакции отличается от воздействия одного компонента, что, возможно, связано с образованием особых комплексов из ингредиентов консервантов, воды и биополимеров мембран. Во всех случаях, когда сохранность клеток после отогрева была на уровне выше 75%, использованы комбинированные консерванты, не вызывающие у лейкоцитов активацию процессов ПОЛ.

Очевидно, что оценка степени влияния криоконсервантов на ПОЛ и АОА у клеток при разработке методов криоконсервирования позволит сделать прогноз об эффективности их применения для замораживания биообъектов.

При отрицательной температуре –10°С внеклеточная и все виды внутриклеточной (свободная, связанная, фиксированная) воды не замерзают и метаболизм в клетках имеет незначительное замедление. С учетом сказанного в состав криозащитных растворов для –10°С включены протекторы: глицерин, гидролизат пищевого желатина (со средним молекулярным весом 16000 и 20000) и нетоксичный пектиновый полисахарид лемнан, который характеризуется высокой способностью к образовании вязких водных растворов и к гелеобразованию ( и соавт., 2000).

Для повышения устойчивости клеток к гипоксии и реализации механизмов антиокислительной защиты липидов использован ОМЭПС.

На начальном этапе исследования опытным путем проведен подбор оптимальных концентраций указанных компонентов. Положительно зарекомендовали себя 7 вариантов хладоограждающих растворов.

Растворы №1-4 при охлаждении не замерзают, а образуют гель, что способствует стабилизации кристаллизации воды и предотвращает ее спонтанность. Указанная особенность обусловлена присутствием в среде желатина - линейного высокоасимметричного полипептидного полимера белковой природы (, , 2006).

Остальные 3 раствора (№5-7) при охлаждении образуют лед, однако в их составе содержится пектин лемнан, который может быть матрицей для образования мелких кристаллов льда. В природе широко распространены биологические нуклеирующие агенты, действующие как катализаторы кристаллизации при температуре выше –10°С (, , 2011). Наиболее полно в данном аспекте изучены нуклеаторы белковой природы у бактерии, грибов и животных. Сведения о нуклеаторах растительного происхождения (возможно пектинов) единичны, что может быть связано с трудностью их выделения.

Установлено, что при охлаждении клеток по нелинейным программам в хладоограждающих растворах №2, №4, №6 и хранении биообъекта в течение 1 суток при –10°С показатели сохранности клеток в большей степени соответствуют исходному уровню.

На следующем этапе исследования установлены допустимые сроки хранения клеток в указанных растворах. Показано, что большинство показателей жизнеспособности сохраняются на исходном уровне в криоконсерванте №2 - 7 суток, №4 - 5 суток, №6 - 1 сутки. При этом количество фагоцитарноактивных нейтрофилов, которое является главным критерием оценки сохранности функции гранулоцита, после отогрева остается на уровне выше 70% (от исходного) в опытах с раствором №суток, раствора №4 - 9 суток, а раствора №6 - 2 суток. Следовательно, применение незамерзающих растворов №2 и №4 является более эффективным, чем замерзающего - №6.

Показано также, что раствор №2 повышает интенсивность ПОЛ у лейкоцитов до замораживания примерно в 1,2 раза, а АОА - в 1,9 раза и сохраняет данные значения в течение 12 суток экспозиции клеток в нем при –10°С. В опытах с раствором №4 исходно уровни ПОЛ и АОА снижаются в 1,4 и 1,7 раза, однако через 9 суток хранения (срок наблюдения) уровень ПОЛ повышается в 1,2 раза, а АОА в 1,5 раза. В каждом случае у отогретых клеток отмечается более высокий уровень АОА, чем интенсивность процессов перекисного окисления, что позволяет клеткам оставаться жизнеспособными.

Следует отметить, что основным ингредиентом растворов №2 и №4 является глицерин (ЛД50 = 4,57±0,14 к/кг м. т; Andersen K. C. et al., 1950) в исходной концентрации 7%, которая является слаботоксичной (не требует отмывания перед применением) и, по результатам полученных исследований, достаточной для проявления свойств данного протектора: легко проходить через клеточные мембраны (при +22°С), поддерживать переохлажденное состояние клетки, обеспечивать действие противосолевого буфера, уравнивать осмотическое давление по обе стороны мембраны. Кроме того, данный протектор эффективнее защищает клетки при медленном охлаждении, которое применялось в работе. С учетом незначительного замедления метаболизма в клетках при –10°С для «профилактики» гипоксии применен ОМЭПС в исходной концентрации 0,3%. Однако совместное использование глицерина и ОМЭПС ( и соавт, 2008) в указанных концентрациях обеспечивает сохранность (n=10, М±σ) при данной температуре в течение 1 суток 90,3±1,7% (от исходного уровня) лейкоцитов, у 96,2±1,5% отогретых клеток отмечается устойчивость к эозину, сохранность гранулоцитов составляет лишь 57,2±2,6%. Определить способность нейтрофилов к фагоцитозу после отогрева оказалось невозможным в связи с разрушением их ядерной мембраны.

В связи с этим для повышения эффективности глицерина и ОМЭПС использованы лемнан и желатин, вещества, которые не проникают в клетку по причине большого молекулярного веса и связывают молекулы внеклеточной воды, также «оттягивая» на себя воду из клетки. Согласно теории (1981) вещество, обладающее функциональными группами (-OH, -COOH, -CH3, =S=O, -(CH2-CH2O)-OH, др.) может оказывать криозащитное действие. Лемнан содержит радикалы -OH (как и глицерин) и - СООН (как и желатин). Установлено, что указанные вещества повышают криозащитный эффект смеси глицерина с ОМЭПС. Однако с увеличением их молекулярного веса отмечается снижение криопротекторного действия в ряду: желатин (16 000) - желатин (20 000) - лемнан (400 000). Причем, увеличение концентрации последнего не влияет на сохранность клеток.

Таким образом, для эффективного консервирования ядросодержащих клеток при температуре переохлаждения целесообразным является нелинейное охлаждение биообъекта в незамерзающем нетоксичном криозащитном растворе №2, содержащем глицерин (в исходной концентрации 7%), желатин со средней молекулярной массой 16 000 (7,5%) и ОМЭПС (0,3%). Указанный раствор в лучшей степени, чем остальные исследуемые растворы, способствует повышению криоустойчивости клеток при температуре –10°С, что связано с возможностью снижения концентрации проникающего криопротектора в криоконсерванте и ослаблением постгипертонического стресса при размораживании.

Показано (, 2004), что в диапазоне температур от –15°С до –20°С процессы метаболизма в клетках имеют малое замедление, т. к. происходит кристаллизация только внеклеточной воды и свободной внутриклеточной, в то время как связанная и фиксированная вода остаются в незамерзшем состоянии. Следовательно, для эффективного консервирования лейкоцитов при указанной температуре необходимо наличие в замораживаемой среде не только протекторов, замедляющих скорость образования кристаллов и изменяющих их структуру при данной температуре, но и веществ, обладающих противогипоксическим и антиоксидантным действием.

Следует отметить, что криозащитный раствор №2, который хорошо зарекомендовал себя при –10°С, не может быть использован при более низких температурах, что связано с холодовой денатурацией его основного компонента - гидролизата пищевого желатина.

В связи с этим для включения в состав новой хладоограждающей среды были выбраны глицерин (в нетоксичной концентрации), лемнан и вещество, обладающее смешанным криопротекторным действием - ГМБТОЭМ. Предполагается, что в используемых комбинированных средах каждый криопротектор будет проявлять свое защитное свойство при свойственных ему низкотемпературных условиях, что в итоге позволит устранить несколько причин повреждения разных популяций лейкоцитов и обеспечит аддитивную криопротекторную эффективность комбинированного криоконсерванта. Для повышения устойчивости клеток к гипоксии и ингибирования в составе растворов ПОЛ использован ОМЭПС.

Эффективность ГМБТОЭМ впервые показана в 1987 году при криоконсервировании (–196°С) клеток костного мозга. Данное вещество образует связи со структурными компонентами мембраны, что повышает ее устойчивость к повреждающему действию кристаллов, а также, частично проникая в клетку, связывает воду и способствует образованию преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании. ГМБТОЭМ является также хорошим растворителем, что способствует поддержанию концентрации солей в межкристаллических пространствах на физиологически допустимом уровне и, следовательно, защищает клетки от неблагоприятного воздействия гиперконцентрации солей и денатурации клеточных белков. Его двойное (экзо - и эндоцеллюлярное) криопротекторное действие обусловлено размером молекул (378) и наличием функциональных групп: оксиэтильных (CH2-CH2-O-), гидроксильных (-OH), метильных (-CH3). Отсутствие циклических групп, обуславливает его низкую токсичность (ЛД50=15,5±0,6 г/кг массы мыши).

После проведенных предварительных испытаний более тщательному изучению криозащитных свойств подвергнуты 4 консерванта, отличающиеся природой и концентрацией компонентов.

Установлено, что хладоограждающий раствор №9, содержащий в исходной концентрации ГМБТОЭМ - 28% и ОМЭПС - 0,15% в отношении ядерных клеток крови проявляет лучший криозащитный эффект, чем раствор с меньшей (№8) или с большей (№10) концентрацией указанных ингредиентов, а также раствор (№11), содержащий глицерин (7,0%) и лемнан (0,2%).

Показано, что криозащитный раствор №9 способен обеспечить сохранность ядросодержащих клеток при –20°С в течение 21 суток. Данный срок обозначен на основании результатов сохранности гранулоцитов и способности нейтрофилов к фагоцитозу, а также дополнительных исследований. В частности, установлено, что содержание микробицидных белков в нейтрофилах после 21 суток холодового воздействия (–20°С) достоверно не изменяется - исходный уровень среднего цитохимического коэффициента составляет 2,3±0,6 у. е (n=10, М±σ), после отогрева - 1,9±0,4 у. е.

Установлено также, что содержание растворенного в биосреде кислорода через 21 сутки нахождения лейкоцитов при указанной отрицательной температуре снижается (p<0,05), что свидетельствует о наступлении гипоксии. Однако уровень ПОЛ и антиоксидантный потенциал клеток достоверно не отличаются от исходного. Можно предположить, что стабильный уровень прооксидантно-антиоксидантного равновесия при данном холодовом воздействии указывает на нахождение клеток в стадии долговременной адаптации.

Интерес представляет то, что раствор №9 обеспечивает сохранность в течение 21 суток популяции Т-лимфоцитов (согласно активности CD3), но не способен повысить криоустойчивость В-лимфоцитов (по CD22). Тогда как известно (, , 1994), что Т-лимфоциты являются более чувствительными к замораживанию (–80°С; –196°С), отогреву и осмотическому шоку. Следовательно, предложенная технология обеспечивает сохранность не только клеток, способных к неспецифическому (фагоциты) иммунному ответу, но и к специфическому (Т-лимфоциты).

Таким образом, нелинейное замораживание биообъекта в криозащитном растворе №9, содержащем ГМБТОЭМ (в исходной концентрации 28%) и ОМЭПС (0,15%) позволяет обеспечить структурно-функциональную сохранность лейкоцитов при –20°С в течение 21 суток.

Температура –40°С характеризуется неустойчивой кристаллизацией связанной внутриклеточной воды и самое незначительное нарушение температурного режима может стать губительным для замороженной клетки. Поэтому количество ингредиентов для поиска эффективной комбинации хладоограждающего раствора в данной серии исследований было большим, чем при других.

Использованы протекторы разного действия: эндоцеллюлярные - глицерин и ПД, экзоцеллюлярный - ГЭК, смешанного действия - ГМБТОЭМ.

ПД являясь двухатомным спиртом, легко проникает в клетки и за счет своих функциональных групп (-ОН; СН3+-) связывает фракции свободной и связанной воды, тем самым снижая эвтектическую температуру замерзания и способствуя формированию мелкозернистых кристаллов льда. Кроме того, он связывает и соли, защищая мембраны от гиперосмотического шока. Его токсичность гораздо ниже, чем глицерина (ЛД50=13 мг/кг массы крысы, , 1994). Данное вещество обладает также слабым антиоксидантным и антибактериальным действием.

ГЭК образует водородные связи с водой и стабилизируют ее решетку, при этом структурированность воды изменяется, и в процессе замораживания повышается способность ее молекул формировать аморфные кристаллы льда (, , 1994). Оказывает также стабилизирующее влияние на плазматическую мембрану и является биологически инертным препаратом, не токсичен, в РФ используется как трансфузионная среда.

Для защиты клеток от гипоксии в случае активации метаболизма в замороженной клетке при незначительном повышении температуры окружающей среды в составе растворов использованы ОМЭПС и фумарат натрия. Кроме того, применяли следующие компоненты: хлорид холина - представитель комплекса витаминов группы «В», который входит в состав фосфолипида лецитина и обладает мембранопротекторным действием; глюкозу, которая обладает слабым эндоцеллюлярным криопротекторным действием и регулирует осмотические и метаболические процессы в клетках, способствует их эффективной репарации; лимонную кислоту - для нейтрализации основной реакции раствора и как необходимое звено в системе биохимических реакций клеточного дыхания, реализующее энергетический метаболизм клетки (, 1980).

В результате исследованы структурно-функциональные параметры клеток, замороженных в 7 криозащитных растворах. Установлено, что большей криоустойчивостью к факторам холодового воздействия обладают лейкоциты, замороженные в хладоограждающем растворе №13, содержащем ГМБТОЭМ в концентрации 30%, фумарат натрия 2,8% и лимонную кислоту 0,06%. По эффективности ему незначительно уступает раствор №16, ингредиентами которого являются криопротекторы глицерин (4,8%) и ГЭК (5,7%), а также ОМЭПС (0,1%). Менее эффективен хладоограждающий раствор №18, содержащий ПД (21%), ГЭК (4,7%), ОМЭПС (0,2%) и хлорид холина (1%), что указывает на целесообразность применения ГЭК совместно с глицерином, но не ПД.

Исследования длительности хранения клеток при –40°С в криозащитном растворе №13 показали, что возможным сроком являются 30 суток, после чего наблюдается существенное ухудшение показателей жизнеспособности клеток.

Согласно данным хемилюминограммы выявлено, что через 30 суток экспозиции биообъекта при –40°С не отмечается повышения ПОЛ и сохраняется высокий уровень АОА. Не изменяется также содержание растворенного в среде кислорода. Таким образом, в растворе №13 при исследуемой отрицательной температуре наблюдается стабильное замедление метаболизма в клетках и отсутствие гипоксии.

Кроме того, в исследуемом криозащитном растворе эффективно сохраняется популяция Т-лимфоцитов, что может представлять практический интерес при разработке способов криоконсервировании лимфоидной ткани.

Таким образом, замораживание лейкоцитов по нелинейной программе в хладоограждающем растворе №13, содержащем ГМБТОЭМ (в исходной концентрации 30%), фумарат натрия (2,8%) и лимонную кислоту (0,06%) обеспечивает структурно-функциональную сохранность лейкоцитов при -40°С в течение 30 суток. Применение криопротектора смешанного действия ГМБТОЭМ в качестве основного ингредиента криозащитного раствора является эффективным не только при –20°С, но и при –40°С.

Низкая температура –80°С характеризуется стабильной кристаллизацией воды, исключение составляет фиксированная фракция. В клетках, при этом, отмечается выраженное замедление метаболизма. Следовательно, в замораживаемой биосреде необходимо наличие протекторов, способствующих мелкокристаллической кристаллизации как внеклеточной, так и внутриклеточной воды. В связи с этим использованы протекторы разного действия: эндоцеллюлярные ДМСО и ПД, экзоцеллюлярный - ГЭК, смешанного действия - ГМБТОЭМ.

ДМСО легко проникает в клетки, образует комплексы с внутриклеточной водой (силы взаимодействия между молекулами протектора и воды в 1,5 раза больше, чем между молекулами воды) и ионными комплексами, реорганизует структуру образующего льда. ( и соавт., 1978). Является токсичным (для лабораторных мышей ЛД50 ДМСО - 3,8±0,1 г/кг м. т., Ashwood-Smith M. G., 1961), в связи с чем требуется коррекция сторону уменьшения концентрации дополнительной химической очисткой или совместным использованием с растворами декстрозы, полиглюкина, ГЭК или ГМБТОЭМ.

Составлены две комбинации веществ: ДМСО + ГМБТОЭМ + ОМЭПС (растворы №19-21) и ПД + ГЭК + сукцинат N-метиламмония натрия (№ 22-24). Последний, так же как и ОМЭПС, обладает антигипоксическим, антитоксическим и антиоксидантным действием (, 1997).

При изучении криозащитных свойств 6 растворов, отличающихся природой и концентрацией используемых ингредиентов, установлено, что высокие показатели жизнеспособности наблюдаются у клеток, замороженных по нелинейной программе в хладоограждающем растворе №20, содержащем в исходной концентрации ДМСО - 8%, ГМБТОЭМ - 22% и ОМЭПС - 0,2%.

Применение данного раствора позволяет сохранить ядерные клетки крови при –80°С в течение 180 суток (срок наблюдения). При этом количество Т - и В-лимфоцитов соответствует исходному. Таким образом, применение указанной технологии обеспечивает эффективную сохранность как клеток, реализующих реакции неспецифического иммунитета, так и клеток, ответственных за гуморальный и клеточный специфический иммунитет.

Содержание растворенного в биообъекте кислорода и через 1 сутки, и через 180 суток замораживания в растворе №20 не изменяется, что, наряду с благоприятными результатами жизнеспособности клеток, свидетельствует об эффективности выбранной криотехнологии.

Интерес вызывает характер колебаний уровня ПОЛ и АОА после отогрева через разные сроки хранения. Так, если через 1 сутки отмечается снижение ПОЛ и АОА, что, вероятно, связано с замедлением процессов метаболизма в связи с проявлением «псевдотоксического» эффекта ДМСО, то через 180 суток отмечается повышение активности антиоксидантных систем клеток на фоне сниженного ПОЛ, при этом уровень АОА достигает исходного (до замораживания с раствором) и, возможно, сдерживает активацию ПОЛ.

Для сравнения эффективности указанной технологии с традиционной (применение жидкого азота) в дополнительной серии исследований лейкоциты в криозащитном растворе №20 были заморожены по линейной программе в программном аппарате УОП 00.00.00 (Украина): на 1-м этапе со скоростью 1°C/мин от +22 до –7ºC, на 2-м этапе - 10°C/мин от –7 до –40°C, на 3-м этапе - 20°C/мин от –40 до –80°C. Общее время замораживания составило 37 мин. После этого образцы переносили для хранения в электроморозильник на –80ºС MDF-3086S «Sanyo» (Япония), где хранили в течение суток.

Установлено, что замораживание клеток по нелинейной программе способствует большей сохранности гранулоцитов и повышению количества нейтрофилов с гранулами диформазана, по остальным показателям различий не выявлено. Следовательно, оба режима замораживания являются альтернативными.

Необходимо отметить, что применение нелинейной технологии замораживания клеток требует меньших экономических затрат. (2003) показано, что на реализацию низкотемпературного (–80°С) консервирования гемопоэтических стволовых клеток по нелинейному режиму без учета стоимости криоконсерванта требуется в 2 раза меньше средств, чем на криоконсервирование по линейным программам с использованием жидкого азота (–196°С). себестоимость, соответственно, составила 33631,98 и 64083,82 $. При этом 98% себестоимости любого метода составляют затраты на технические средства, остальные 2% приходятся на оплату труда, затраты на электроэнергию, перевязочные средства и медикаменты.

Таким образом, для эффективного консервирования ядерных клеток при низкой температуре (–80°С) целесообразным является нелинейное замораживание биообъекта в криозащитном растворе №20, содержащем ГМБТОЭМ (в исходной концентрации 22%), ДМСО (8%) и ОМЭПС (0,2%). Применение указанной технологии обеспечивает сохранность лейкоцитов в течение 180 суток.

В заключении необходимо отметить, что эффективность комбинирования в замораживаемой биосреде криопротекторов разного действия показана также в отношении поливинилпирролидона и 1,2-пропандиола при криоконсервировании (–196°С) эритроцитов ( и соавт., 1996), а диметилсульфоксида и гидроксиэтилкрахмала при замораживании (–80°С) гемопоэтических клеток кордовой крови (Liu K.Y. et al., 2004), клеток поджелудочной железы (Maruyama M. et.al., 2004), стволовых клеток костного мозга (Luo K. et al., 1994) и при замораживании (–196°С) эритроцитов (, 2006). Положительный результат совместного криозащитного действиях эндо - и экзоцеллюлярных протекторов связан с тем, что оказываемый по отдельности каждой группой отрицательный криопротекторный эффект «нейтрализуется». Так, непроникающие протекторы структурируя воду, снижают температуру ее замерзания, однако могут привести к значительной дегидратации клеток и достижения ими критически минимального объема. Проникающие протекторы замедляют дегидратацию и концентрирование внешней среды, ослабляют повреждающее действие «эффекта растворов», однако снижение дегидратации способствует повышению вероятности формирования внутриклеточных кристаллов льда. Комбинирование в замораживаемой среде нескольких протекторов, позволяет снизить их концентрацию, а, следовательно, токсичность раствора, не теряя его эффективности. С практической точки зрения важным является то, что совместное действие проникающих и непроникающих протекторов значительно упрощает процедуру замораживания клеток ( и соавт., 2009), т. к. позволяет исключить контроль скорости замораживания (не требуется использование программного замораживателя) и позволяет хранить клетки не в жидком азоте (–196°С), а, например, при –80°С (Liu K.Y. et al., 2004; Maruyama M. et.al., 2004).

У эффективных криозащитных растворов изучены физико-химические и биологические свойства. При изучении влияния длительного хранения стерильных растворов №4, №9, №13 и №20 на их криозащитные свойства установлено, что все растворы по истечении срока хранения (45 суток при +60°С) остаются прозрачными, а изменение кислотности отмечается только в серии с раствором №20 (исходное значение рН=7,29; после хранения - 6,05), т. е. данный раствор необходимо готовить непосредственно перед процедурой замораживания.

Со всеми подвергнутыми хранению растворами были заморожены лейкоциты и выдержаны при соответствующих температурах (раствор №4 при -10°С; №9 при –20°С; №13 при –40°С; №20 при –80°С) в течение суток. Показано, что растворы №9, №13 и №20 сохраняют морфологическую полноценность клеток и их функциональную активность на том же уровне, что и соответствующий раствор, не подвергавшийся «старению». Функциональная активность лейкоцитов при хранении с использованием раствора №4 снижается, что, возможно, связано с гидролизом (+60°С) ингредиента раствора - желатина. Данное предположение нашло свое подтверждение в дополнительной серии исследований, в которой «ускоренному старению» подвергался раствор без желатина, последний добавляли в раствор непосредственно перед охлаждением клеток. Следовательно, раствор №4 необходимо готовить непосредственно перед процедурой охлаждения.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27