Оценка воспалительных изменений миокарда с помощью магнитно-резонансной томографии с контрастированием в сопоставлении с результатами эндомиокардиальной биопсии у больных с дилатационной кардиомиопатией (стр. 6 )

Общий объем контрастированного миокарда=Σ Площадь контрастированного участка * Толщина среза.

2.5. Коронароангиография с одномоментным выполнением ЭМБ из эндомиокарда ПЖ.

Коронароангиография (КАГ) проводилась по стандартной методике в лаборатории рентгеноэндоваскулярных методов лечения ИКК ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ (руководитель, профессор, д. м.н. ). Исследование выполнялось натощак с предварительной премедикацией больного. В течение всего исследования регистрировалась ЭКГ в 12 отведениях и измерялось АД на левом плече. ЭМБ проводилась правым феморальным доступом с помощью одноразовых гибких биопсийных щипцов 7-8 F (Cordis,USA) под рентгеноскопическим контролем при условии, что не было обнаружено гемодинамически значимого атеросклеротического поражения коронарного русла (меньше 50 %). В среднем осуществлялся забор 4 образцов эндомиокарда размерами от 1 до 2,5 мм² из правой части межжелудочковой перегородки (верхняя, средняя и нижняя треть). Одну часть каждого образца немедленно замораживали в жидком азоте для проведения иммуногистохимического исследования и ПЦР в реальном времени на ДНК парвовируса B19, человеческого вируса герпеса 1,2,6 типов, цитомегаловируса и вируса Эпштейна-Барр. Вторую часть каждого образца фиксировали в 10% нейтральном буферном растворе формалина для выполнения гистологического исследования.

Гистологическое и иммуногистологическое исследование образцов эндовмиокарда проводилось в отделе сердечно-сосудистой патологии ИКК ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ (руководитель д. м.н. ) в лаборатории патоморфологии сердечно-сосудистых заболеваний (руководитель д. м.н., профессор ).

2.6. Гистологическое исследование кардиобиоптатов.

Гистологические препараты готовились по общепринятой методике. Образец эндомиокарда заливали в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 5-7 мкм. В дальнейшем каждый срез окрашивали гематоксилином-эозином - для определения клеточного состава, трихромом по Массону - для изучения выраженности фиброза, Суданом III- для визуализации жировых клеток. Оценка воспалительных изменений в препаратах эндомиокарда проводилась согласно Далласским критериям [162]. Для характеристики воспалительных изменений применялись стандартизованные показатели - отёк, клеточная инфильтрация (качественная и количественная оценка состава клеточного инфильтрата) и некроз, фиброз, которые характеризуют стадии воспаления. Также проводился полуколичественный анализ степени фиброза и гипертрофии КМЦ.

2.7. Иммуногистохимический анализ кардиобиоптатов.

В работе были использованы коммерческие мышиные моноклональные антитела к активированным Т-лимфоцитам-CD 45RO, макрофагам -CD68+ , Т-клеткам-CD3 ,Т-хелперам -CD4+, Т-киллерам CD8+, (антитела к CD 45RO клон UCHL-1 и к CD68+ клон КР-1, Abcam Biochemicals, Великобритания; к CD3+ клон UCHT-1 , MP Biomedicals , Германия; CD4+ клон CLB-159, MP Biomedicals , Германия; CD8+ Сорбент, Россия). Для количественной оценки воспалительных клеток в миокарде применялись критерии Всемирной Федерации Сердца [26]. Активное воспаление в миокарде диагностируется при наличии в 1 мм²≥14 воспалительных клеток, включающие Т и В-лимфоциты, их активированные формы и до 4 –х макрофагов и некроза или дегенерации КМЦ. Хронический миокардит диагностируется при наличии инфильтрата ( не менее 14 лимфоцитов на 1 мм2 (главным образом Т-лимфоциты (CD45ro) или активированные Т-лимфоциты и до 4 макрофагов), некроз и дегенерация обычно не выражены, учитывается фиброз.

Иммунологические методы исследования и ПЦР в режиме реального времени проводились в Отделе нейрогуморальных и иммунологических исследований ИКК ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ (руководитель д. м.н., профессор ).

2.8. ПЦР в режиме реального времени (образцы эндомиокарда).

Все биоптаты эндомиокарда были исследованы на наличие вирусов Эбштейна-Барр(ВЭБ), вируса 6 типа (ВГЧ6), вируса герпеса 1-2 типов (ВПГ1-2), цитомегаловируса (ЦМВ)и парвовируса В19 с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. ПЦР для определение ДНК герпесвирусов и парвовируса B19 проводили с помощью тест-систем фирмы “Интерлабсервис”: “АмплиСенс EBV/CMV/HHV-6-скрин-FL” , “АмплиСенс HSV1-2”, “АмплиСенс Parvovirus B19-FL”. Использовали прибор для ПЦР-РВ “Rotor Gene 3000” и программное обеспечение к нему - “Rotor-Gene 6.0”. Для выделения ДНК из образцов эндомиокарда использовали набор реагентов фирмы “Интерлабсервис” – “ДНК-СорбБ”.

2.9. Определение концентрации вч-СРБ в плазме крови.

В основе метода измерения концентрации вч-СРБ лежит нефелометрический способ детекции. Принцип метода заключается в агрегации полиестероловых частиц, покрытых специфическими моноклональными антителами к человеческому С-реактивному белку (hsCRP Reagent), при смешивании с образцами сыворотки, содержащими данный белок. Образовавшиеся агрегаты рассеивают лазерный луч, проходящий через образец. Интенсивность рассеяния лазерного излучения пропорциональна концентрации данного белка в образце. Результат измерения сравнивается со стандартом (N Rheumatology standart SL) с известной концентрацией вч-СРБ, полученной с использованием международного референсного препарата ECR CRM 470. Измерение проводилось на анализаторе белков крови «Беринг Нефелометр» модели BN Pro Spec (Dade-Behring Marburg GmbH, Германия). За норму принимали концентрацию CRP≤3,0 мг/л.

2.10. Определение концентрации вч-Тропонина Т в плазме крови.

Определение уровня вч-Тропонина Т проводилось на автоматическом анализаторе Cobas 411(Roche Diagnostics ,Швейцария). В основе метода лежит иммуноферментный анализ (принцип «сэндвича»). Общая продолжительность анализа составляет 18 минут. Анализ состоит из нескольких этапов: 1-я инкубация: 50 мкл образца, биотинилированное моноклональное специфичное вч-Тропонин Т-антитело и моноклональное вч-Тропонин Т - специфичное антитело, меченое рутениевым комплексом вступают в реакцию с формированием сэндвич-комплекса. 2-я инкубация: после добавления микрочастиц, покрытых стрептавидином, образовавшийся комплекс связывается с твердой фазой посредством взаимодействия биотина и стрептавидина. Реакционная смесь аспирируется в измерительную ячейку, где микрочастицы оседают на поверхность электрода в результате магнитного взаимодействия. Затем с помощью ProCell/ProCell M удаляются не связавшиеся вещества. Далее приложенное к электроду напряжение вызывает хемилюминесцентную эмиссию, которая измеряется фотоумножителем. Результаты определяются с помощью 2х-точечной калибровочной кривой, полученной для данного инструмента, и референсной 5-точечной калибровочной кривой, данные которой сообщены в штрих-коде набора реагентов. Диапазон измерений: 3-10000 нг/л или пг/мл. Значения ниже предела измерения холостой пробы определяются как < 3 нг/л (пг/мл). Значения выше диапазона измерений определяются как > 10000 нг/л или пг/мл (или до 100000 нг/л (пг/мл) для образцов с 10-ти кратным разведением). За норму принимали концентрацию вч-Тропонина Т ≤3,0 пг/мл.

2.11.Определение концентрации NT-proBNP в плазме крови.

Определение концентрации NT-proBNP проводилось на автоматическом анализаторе Cobas 411(Roche Diagnostics ,Швейцария). В основе метода лежит иммуноферментный анализ (принцип «сэндвича»). Общая продолжительность анализа составляет 18 минут. Анализ состоит из нескольких этапов: 1-ая инкубация: Антиген в образце (15 мкл), биотинилированное моноклональное NT-proBNP-специфичное антитело и моноклональное NT-proBNP-специфичное антитело, меченое рутениевым комплексом, вступают в реакцию с формированием сэндвич-комплекса. 2-я инкубация: после добавления микрочастиц, покрытых стрептавидином, образовавшийся комплекс связывается с твердой фазой посредством взаимодействия биотина и стрептавидина. Реакционная смесь аспирируется в измерительную ячейку, где микрочастицы оседают на поверхность электрода в результате магнитного взаимодействия. Затем с помощью ProCell/ProCell M

удаляются несвязавшиеся вещества. Далее приложенное к электроду напряжение вызывает хемилюминесцентную эмиссию, которая измеряется фотоумножителем. Результаты определяются с помощью 2х-точечной калибровочной кривой, полученной для данного инструмента, и референсной

калибровочной кривой, данные которой сообщены в штрих-коде набора реагентов. Диапазон измерений: 5-35000 пг/мл или 0.6-4130 пмоль/л (определяется по значению нижнего предела обнаружения и максимальному значению референсной калибровочной кривой). Значения ниже предела обнаружения определяются как < 5 пг/мл (< 0.6 пмоль/л). Значения выше диапазона измерений определяются как > 35000 пг/мл (> 4130 пмоль/л) или до 70000 пг/мл (8277 пмоль/л) для образцов с 2-кратным разведением. За норму принимали концентрацию NT-proBNP ≤100,0 пг/мл.

3.Статистическая обработка данных.

Статистический анализ данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Excel 7,0 и статистических программ STATISTICA 6 (StatSoft Inc., США). Качественные величины представлены как абсолютные значения и проценты. Использовались следующие методы статистического анализа: двусторонний F–критерий Фишера, U-критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводился с применением рангового критерия Спирмена. Выборочные параметры, приводимые в таблице, представлены в виде M (sd) и Me [Lq;Uq], где M- среднее, sd- стандартное отклонение, Ме - медиана, Lq;Uq– межквартильный размах. За минимальный уровень значимости принято р<0,05.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ

III.1. Результаты магнитно-резонансной томографии сердца с контрастированием у больных ДКМП.

По данным МРТ сердца с контрастированием отёк и раннее контрастирование у больных ДКМП не регистрировались ни в одном из случаев, были выявлены только очаги отсроченного контрастирования.

Качественная и количественная оценка очагов отсроченного контрастирования в миокарде у больных ДКМП.

Всего было проанализировано 867 сегментов ЛЖ, в 70 сегментах (8%) выявлено отсроченное контрастирование (таблица 2). Очаги отсроченного контрастирования регистрировались у%) больных ДКМП. При визуальном анализе очагов отсроченного накопления КП в миокарде ЛЖ выделено несколько типов: субэпикардиальный (рис3А), интрамиокардиальный (рис 3Б, 4 Б), субэндокардиальный (рис 4А,5Б) и трансмуральный (рис 5А). Субэпикардиальный тип контрастирования обнаружен у 55% больных(11/20), интрамуральный тип - у 35 % (7/20), трансмуральный и субэндокардиальный типы встречались только в сочетании с другими вариантами (по 5% (1/20) (таблица 2). Участки отсроченного контрастирования были как единичными 70% (14/20), так и множественными 30% (6/20).

При детальном сегментарном анализе выявлено, что преимущественно очаги отсроченного контрастирования были локализованы в сегментах боковой стенки 40% (28) и МЖП 24,3% (17) (таблица 3,4). Следует отметить, что у пациентов, имеющих несколько участков отсроченного контрастирования, всегда была вовлечена боковая стенка ЛЖ (30%) (таблица 4).

По результатам количественного анализа медианы общей площади и общего объема контрастированных очагов у больных ДКМП составили 17,8 [8,5; 60,8] см² и 7,1 [3,4; 24,3] см³, соответственно.

Рис.3.A. Участок субэпикардиального отсроченного контрастирования в нижнебоковой стенке ЛЖ.

Б. Участок интрамиокардиального отсроченного контрастирования в МЖП.

Рис.4.A. Очаг отсроченного контрастирования в среднем сегменте МЖП субэндокардиальной локализации.

Б. Зона интрамиокардиального отсроченного контрастирования в МЖП.

Рис.5.A. Участок трансмурального отсроченного контрастирования в боковой стенке Л субэндокардиального отсроченного контрастирования в боковой стенке ЛЖ.

Таблица 2

Типы, локализация, объем и площадь очагов отсроченного контрастирования у больных ДКМП (n=20)

Примечание. Данные представлены в виде абсолютного числа пациентов (% от общего числа). Объем и площадь представлены в виде медианы (25; 75 процентиль).Mann-WhitneyU-test.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16