На правах рукописи
ПЕРИНАТАЛЬНОЕ ГИПОКСИЧЕСКИ-ИШЕМИЧЕСКОЕ ПОРАЖЕНИЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА У ДЕТЕЙ:
КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, МЕХАНИЗМЫ И МАРКЕРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОК НЕЙРОВАСКУЛЯРНОЙ ЕДИНИЦЫ
(клинико-экспериментальное исследование)
14.01.08 - Педиатрия
14.03.03 - Патологическая физиология, медицинские науки
Автореферат
на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Красноярск – 2014
Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. -Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра педиатрии ИПО, НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, кафедра биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор
доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
- доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой педиатрии с курсом неонатологии ФПК и ППС ГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Минздрава России
Манеров Фарок Каримович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой педиатрии и неонатологии ГБОУ ДПО «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей» Минздрава России
- доктор медицинских наук, руководитель лаборатории клинической патофизиологии и аллергологии НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр здоровья детей» Российской академии медицинских наук.
Защита состоится «29» мая 2014 года в 900 часов на заседании диссертационного совета Д 208.037.01, созданного на базе ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. -Ясенецкого» Министерства здравоохранения России
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. -Ясенецкого» Министерства здравоохранения России.
Автореферат разослан «__» ________ 2014 года
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 208.037.01
доктор медицинских наук, доцент
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Вопросы охраны здоровья плода и новорожденного, поиск путей повышения качества оказания медицинской помощи нельзя решать без углубленного исследования причин перинатальной патологии. В социальном аспекте особенно значима перинатальная заболеваемость, которая существенно сказывается на здоровье будущих поколений. Наибольшую опасность при этом имеют перинатальные поражения ЦНС, которые в периоде новорожденности составляют значительную долю (60-70%) в структуре неврологической патологии детского возраста. Актуальность и медико-социальная значимость проблемы перинатального гипоксически-ишемического поражения (ГИП) головного мозга (ГМ) обусловлены рядом обстоятельств: значительной частотой клинических случаев, отсутствием четких и однозначно трактуемых критериев для дифференцировки неврологической нормы и патологии, наличием пограничных и переходных состояний в периоде новорожденности, а также высоким риском летальных исходов ( и др., 2012; , 2006).
До настоящего времени остается открытым вопрос о распространенности и диагностике перинатальной гипоксически-ишемической патологии. Представления о рассматриваемой патологии существенно отличаются в нашей стране и за рубежом ( и др., 2006; и др., 2011). Согласно работам зарубежных авторов, гипоксически-ишемическая энцефалопатия у доношенных новорожденных встречается с частотой 1,8 - 25:1000. Российские эпидемиологические исследования свидетельствуют, что данный диагноз устанавливается у 712 пациентов из 1000 новорожденных (Thompson J. A. et al., 2011). Перинатальная гипоксия остается одной из ведущих причин младенческой смертности и инвалидности (, 2009; Volpe J. J., 2009).
На основании выше перечисленного, основными задачами специалистов-перинатологов являются: 1) внедрение информативных методов комплексной диагностики перинатальной гипоксически-ишемической патологии; 2) своевременное применение эффективной медикаментозной нейропротекции; 3) определение прогноза психомоторного развития ребенка; 4) разработка эффективной системы комплексной нейрореабилитации ( и др, 2011).
В клинической литературе часто не принимаются во внимание механизмы повреждения ЦНС, которые остаются в тени, становясь источником прогрессирования болезни и/или формированием последующей сопутствующей патологии (, 2011). Механизмы, по которым развивается гипоксическое повреждение, реализуются в результате сложного каскада патофизиологических процессов, конечным исходом которых является гибель клеток ( и др., 2006). В последние годы внимание исследователей привлекает регуляция деятельности нейроваскулярной единицы (НВЕ) как структурно-функционального комплекса, обеспечивающего гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и скоординированную активность нейронов, глии и эндотелия церебральных сосудов. Основные изменения при перинатальном ГИП ЦНС происходят именно с НВЕ. Окончательное формирование НВЕ не заканчивается в момент рождения. В постнатальный период продолжается развитие межклеточных коммуникаций и метаболическое сопряжение клеток ЦНС. Молекулярные механизмы перинатального повреждения ГМ имеют свои особенности, которые, однако, систематически не изучены до настоящего времени.
Нарушения, возникающие в НВЕ, приводящие к изменению проницаемости ГЭБ с формированием отека ГМ, играют ключевую роль в развитии патологических изменений, которые наблюдаются при перинатальном ГИП ГМ. При этом есть возможность разработки и использования стратегии нейропротекции при перинатальном ГИП ЦНС. Основа стратегии заключается в направленной модуляции активности и/или экспрессии механизмов обеспечивающих межклеточную коммуникацию и метаболическое сопряжение клеток ЦНС ( и др., 2006; Chaitanya G. V. et al., 2010).
В педиатрической практике наиболее актуальными являются вопросы, связанные с идентификацией молекул-маркеров повреждения НВЕ, механизмов патологической проницаемости ГЭБ, а также создание новых диагностических и терапевтических алгоритмов при ведении пациентов с перинатальным повреждением ГМ гипоксического генеза.
Цель исследования: изучить клинико-лабораторные проявления и нейросонографические признаки повреждения центральной нервной системы у новорожденных с гипоксически-ишемическим поражением головного мозга и на основе экспериментального моделирования межклеточных взаимодействий в нейроваскулярной единице идентифицировать новые молекулы-маркеры и молекулы-мишени для диагностики и терапии.
Задачи исследования:
1. Уточнить вклад анте - и интранатальных особенностей анамнеза ребенка в развитии церебральной ишемии различной степени тяжести, для установления наиболее значимых и управляемых причин развития данной патологии, а также определить клинические симптомокомплексы гипоксического поражения мозга.
2. Установить наиболее существенные нейросонографические признаки поражения ЦНС, характеризующие разную степень тяжести гипоксически-ишемического поражения ЦНС, с последующей корреляцией основных патологических проявлений с уровнем маркеров клеточной гибели.
3. Определить маркеры повреждения нейронов (NSE), глиальных клеток (GFAP) и эндотелиоцитов головного мозга (sPECAM-1) в периферической крови для оценки выраженности клеточных повреждений при разной степени тяжести гипоксически-ишемического поражения ЦНС; сопоставить клинико-анамнестические, параклинические и биохимические показатели для уточнения наиболее вероятных механизмов развития изучаемой патологии и прогнозирования исходов заболевания.
4. Изучить особенности экспрессии в клетках нейроваскулярной единицы CD38, Cx43, Pgp, SLC в динамике постнатального развития экспериментальных животных в норме и после перенесенного перинатального гипоксически-ишемического повреждения головного мозга in vivo.
5. Оценить особенности экспрессии CD38, Cx43, Pgp, SLC в клетках нейроваскулярной единицы в оригинальной модели in vitro в норме и после перенесенного перинатального гипоксически-ишемического повреждения головного мозга.
6. Выявить особенности функционального сопряжения клеток НВЕ, опосредованных Cx43, в физиологических условиях и при гипоксии-ишемии, уточнить роль Cx43 в патогенезе перинатального гипоксически-ишемического поражения.
7. Дополнить существующую концепцию патогенеза гипоксического повреждения развивающегося мозга с учетом вклада CD38- , Cx43-, Pgp - и SLC-опосредованных механизмов межклеточной коммуникации в развитие феномена эксайтотоксичности, патологической проницаемости гематоэнцефалического барьера, нейровоспаления и эндотелиальной дисфункции.
Научная новизна. Получены новые данные об особенностях изменения уровней маркеров повреждения клеток нейрональной, астроглиальной и эндотелиальной природы, а также маркера эффективности нейрон-астроглиального метаболического сопряжения в периферической крови детей, перенесших перинатальное повреждение головного мозга, во взаимосвязи с клиническими проявлениями неврологической дисфункции.
Впервые экспериментально доказано участие CD38, Cx43, Pgp, SLC в повреждении и дизрегуляции нейрон-астроглиального метаболического сопряжения при перинатальном поражении головного мозга, а также изучены новые молекулярные механизмы межклеточных взаимодействий, актуальных для развития ишемического повреждения развивающегося мозга.
Разработан новый протокол получения клеток НВЕ/ГЭБ из прогениторных клеток головного мозга in vitro.
Изучены новые механизмы повреждения развивающегося головного мозга, связанные с нарушением нейрон-астроглиальных взаимодействий и развитием эндотелиальной дисфункции, что открывает перспективы создания новых эффективных фармакотерапевтических технологий нейропротекции и нейрорегенерации.
Практическая значимость работы. Применение комплексной оценки уровня NSE, GFAP, sPECAM-1 и глутамата в периферической крови детей, перенесших перинатальное повреждение головного мозга, может быть рекомендовано в качестве диагностического подхода при определении степени тяжести повреждения ЦНС и эффективности проводимой терапии.
Данные о молекулах-маркерах повреждения клеток нейроваскулярной единицы могут быть использованы для разработки новых диагностических протоколов в неонатологии.
Полученные данные о молекулах-мишенях повреждения нейроваскулярной единицы головного мозга могут быть полезны при разработке новых лекарственных средств с нейротропной активностью и при оптимизации существующих протоколов нейропротекции в педиатрической практике.
Разработанная модель нейроваскулярной единицы/ гематоэнцефалического барьера in vitro предложена к использованию для решения фундаментальных и прикладных задач нейрофармакологии, неврологии, патологической физиологии, молекулярной и трансляционной медицины.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Перинатальное ишемическое повреждение головного мозга у детей ассоциировано с действием неблагоприятных интранатальных факторов, из которых наиболее значимыми являются: экстренное кесарево сечение, преждевременная отслойка плаценты, дородовое излитие околоплодных вод, что вызывает повреждение клеток нейроваскулярной единицы с сопутствующим нарушением целостности гематоэнцефалического барьера и ликвородинамики.
2. На основании клинических и нейросонографических данных ведущими неврологическими проявлениями перенесенной церебральной ишемии в острый период следует считать нарушения сознания, мышечного тонуса, судорожный синдром, симптомы угнетения, а также нарушения ликвородинамики.
3. Характер изменения уровней белков, маркирующих повреждение клеток нейроваскулярной единицы, в периферической крови детей, перенесших перинатальное ишемическое повреждение головного мозга, соответствует степени тяжести повреждения, особенностям клинической картины и патологических изменений в структурах и ликворопроводящих путях головного мозга и может быть использован в оценке степени тяжести церебральной ишемии.
4. Повреждение клеток нейроваскулярной единицы при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении головного мозга сопровождается изменением экспрессии молекул транспортных систем и молекул, участвующих в реализации механизмов нейрон-астроглиального метаболического сопряжения.
5. Применение оригинальной модели нейроваскулярной единицы in vitro позволяет оценить характер повреждения механизмов межклеточной коммуникации и определить молекулы-маркеры патологических процессов, а также молекулы-мишени для фармакотерапевтического воздействия.
Внедрение в практику.
Результаты диссертационного исследования, внедрены в отделении реанимации и интенсивной терапии, отделении патологии новорожденных и недоношенных детей ККГБУЗ ККДБ (дополнительные критерии диагностики церебральной ишемии у новорожденных детей с использованием динамического определения-концентрации нейроспецифических белков в сыворотке крови, методические рекомендации: «Особенности анемического синдрома у новорожденных с церебральной ишемией»), в учебный процесс кафедры педиатрии института последипломного образования КрасГМУ, учебный процесс кафедры биохимии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии (курс «Нейробиология развития» для последипломного образования (аспиранты), научный процесс НИИ молекулярной медицины и патобиохимии.
Апробация результатов исследования.
Основные положения работы были доложены и обсуждены на I международной 3D онлайн-конференции «Фундаментальная медицина: от скальпеля - к геному, протеому и липидому» (Казань, 2011), Школе молодых ученых «Экспериментальные модели заболеваний центральной нервной системы» в рамках выездного Пленума проблемной комиссии «Фундаментальные вопросы нейронаук» Научного Совета РФ по неврологии (Красноярск, 2011), III Съезде физиологов СНГ (Украина, Ялта, 2011), XV Конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2011), международном конгрессе «BITs 2nd Annual World Congress of NeuroTalk» (Dalian, China, 2011), X Всероссийской научно-технической конференции «Приоритетные направления развития науки и технологий» (Тула, 2011), X Российском конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» и II Конгрессе детских врачей союзного государства (Москва, 2011), VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012), ежегодных российско-японских семинарах «Интегративные нейронауки» (Красноярск, ), XXII съезде физиологического общества им. (Волгоград, 2013), научных семинарах НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. -Ясенецкого (Красноярск, ).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 44 печатных работ, в том числе 17 статей - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, опубликована 1 глава в зарубежной монографии, получен 1 патент, 2 методические рекомендации.
Работа выполнена при поддержке грантов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (соглашение № 000, гг.), Президента РФ для поддержки научных исследований молодых кандидатов наук (МК-4818.2012.7 и МК-6907.2012.7), Российского фонда фундаментальных исследований ( р_сибирь_а), Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (9398р/15184) Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности (Дополнительное соглашение № 1/12 от 04 июля 2012 г. к Соглашению № 11 от 12 августа 2009 г).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 392 источников (80 отечественных и 312 иностранных). Диссертация иллюстрирована 32 таблицами и 21 рисунком.
Личный вклад автора. Научные результаты, обобщенные в диссертационной работе, получены самостоятельно. Выполнено лично: определение цели, разработка конкретных задач работы и плана их выполнения; составление протоколов клинического, лабораторного исследований (результаты с использованием модели перинатального гипоксически-ишемического повреждения получены совместно с к. м.н. ); набор клинического материала - динамическое клиническое обследование пациентов (совместно с к. м.н., , зав. отделением патологии новорожденных и недоношенных детей перинатального центра Красноярской краевой клинической детской больницы); проведение иммуногистохимических исследований; разработка и создание модели нейроваскулярной единицы in vitro; статистическая обработка материала исследований, интерпретация результатов; написание публикаций, автореферата и текста диссертации.
СОДЕРЖАНИЕ И ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
Работа выполнена в ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. -Ясенецкого Минздрава России (ректор - доктор медицинских наук, профессор ) на кафедре педиатрии института последипломного образования (заведующий кафедрой - доктор медицинских наук, профессор ) и научно-исследовательском институте молекулярной медицины и патобиохимии (руководитель НИИ - доктор медицинских наук, профессор, проректор по инновационному развитию и международной деятельности ).
Во введении обоснована актуальность исследования, представлены его цель, задачи, раскрыты научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы положения, выносимые на защиту.
Глава 1. В главе представлен обзор литературы по разделам: 1.1 Современные представления о развитии головного мозга. 1.2 Структура и развитие нейроваскулярной единицы головного мозга. 1.3 (Пато)физиология нейроваскулярной единицы и гематоэнцефалического барьера. 1.4 Перинатальное ишемическое повреждение головного мозга: этиология, распространенность. Современные протоколы ведения пациентов: достоинства и недостатки. 1.5 Современные представления о патогенезе перинатального ишемического повреждения клеток нейроваскулярной единицы головного мозга. 1.6 Модели нейроваскулярной единицы и гематоэнцефалического барьера.
Глава 2. Объект и методы исследования. В главе дано описание особенностей проведения исследования. Исследование состоит из клинической и экспериментальной частей.
Объект и методы клинической части исследования
Объект исследования - новорожденные дети в возрасте от 0 до 28 дней жизни, всего 70 детей. Гестационный возраст детей целевой группы варьировал от 38 до,4±1,4) недель. Масса тела при рождении варьировала от 2900 до 4±98,9) гр.
Критерии включения в целевую группу: доношенные новорожденные дети в возрасте 0-28 суток, находившиеся в условиях стационара с диагнозом «Церебральная ишемия» разной степени тяжести, подписание родителем согласия на госпитализацию, диагностику и лечение.
Критерии исключения: родовая травма центральной нервной системы, внутриутробная инфекция, наследственные заболевания, метаболические и токсические поражения головного мозга, грубые пороки развития, билирубиновые энцефалопатии, гемолитическая анемия, кровопотери.
Дети, включенные в исследования, были разделены на группы:
1 группа - новорожденные с церебральной ишемией 1 степени (n=10),
2 группа - новорожденные с церебральной ишемией 2 (n=36),
3 группа - новорожденные с церебральной ишемией 3 степени (n=24).
Для решения поставленных задач применен комплекс клинических, ультразвуковых и лабораторных методов исследования. Наряду с ежедневным динамическим наблюдением за больными, в качестве дополнительного материала использовались: анализ медицинской документации детей (истории болезни пациентов, амбулаторные карты), оценка анамнестических данных, общие методы исследования: (клинический и биохимический анализ крови, общий анализ мочи), клиническое обследование новорожденных с оценкой неврологического статуса, нейросонография (в ранний и поздний неонатальные периоды), регистрация нейронспецифической енолазы (NSE, нг/мл), глиального фибриллярного белка (GFAP, нг/мл), уровня sPECAM-1 (нг/мл) и глутамата (нг/мл) в сыворотке крови новорожденных.
Нейросонография выполнялась на ультразвуковом сканере ALOKA -500 с датчиком 3,5 МГц. Оценивались размеры ликворопроводящих путей, наличие отеков коры, перивентрикулярного пространства (ПВП) и субкортикальных структур головного мозга, кровоизлияний.
Определение концентрации NSE, GFAP, sPECAM-1 проводили методом иммуноферментного анализа по стандартному протоколу с использованием набора реактивов фирмы-производителя Bender Medsystems (США) на базе РЛДЦ ИХМИ. Уровень глутамата определяли методом спектрофотометрии с использованием набора фирмы Abcam (Glutamate Assay Kit, ab83389) согласно протоколу фирмы-производителя.
Объект и методы экспериментальной части исследования.
Экспериментальная часть исследования проводилась с использованием моделей in vivo и in vitro. Объектом экспериментальной части исследования in vivo явились белые беспородные крысы (n=120) обоего пола со средней массой 10-18 г. Эксперименты на животных были одобрены биоэтической комиссией Локального этического комитета КрасГМУ и проводились согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 01.01.2001г. № 000). Опытную группу составили крысы (n=80), которым проводилось моделирование патологического поражения (перинатального гипоксически-ишемического поражения ГМ). Так как головной мозг животных извлекался через 4, 8, 72 часа, 10 суток и 3 недели после моделирования перинатального ГИП было сформировано 5 опытных подгрупп (n=16 в каждой подгруппе): Р7`, P7, P10, P17, Р28 соответственно (Р - день постнатального развития).
Контрольную группу (n=40) составили животные, которым провели ложную операцию. Подгруппы (по 8 животных в каждой) соответствовали контролю - Р7`, P7, P10, P17, Р28. Методы исследования включали оценку неврологического статуса животных, микроскопические и иммуногистохимические исследования срезов головного мозга.
Моделирование гипоксически-ишемического поражения головного мозга in vivo осуществлялось по методике J.Rice (Rice J. et al., 1981). Через 4, 8, 72 часа, 10 и 28 суток после извлечения животных из атмосферы с низким содержанием кислорода у животных обеих групп производился забор биологического материала для последующих исследований. Животные подвергались воздействию наркоза, декапитации, извлечением ГМ, переносом его в 40% раствор формальдегида и последующим приготовлением препаратов тонких замороженных срезов.
Оценка неврологического статуса животных осуществлялась с использованием международной шкалы Neurological Severity Score (NSS) для лабораторных животных (Chen J. et al., 2001). Суммарная оценка теста: умеренное повреждение - 1-6 баллов; повреждение средней тяжести -7-12 баллов; тяжелое повреждение - 13-18 баллов (Speiser Z. et al., 2007).
Модель нейроваскулярной единицы in vitro содержала три вида клеток: нейроны, астроциты, эндотелиоциты. Материалом для создания модели НВЕ служили прогениторные клетки головного мозга эмбрионов крыс, из которых культивировались нейросферы с последующей дифференцировкой в астроциты и нейроны. Эндотелиоциты выделялись из сосудов головного мозга крыс.
Получение первичной тканевой культуры клеток ЦНС и начальной культуры крысиных нейросфер проводили из крысиных эмбрионов гестационного возраста Е15-E18 (E0 - день имплантации в стенку матки). Головной мозг эмбрионов извлекли согласно процедуре диссекции описанной в источнике (Julio E., 1998). Полученные прогениторные клетки в количестве 6x104-1,2x105 жизнеспособных клеток/мл засевали в культуральные флаконы T-25 см2 в 10 мл пролиферативной среды NeuroCult® NS-A Proliferation (StemCell, Канада). Инкубация клеток проводилась в условиях CO2-инкубатора при 5% CO2 и температуре 37°C.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 |
