Перинатальное гипоксически-ишемическое поражение головного мозга у детей: клинические особенности, механизмы и маркеры повреждения клеток нейроваскулярной единицы (стр. 8 )

Экспрессия SLC1А5 была зарегистрирована на астроцитах и нейронах, но не на эндотелиоцитах. При этом во всех подгруппах контрольной группы доля нейронов и астроцитов экспрессирующих изучаемый транспортер была практически одинакова (таблица 10). Через 8 часов после ГИП происходит десятикратное увеличение экспрессии SLC1А5 на нейронах, которое через 10 дней сменяется резким снижением и становится ниже контрольных значений (р<0,01). В это же время происходит пятикратное увеличение экспрессии SLC1А5 на астроцитах, которое сохраняется высоким намного дольше, чем на нейронах, до 10 суток (р<0,05). Снижение до контрольных значений наступает к 28 суткам постнатального развития. Изменения экспрессии транспортера глутамина SLC1A5 в клеточной модели НВЕ in vitro принципиально не отличаются от результатов полученных in vivo. В условиях острой гипоксии происходит пятикратное увеличение экспрессии SLC1A5 на нейронах и астроцитах (р<0,01).

В контрольной группе у крыс разного возраста уровень соэкспрессии EAAT2 и GFAP оставался на одном уровне - в 40-60% клеток в популяции. В группе животных, перенесших ГИП, наблюдается разнонаправленное изменение экспрессии транспортера глутамата EAAT2. Изменения экспрессии глутаматных транспортеров на астроцитах in vivo носят разнонаправленный характер. В первые 8 часов наблюдается резкое уменьшение, а с 3 по 10 сутки увеличение EAAT2-позитивных клеток. Нормализация показателя экспрессии EAAT2 наблюдается к 28 суткам постнатального развития. В группе контроля динамических изменений не было. В модели НВЕ in vitro в условиях гипоксии на астроцитах происходит аналогичное уменьшение экспрессии EAAT2.

Итак, первыми клетками, которые реагируют при ГИП, являются астроциты. Уже через 4 часа в большом количестве в них регистрируется значительное увеличение экспрессии Pgp. К 3-м суткам после ишемического повреждения регистрируется максимальное увеличение экспрессии Pgp в нейронах и эндотелиоцитах, причем эндотелиоциты являются клетками с самым длительным повышением экспрессии Р-гликопротеина.

Через 8 часов после ГИП в клетках НВЕ происходит десятикратное увеличение экспрессии транспортера глутамина в нейронах, которое через 10 дней сменяется резким снижением и становится ниже контрольных значений. В это же время увеличивается экспрессия SLC1А5 в астроцитах и сохраняется повышенной до 10 суток после ГИП, снижаясь к 4 неделе после повреждения.

Изменения экспрессии глутаматных рецепторов на астроцитах носят разнонаправленный характер: в первые 8 часов наблюдается уменьшение, а с 3 по 10 сутки - увеличение EAAT2-иммунопозитивных клеток, с последующей нормализацией экспрессии к 28 суткам постнатального развития.

В целом, анализируя полученные данные, можно сказать, что при ишемическом перинатальном повреждении в клетках НВЕ наблюдаются изменения, свидетельствующие о нарушении механизмов нейрон-астроглиального метаболического сопряжения и эндотелиоцит-контролируемых механизмов проницаемости ГЭБ. В частности, значимыми следует признать изменения экспрессии Pgp, как транспортера гидрофобных молекул и глутамин/глутаматных транспортеров, обеспечивающих захват и утилизацию глутамата из активированных нейронов астроцитами с последующим трансмембранным переносом глутамина в клетках нейрональной природы. В совокупности с данными об изменении экспрессии CD38 и Cx43, можно предположить, что нарушения нейрон-астроглиального метаболического сопряжения вносят существенный вклад в патогенез стресс-ответа клеток НВЕ в развивающемся мозге.

Локализация Pgp на клетках НВЕ играет роль в биодоступности различных веществ для ЦНС. Увеличение экспрессии Р-гликопротеина при перинатальном ГИП может носить протективный эффект, защищая нейроваскулярную единицу от избытка метаболитов, образующихся при гипоксии-ишемии внутри клеток, а также ограничивая проникновение ксенобиотиков из общего кровотока.

Интересной представляется роль Р-гликопротеина в развитии гидроцефалии, вазогенного отека головного мозга у крыс в возрасте 1-60 суток жизни. На модели гидроцефалии in vivo установлено, что у животных с гидроцефалией была понижена экспрессия и активность Pgp, по сравнению с контрольной группой животных (Deren K. E. et al., 2009). Кроме этого развитие гидроцефалии, а также усиление отека головного мозга наблюдалось у животных с отсутствием гена mdr1, ответственного за синтез Pgp. Один из механизмов увеличения экспрессии Pgp при патологии ЦНС - регуляторное действие субтоксических доз глутамата. При повышении концентрации глутамата происходит увеличение экспрессии гена mdr1 и активности Р-гликопротеина на часа, что приводит к понижению проницаемости ГЭБ (Zhu H. J. et al., 2004). Но при продолжающемся повышении концентрации глутамата, происходит повышение проницаемости (Collard C. D. et al., 2002).

Таким образом, роль Pgp не ограничивается только функцией экструзии ксенобиотиков и метаболитов. Р-гликопротеин активно участвует в ограничении отека, а его отсутствие или пониженная активность приводят к усилению вазогенного эффекта, образованию кистозных образований и формированию гидроцефалии. Однако, очевидно, что одновременно с протективным действием при перинатальном ГИП Р-гликопротеин оказывает и негативное действие, предотвращая проникновение лекарственных веществ к клеткам головного мозга.

Cx43-регулируемые механизмы функционирования НВЕ при ишемическом повреждении in vitro

Следующий этап экспериментальной части исследования проводился на клеточной модели НВЕ in vitro. Для определения роли коннексина-43 в межклеточной коммуникации, а также транспортных систем в энергетическом сопряжении клеток нейроваскулярной единицы иммуногистохимическим методом регистрировалась экспрессия изучаемых молекул в физиологических и патологических условиях (химическая гипоксия), в том числе, в присутствии блокатора активности коннексиновых каналов - карбеноксолона.

Было 4 варианта культивирования в следующих группах: I - контрольная (культивирование клеток в стандартных условиях), II - острая «химическая гипоксия», индуцированная йодацетатом натрия (50 мкМ конечная концентрация в среде, инкубация 30 минут в стандартных условиях) in vitro, III - клеточная культура с добавлением карбеноксолона (50 мкМ конечная концентрация в среде, инкубация 50 минут в стандартных условиях), IV - клеточная культура, на которой моделировали острую гипоксию в присутствии карбеноксолона.

Особенности экспрессии отдельных белков, участвующих в межклеточной коммуникации и метаболическом сопряжении клеток нейроваскулярной единицы, представлены в таблице 11.

Таблица 11 - Молекулы-транспортеры и регуляторы метаболического сопряжения в НВЕ при гипоксии in vitro (%)

Примечания: * - уровень значимостимежду группами р<0,05, критерий Манна-Уитни.

При острой гипоксии в нейронах наблюдается снижение экспрессии CD38 в 15 раз, что сопряжено с увеличением экспрессии Pgp и транспортера глутамина в 5 раз (р<0,01); в астроцитах - значительное увеличение экспрессии CD38 - в 15 раз, транспортера глутамина - 5 раз, Pgp - 3,6 раз, Сх43 - 2,8 раз (р<0,01). На эндотелиоцитах единственной молекулой, из числа изученных, отреагировавшей на действие химической гипоксии является Р-гликопротеин - зафиксировано увеличение в 1,5 раза. При добавлении в культуральную среду к исследуемым клеткам блокатора проницаемости Cx43 (карбеноксолона) зарегистрированы изменения экспрессии молекул, представленные в таблице 12.

Таблица 12 - Молекулы-транспортеры и регуляторы метаболического сопряжения в НВЕ при гипоксии in vitro при подавлении проницаемости коннексина-43 (%)

Примечания: * - уровень значимостимежду группами р<0,05, критерий Манна-Уитни.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10