Перинатальное гипоксически-ишемическое поражение головного мозга у детей: клинические особенности, механизмы и маркеры повреждения клеток нейроваскулярной единицы (стр. 2 )

Дифференцировка крысиных нейросфер в нейроны и астроциты начиналась через 3-4 суток после посева, путем добавления в среду для культивирования соответствующих факторов дифференцировки (NeuroCult® NS-A Differentiation Kit (StemCell, Канада). В качестве питательной среды использовалась среда NeuroCult® NS-A Differentiation Medium (StemCell, Канада). Через 7 и 14 суток после начала дифференцировки клеток (нейроны, астроциты) проводили иммуноцитохимическую оценку чистоты полученных культур. Использовали флуоресцентные маркеры для нейронов (NSE), астроцитов (GFAP), по стандартным протоколам непрямого метода иммуноцитохимии. Чистота выделенных культур клеток рассчитывалась в процентах позитивных клеток на соответствующий маркер (NSE, GFAP) от общего числа клеток (как позитивных, так и негативных) в 10 полях зрения.

Выделение эндотелиоцитов из сосудов головного мозга проводили из сосудов ГМ крыс возраста 1-3 недели согласно протоколу (Niwa M. et al. 2006).

Создание модели нейроваскулярной единицы in vitro проводили после получения достаточного количества клеток в соответствии с протоколом, описанным в ( и др., 2012).

Модель химической гипоксии in vitro создавали путем инкубации сокультур клеток с йодацетатом натрия (50 мкМ конечная концентрация) в течении 30 минут при 37°С в стандартных условиях CO2-инкубатора с последующей полной заменой культуральной среды. В качестве контроля использовалась сокультура, культивируемая без йодацетата с полной заменой среды (Gutmann B. et al., 2002).

Оценка пролиферативной активности клеток НВЕ проводилась с помощью прибора системы для клеточного анализа в реальном времени «xCELLigence» (Roche, Швейцария) (Jonsson M. et al., 2011, Guan N. et al., 2013). Иммунногисто/цитохимические исследования (регистрация антигенов Р-гликопротеина, SLC1A5, Сх43,CD38, EAAT2, NSE, GFAP) проводились двойным непрямым методом иммуноферментного окрашивания как в срезах головного мозга полученных от крыс, так и в клеточной модели НВЕ in vitro.

Первичными антителами являлись: 1. К Р-гликопротеину в разведении 1:100 (Abcam, ab3366). 2. Анти-SLC1A5 в разведении 1:200 (Abcam, ab8490Антитела к CD38 в разведении 1:200 (Santa-cruz, sc-7049). 4. Анти Connexin-43 в разведении 1:100 (Abcam, ab79010). 5. Антитела к GFAP в разведении 1:100 (Sigma, GUG). 6. Антитела к NSE в разведении 1:200 (Abcam, ab79757).7. Антитела к EAAT2 в разведении 1:400 (Abcam, ab85882).

В качестве вторичных антител использовались моноклональные антитела TRITC, FITC, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 350, Су 5.5 в разведении 1:400.

В препаратах клеток (модель НВЕ in vitro) предварительно использовали префиксацию смесью культуральной среды с 4% параформальдегидом в разведении 1:1. Фиксация проводилась в 4% параформальдегиде 15 минут. Далее выполнялся стандартный протокол фирмы-производителя. Люминесцентная микроскопия препаратов осуществлялась при увеличении х900 (микроскоп «Olimpus-CX41», Olympus, Япония), а также лазерным конфокальным микроскопом «Olympus FV10i-W» (Olympus, Япония), использовалась видеосистема для анализа изображений Nikon Coolpix 4500, Nikon, США). Считали относительное количество клеток, экспрессирующих каждый из видов антигена, а также их соэкспрессию на 300 клеток в образце при анализе не менее 10 полей зрения. При обработке результатов учитывалось относительное количество всех клеток, несущих интересующую метку/метки и выраженное в процентах от общего количества клеток.

Статистическая обработка результатов исследования осуществлена с применением прикладных программ, «StatPlus Professional 5.8», Microsoft Excel 9.0, специальных прикладных программ для анализа изображений идущих в комплекте с оборудованием «Olimpus-CX41» и «Olympus FV10i-W». Описательная статистика в виде процентных долей и их стандартных ошибок (m) и стандартных отклонений (σ). Использовались методы непараметрической статистики (критерий Манна-Уитни, Крускала-Уоллиса, критерия χ2 при уровне значимости - р<0,05), точный критерий Фишера, при заданном уровне значимости α<0,05 (5%). Корреляционная связь оценивалась методом Спирмена с определением силы корреляции: слабая - r ≤ 0,25, умеренная 0,25≤ r ≤ 0,75, сильная r ≥ 0,75, при уровне значимости - р<0,05. Применялся регрессионный анализ. Проверка значимости регрессии проводилась с использованием F-теста. Различия дисперсий принимались при превышении критического значения F.

Глава 3. Клиническая характеристика детей c церебральной ишемией. В третьей главе приводятся результаты клинической части исследования.

Особенности течения антенатального периода

Наиболее часто встречающейся патологией беременности у матерей, детей, включенных в исследование, была анемия, которая зарегистрирована во всех исследуемых группах. Однако чаще (р<0,05) анемический синдром диагностирован у женщин, дети которых составили 3 группу наблюдения (70,8±9,3%) - в два раза больше по сравнению с 1 (30±14,5%) и 2 группами (36,1±8,0%). У матерей, родивших детей с ЦИ 3 степени, статистически значимо чаще диагностировали хроническую фетоплацентарную недостаточность (45,8±10,2%) - в 4 раза чаще по сравнению с первой и в 2 раза по сравнению со второй группами, а также угрозу прерывания беременности в первой половине (41,7±10,1%) по сравнению с женщинами других групп (р<0,05).

Особенности интранатального периода

Анализ интранатального периода (таблица 1) выявил наиболее значимые проявления патологии интранатального периода, которая статистически значимо чаще регистрировалась в группах детей с более тяжелой формой ЦИ. Преждевременная отслойка плаценты, а также экстренное кесарево сечение статистически значимо чаще (р=0,04) были зарегистрированы у женщин родивших детей с ЦИ 3 степени. Дородовое излитие околоплодных вод чаще встречалось во 2 и 3 группах(р<0,005). При этом во всех группах одинаково часто встречалась слабость родовой деятельности и мекониальное окрашивание околоплодных вод, что является признаком развившейся гипоксии плода. Не обнаружено статистически значимых различий между группами детей с ЦИ различной степени тяжести в частоте проведения операции эпизиотомии или планового кесарева сечения, а также в течение родовой деятельности (стремительные и/или быстрые роды), патологии, сопровождающейся изменением околоплодных вод (маловодие, многоводие, мекониальное прокрашивание) и обвития пуповины вокруг шеи.

Таблица 1 - Особенности интранатального периода новорожденных с церебральной ишемией разной степени тяжести

Примечания: * - отличия между 3 группой по сравнению с 1 и 2 (р<0,05).

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10