Оптимизация режимов лечения больных с бластным кризом хронического миелолейкоза с учетом лекарственной чувствительности бластных клеток in vitro 14.00.29 – гематология и переливание крови (стр. 1 )

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НЕКОММЕРЧЕСКОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ЗАХАРОВА ЕЛЕНА СТАНИСЛАВОВНА

ОПТИМИЗАЦИЯ РЕЖИМОВ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ С БЛАСТНЫМ КРИЗОМ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОЛЕЙКОЗА С УЧЕТОМ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БЛАСТНЫХ КЛЕТОК

IN VITRO

14.00.29 – ГЕМАТОЛОГИЯ И ПЕРЕЛИВАНИЕ КРОВИ

диссертация на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

Москва 2006г.

1.3.2. Прогностическая значимость исследований лекарственной устойчивости in vitro при лейкозах………….............…....27

1.3.3. Индивидуализация химиотерапии по результатам исследования лекарственной устойчивости in vitro….......27

1.3.4. Исследование лекарственных взаимодействий с помощью тестов in vitro..………………………………………….…...28

1.4 Современные подходы к терапии бластного криза хронического миелолейкоза…………………………………..………………………………...30

ГЛАВА 2. ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика больных…………………………..……………......40

2.1.1 Описание исследования…...………...………………………43

2.2. Методы исследования

2.2.1Цитохимические методы ……………………………………48

2.2.2 Иммунологические исследования………………………….48

2.2.3 Методы исследования лекарственной чувствительности бластных клеток при бластном кризе хронического миелолейкоза in vitro………..……………….......................52

2.2.4 Цитогенетические исследования……………………...........55

2.3. Статистический анализ результатов исследования……...………..55

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.Клинико-гематологическая характеристика больных……………..57

3.2.Сравнительная характеристика цитохимического и иммунологического вариантов бластного криза хронического миелолейкоза………………………….………………………............59

3.3. Характеристика лекарственной чувствительности бластных клеток у больных с бластным кризом хронического миелолейкоза in vitro……………………………………………………………….........65

3.4. Результаты терапии больных бластным кризом хронического миелолейкоза……………………………………………………....80

3.4.1. Эффективность индукционной терапии больных бластным кризом хронического миелолейкоза с помощью иматиниб мезилата..................................................................................80

3.4.2. Анализ результатов лечения больных бластным кризом хронического миелолейкоза с помощью иматиниб мезилата…..............................................................................81

3.4.3. Анализ результатов лечения больных бластным кризом хронического миелолейкоза с помощью полихимиотерапии….............................................................85

3.5. Результаты цитогенетических исследований

3.5.1. Результаты цитогенетических исследований до начала терапии………………………………………………….......91

3.5.2. Результаты цитогенетических исследований после проведенного лечения……………………………………..93

3.6. Выживаемость

3.6.1. Выживаемость больных с лимфоидным вариантом бластного криза хронического миелолейкоза…................97

3.6.2. Выживаемость больных с нелимфоидным вариантом бластного криза хронического миелолейкоза…................99

3.7. Токсичность терапии……………………………………..….......101

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………....107

ВЫВОДЫ……………………………………………………………………....124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………...…...125

LD50 – концентрация цитостатиков in vitro, летальная для 50% опухолевых клеток

ОМЛ – острые миелоидные лейкозы

ОЛЛ – острый лимфобластный лейкоз

ЛБК ХМЛ – лимфоидный вариант БК ХМЛ

НБК ХМЛ – нелимфоидный вариант БК ХМЛ

ПКГР – полная клинико-гематологическая ремиссия

ПЦО – полный цитогенетический ответ

БЦО – большой цитогенетический ответ

ЦГО – цитогенетический ответ

АСТ – аспартаттрансаминаза

АЛТ – аланинтрансаминаза

ВГН – верхняя граница нормы

ECOG – Eastern Cooperative Oncology Group – Восточная Кооперативная Онкологическая Группа

МЦО – малый цитогенетический ответ

МКА – моноклональные антитела
ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Устойчивость опухоли к действию цитостатических препаратов – одна из основных проблем в лечении гемобластозов. Хронический миелолейкоз (ХМЛ) представляет собой клональное миелопролиферативное заболевание, которое характеризуется на первых этапах относительно доброкачественным течением, однако в конечном итоге неизбежно трансформируется в злокачественный процесс – бластный криз [28, 90, 103].

В этой стадии хронического миелолейкоза происходит накопление незрелых опухолевых клеток, высоко резистентных к химиотерапии. Цитостатическое лечение бластного криза ХМЛ (БК ХМЛ) недостаточно разработано и отличается невысокой эффективностью. Так, при нелимфоидном варианте БК ХМЛ применение стандартных химиотерапевтических режимов позволяет добиться ответа лишь у 7% больных. При лимфоидном БК ХМЛ процент ответов выше - 42%. Однако, длительность терминальной стадии остается короткой и составляет в первом случае 4 месяца, во втором – 10 месяцев [170].

Результаты патогенетической терапии ХМЛ с помощью ингибиторов тирозинкиназ в терминальной стадии по данным литературы несколько лучше [55, 66, 159], однако, собственный опыт лечения больных иматиниб мезилатом нуждается в обощении.

Лекарственная устойчивость при БК ХМЛ, несомненно, является многофакторной. Методы количественного определения устойчивости к цитостатическим препаратам in vitro с помощью краткосрочного культивирования бластных клеток крови и костного мозга больных [15, 140, 142, 154] позволяют определить лекарственную резистентность независимо от ее механизма и отражают конечный эффект цитотоксичности. В культуре из опухолевых клеток возможно изучение эффективной комбинации химиотерапевтических препаратов в различных концентрациях, в том числе в сочетании с ингибиторами тирозинкиназ [138]. Эти исследования открывают путь для выбора наиболее целесообразных схем лечения, а в отдельных случаях – для индивидуализации терапии.

Цель настоящего исследования

Целью настоящего исследования является разработка оптимальных терапевтических режимов на основании анализа чувствительности опухолевых клеток больных бластным кризом хронического миелолейкоза к различным цитостатическим препаратам и ингибитору Bcr-Abl-тирозинкиназы иматиниб мезилату in vitro в зависимости от варианта бластного криза хронического миелолейкоза.

Задачи исследования

1.  Изучить иммунофенотипические и цитохимические характеристики бластных клеток больных хроническим миелолейкозом.

2.  Исследовать лекарственную устойчивость in vitro бластных клеток при бластном кризе ХМЛ в зависимости от их фенотипа к широкому спектру цитостатических препаратов и иматиниб мезилату с помощью краткосрочных культуральных методов DiSC и МТТ.

3.  Сопоставить клиническую эффективность различных режимов химиотерапии, в т. ч. «агрессивных» схем, в зависимости от профиля лекарственной резистентности in vitro.

4.  Определить частоту и длительность гематологических и цитогенетических ответов, выживаемости при монотерапии иматиниб мезилатом у больных бластным кризом хронического миелолейкоза и сопоставить с результатами химиотерапии.

5. Дать рекомендации по лечению больных бластным кризом ХМЛ в зависимости от цитохимических характеристик, иммунофенотипа и лекарственной чувствительности in vitro бластных клеток.

6. Проанализировать особенности ответа на полихимиотерапию и монотерапию иматиниб мезилатом в зависимости от варианта бластного криза ХМЛ.

Научная новизна

Впервые охарактеризована лекарственная устойчивость опухолевых клеток больных с различными вариантами бластного криза хронического миелолейкоза in vitro к широкому спектру химиотерапевтических препаратов и иматиниб мезилату. Оценена значимость культуральных исследований лекарственной резистентности при бластном кризе хронического миелолейкоза.

Впервые обобщен собственный опыт лечения больных бластным кризом хронического миелолейкоза с помощью иматиниб мезилата, сопоставлена эффективность патогенетической терапии и цитостатических схем (в т. ч. агрессивных режимов) у больных с лимфоидным и нелимфоидным вариантами заболевания на различных этапах терапии. Оценена и сопоставлена токсичность различных методов лечения.

На основании собственных исследований описаны цитогенетические аномалии, характеризующие клональную эволюцию у больных бластным кризом хронического миелолейкоза.

Научно-практическая значимость

Показана необходимость выделения вариантов заболевания с помощью цитохимического исследования и иммунофенотипирования бластов до начала лечения в каждом случае бластного криза хронического миелолейкоза.

На основе изучения лекарственной устойчивости бластных клеток больных бластным кризом хронического миелолейкоза in vitro выявлены разные профили химиочувствительности при лимфоидном и нелимфоидном вариантах заболевания и на разных этапах течения бластного криза. Получены обоснования для применения комбинаций винкристина, преднизолона, рубомицина и L-аспарагиназы цитостатических режимов терапии с иматинибом при лимфоидном варианте заболевания, поскольку выживаемость таких пациентов достверно увеличивается.

Показано, что при нелимфоидном варианте бластного криза хронического миелолейкоза достоверное увеличение общей выживаемости больных и уменьшение токсичности также достигается путем применения иматиниб мезилата и комбинации химиопрепаратов.

Таким образом, на основании лабораторных методов изучения лекарственной чувствительности бластных клеток даны практические рекомендации по применению оптимальных режимов терапии при различных вариантах бластного криза хронического миелолейкоза.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 147 страницах машинописного текста, иллюстрированы 21 таблицей и 14 рисунками. Указатель литературы содержит 174 библиографических источника (отечественных и иностранных авторов).

Работа осуществлялась в период с июля 1996г. по май 2002г. на базе отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона (научный руководитель – проф., д. м.н. ) Гематологического Научного Центра Российской Академии Медицинских Наук (далее – ГНЦ РАМН, директор – академик РАМН и РАН, профессор ). Вариант БК устанавливался у всех больных до начала лечения с помощью цитохимического метода в клинико-диагностической лаборатории ГНЦ РАМН (зав. лаб. - ) и в лаборатории гемоцитологии ГНЦ РАМН (зав. лаб. - профессор., д. м.н. ). Иммунологический вариант БК ХМЛ с помощью метода проточной цитометрии определялся на базе лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей (зав. лаб - профессор ) научно-исследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского Онкологического Научного Центра им. (далее - НИИ ЭДиТО РОНЦ РАМН, директор - профессор ). Цитогенетические исследования проводились в кариологической лаборатории ГНЦ РАМН (зав. лаб. - д. м.н., профессор ).

Для оценки лекарственной устойчивости in vitro и ее сопоставления с клиническими данными применялись метод DiSC (аббривеатура differential staining cytotoxicity) и МТТ-анализ (на основе соли тетразолия 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида – сокращенно MTT). Исследования проводились в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ РАМН.

Лечение пациентов осуществлялось в отделении химиотерапии лейкозов и патологии эритрона ГНЦ РАМН.

Статистический анализ результатов исследования проводился при участии лаборатории медицинской статистики ГНЦ РАМН (зав. – к. т.н. ).

В рамках концепции кинетической резистентности при ХМЛ генетическая нестабильность опухолевых клеток опосредуется онкогеном BCR-ABL и дополнительными мутациями р53, приводящими к бесконтрольной пролиферации [90]. Для БК ХМЛ, так же, как и для резистентных форм острых лейкозов, характерен феномен быстрого обратного роста опухоли - "regrowth resistance" [112, 113]. Предполагается, что доминирующая популяция опухолевых клеток высоко чувствительна к лечению и поэтому элиминируется, но в резидуальных бластах, находящихся в фазе G0 и переживающих лечение, происходят мутации, ведущие к формированию лекарственной устойчивости и фиксирующиеся в геноме. Пролиферативный потенциал резидуальных опухолевых клеток может повышаться вследствие инактивации р53 «дикого» типа и его респонсивных элементов - генов р21 и gadd45, контролирующих репликацию ДНК [46]. Терапия STI571 в терминальной стадии ХМЛ приводит к избирательному уничтожению чувствительных BCR-ABL-позитивных клеток, но клоны с дополнительными генетическими аномалиями могут репопулировать костный мозг, что также является следствием быстрого обратного роста опухоли.

Кластерная амплификация гена BCR-ABL и его интеграция с коротким плечом аномальной хромосомы 17 может способствовать трансформации ХМЛ в терминальную стадию [95].

Нестабильность генома отражается в появлении таких атипичных хромосомных аномалий, как трисомии хромосом 22, 13, 21, 10, 11, 14, 15, 19, 1, 4, 9, 12, 17, 18; дополнительные транслокации t(1;1) (p12;q12), t(6;8) (q16; p21), t(3;21) (q27;q22), t(17q; 18q); дупликации хромосом 1, 2 и 7; делеции хромосом 7, 11, 21, инверсии хромосом 3, 7, 9 [48]. Необходимо отметить, что указанные аберрации появлялись не как самостоятельные, а как дополнительные и сравнительно редкие находки. Наличие множественных хромосомных перестроек не уменьшало выживаемость больных по сравнению с теми пациентами, у которых обнаруживалась лишь одна дополнительная цитогенетическая аномалия. Авторы отмечают, что хромосомные аберрации достоверно чаще (р=0,04) выявляются при нелимфоидном бластном кризе ХМЛ. Полагают, что наличие клональной эволюции ухудшает прогноз в отношении выживаемости [48].

За последние 10 лет появились новые данные относительно клинических особенностей ХМЛ с изохромосомой 17. Еще в 1988г. Было отмечено, что наличие изохромосомы 17 у больных в ФА ХМЛ перед аллогенной трансплантацией не увеличивает риск развития рецидива после ТКМ [116]. Данная цитогенетическая аномалия оказалась характерной исключительно для нелимфоидного варианта БК ХМЛ и была связана с предшествующей фазой акселерации и базофилией. Медиана выживаемости пациентов с перестройками 17 хромосомы не отличалась от медианы выживаемости больных с отсутствием данной мутации [52].

Эти данные не вполне согласуются с концепцией агрессивности опухолей, несущих мутантный протеин р53. Однако, данные современной литературы позволяют сделать вывод, что клиническая значимость р53 как прогностического фактора остается неясной, и трактовать ее следует лишь в сочетании с другими показателями. Это обусловлено несовершенством методики определения экспрессии и функциональной активности протеина, отсутствием стандартов. Также требуется анализ значительно большего объема клинического материала [38, 149]. Мутации р53 могут локализоваться более чем в 100 различных кодонах, что способствует формированию определенной, не всегда одинаковой биологической активности р53. Существуют данные как о позитивных, так и негативных корреляциях между мутациями р53, апоптозом и лекарственной устойчивостью при различных гематологических нозологиях.

1.2.2. Амплификация онкогена BCR-ABL как возможный механизм развития резистентости при ХМЛ.

Нормальный ген ABL в клетке выполняет функцию гена-супрессора опухолевого роста. В активном состоянии его продукт - белок - связывается с pRb (протеином ретинобластомы), что приводит к остановке клеточного цикла. При ХМЛ вследствие делеции ген ABL утрачивает эту функцию [162, 166]. Клетки хронической фазы ХМЛ характеризуются повышенным уровнем мутаций, чему способствует нарушение контроля со стороны стромального микроокружения [90].

В случае ХМЛ инициальное онкогенное событие - формирование гена BCR-ABL - вероятнее всего обусловливает и дальнейшее прогрессирование заболевания. По мере трансформации ХМЛ в терминальную стадию наблюдается значительное уменьшение и утрата полных гематологических ремиссий и цитогенетических ответов, их длительности. В клеточных линиях показано, что по мере трансформации в терминальную стадию наблюдается спонтанная амплификация гена. Она происходит либо самостоятельно, либо за счет удвоения Ph’-хромосомы. Это подтверждается при культивировании Ph’-позитивных клеточных линий [83, 152, 157]. Приведенные выше данные свидетельствуют в пользу того факта, что ген BCR-ABL играет важнейшую роль в опухолевой прогрессии ХМЛ.

Селективная терапия STI571, выключающая функции ABL-тирозинкиназы, способна индуцировать ремиссии у больных с БК ХМЛ даже при наличии дополнительных хромосомных аномалий, хотя продолжительность ответа остается небольшой. Как правило, до начала лечения опухолевые клетки больных чувствительны к препарату на всех стадиях заболевания [41]. Однако при длительной инкубации клеточных линий с ингибитором тирозинкиназ развивается вторичная резистентность к STI571 [84, 91]. Реактивация гена BCR-ABL вследствие его амплификации в настоящее время считается одним из возможных механизмов, вызывающих у больных БК ХМЛ резистентность к STI571 [32, 124].

Были проведены эксперименты, моделирующие лекарственную устойчивость in vitro [Gambacorti-Passerini С. et al., 84]. С помощью метода FiSH выявлена четырехкратная амплификация гена BCR-ABL в клеточной линии LAMA84R, резистентной к STI571. В клеточной линии Ba/F3, позитивной по BCR-ABL и резистентной к STI571 в результате культивирования с возрастающими концентрациями препарата, обнаружена пятикратная амплификация гена BCR-ABL, повышение уровня мРНК BCR-ABL. Количество BCR-ABL-протеина возрастало более чем в 10 раз. В лекарственно-устойчивой клеточной линии БК ХМЛ К562 после инкубации с различными концентрациями STI571 не было выявлено значимой амплификации гена BCR-ABL, однако, уровень p210BCR/ABL протеина увеличился в 2-3 раза [E. Weisberg, J. D.Griffin et al., 152].

Этот факт может частично объяснить результаты терапии STI571 при БК ХМЛ, где, несмотря на высокий процент ответов, у подавляющего большинства больных развивается рецидив через 2-5 месяцев [32, 124]. Интересно, что в некоторых резистентных к STI571 клеточных линиях после его удаления из среды через 2-3 месяца амплификация гена BCR-ABL исчезала, и чувствительность к препарату восстанавливалась [124].

Двойная Ph’-хромосома - одна из трех "главных" генетических аномалий при БК ХМЛ. Она выявляется у 25-38% больных на момент диагностики БК. Этот факт является неблагоприятным прогностическим признаком в отношении достижения ответа на терапию и выживаемости [49, 67]. Наличие двойной Ph-хромосомы, особенно в сочетании с трисомией хромосомы 8, уменьшает вероятность ответа на терапию STI571 в фазе акселерации. У 30% таких больных БК ХМЛ развивается через 150 дней от начала терапии [92].

1.2.3. Активация онкогена MYC

Трисомия хромосомы 8 - наиболее часто встречающаяся дополнительная генетическая аномалия, которая обнаруживается у 29-36% больных в сочетании с Ph’-хромосомой при трансформации в терминальную стадию ХМЛ [49, 67]. Данная мутация может быть ассоциирована с гиперэкспрессией онкогена MYC, локализующегося на длинном плече хромосомы 8. Его продукты - цитоплазматические протеины - участвуют в каскаде реакций, запускаемых ABL-тирозинкиназой, что способствует клеточной пролиферации, независимой от регулирующего влияния ростовых факторов. Роль онкогена MYC в эволюции ХМЛ остается неясной, так как наряду с увеличением пролиферативного потенциала клеток экспрессия MYC активирует апоптоз, в том числе опосредуемый протеином р53 [3, 35, 88]. Однако, как уже было отмечено выше, несмотря на проапоптотическую активность MYC, обнаружение трисомии 8 одновременно с филадельфийской хромосомой у больных с БК ХМЛ значительно ухудшает прогноз[49, 67].

1.2.4. Клеточная резистентность, обусловленная точечными мутациями домена Abl

Еще один возможный механизм развития лекарственной устойчивости к STI571 – точечные мутации гена BCR-ABL в Abl-домене, приводящие к замене треонина на изолейцин в аминокислотном остатке 315, который расположен в АТФ-связывающем регионе Abl-тирозинкиназы. В результате нарушается «захват» иматиниб мезилата опухолевыми клетками [31]. Этот механизм был ведущим у 6 из 9 исследованных больных, проявивших клиническую резистентность к иматиниб мезилату [45]. Французская группа исследователей показала, что данная мутация обнаруживалась у 3 больных из– в ХФ и 8 - в ФА), резистентных к терапии иматиниб мезилатом, в том числе и в хронической фазе заболевания [117]. На момент диагностики ни у кого из больных не удалось обнаружить данную мутацию. Однако еще до начала лечения единичные опухолевые клетки у больных во всех стадиях ХМЛ содержали впервые выявленные новые генетические поломки, приводящие к замене фенилаланина в точке 311 на лейцин и метионина в аминокислотном остатке 351 на треонин. Более того, в процессе лечения иматиниб мезилатом с помощью ПЦР обнаружено клональное преимущество клеток, несущих вышеописанные мутации. Интересно, что при исследовании клеток 24 больных с помощью метода in situ гибридизации амплификация гена BCR-ABL не обнаруживалась.

1.2.5. Фармакокинетическая резистентность при бластном кризе хронического миелолейкоза

В связи с активным клиническим применением ингибитора Abl-тирозинкиназы на всех стадиях ХМЛ в литературе активно обсуждаются механизмы, вызывающие устойчивость опухолевых клеток к препарату, в том числе и фармакокинетические. В качестве возможного механизма развития резистентности к STI571 при БК ХМЛ обсуждается гипотеза, что кислый α1-гликопротеин (так называемый "белок острой фазы"), синтезирующийся в печени, может связывать ингибитор Abl-тирозинкиназы в плазме и таким образом снижать его эффективную концентрацию. Уровень кислого α1-гликопротеина в плазме достоверно выше у больных на всех стадиях ХМЛ, чем у здоровых доноров. Кроме того, STI571 может подвергаться биотрансформации в печени с участием системы цитохрома р450, что приводит к функциональной инактивации препарата [40, 124].

Р-гликопротеин

Р-гликопротеин (Pgp) - белок клеточной мембраны с массой 170 кД, обладающий АТФ-азной активностью и кодируемый геном MDR-1. Pgp функционирует как насос, удаляющий чужеродные вещества из клетки, и в норме экспрессируется в гематотканевых барьерах [134]. Р-гликопротеин опосредует феномен множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Клетки с фенотипом МЛУ обладают перекрестной резистентностью к целому ряду цитостатических препаратов, различных по структуре и механизму действия. Pgp выявляется на бластных клетках 30-69% больных БК ХМЛ [104]. Обнаружена корреляция экспрессии функционально активного Pgp с экспрессией антигенов, характерных для предшественников и клеток ранней миелоидной дифференцировки - CD34 и CD13 [130, 139]. Pgp кодируется геном MDR-1, расположенным на длинном плече хромосомы 7 [173]. MDR-1 - стресс-индуцируемый ген, экспрессия которого может быть увеличена при воздействии рентгеновского излучения, теплового и осмотического шока, противоопухолевых препаратов, мутаций гена р53, активирующих промотор гена MDR-1 [21, 23, 53, 54, 97, 151]. Экспрессия MDR-1 гена/протеина может возникать после экспозиции цитостатических препаратов в отсутствие пролиферации опухолевых клеток и исчезать через несколько недель после отмены индуцирующего воздействия. Этот факт позволяет предположить, что появление MDR-1 гена/протеина связано с изменением фенотипа клеток, а не с селекцией резистентной опухолевой популяции [43, 83, 94].

Предполагалось, что экспрессия гена MDR-1 влияет на развитие лекарственной устойчивости при БК ХМЛ in vivo [111]. Однако, например, показала, что у 85 больных белок МЛУ обнаруживался в 30% случаев, при этом появление Pgp-позитивных клеток не всегда было связано с предшествующим лечением больных. По-видимому, в терминальной стадии ХМЛ резистентность к проводимой ПХТ в подавляющем большинстве случаев не связана с гиперэкспрессией Pgp [171].

По данным , экспрессия Pgp позволяет прогнозировать более быстрое течение БК [173].

Роль Pgp в активном транспорте из BCR-ABL позитивных клеток ингибитора Abl-тирозинкиназы нуждается в дальнейшем изучении. В резистентных к STI571 клеточных линиях ХМЛ Ba/F3.p210 и К562 не обнаружено гиперэкспрессии протеинов MDR1 и MRP1 [152]. В противоположность этому, была обнаружена повышенная экспрессия Pgp в резистентной BCR-ABL позитивной клеточной линии [Mahon F. X et al., 91].

Необходимо отметить, что резистентность к цитостатическим препаратам является мультифакторной. Как правило, сложно выделить один ведущий механизм лекарственной устойчивости в опухоли. Этот факт, по-видимому, является причиной отсутствия клинически значимых результатов при попытках преодоления резистентности с помощью модуляторов, которые избирательно воздействуют лишь на определенный механизм лекарственной устойчивости.

1.3. ИССЛЕДОВАНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К ЦИТОСТАТИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ IN VITRO

Клеточная лекарственная устойчивость - одна их важных причин развития резистентности больных с гемобластозами к цитостатической терапии. В настоящее время разработаны методы количественной оценки данного типа лекарственной устойчивости in vitro на момент диагностики лейкоза и при его прогрессировании. С этой целью используются краткосрочные культуры «свежих» клеток крови и костного мозга больных.

1.3.1. Основные методы исследования лекарственной устойчивости in vitro.

Первое сообщение о тестировании лекарственной устойчивости in vitro и его корреляции с результатами терапии было опубликовано Black M. M. и Speer F. D. в 1954г. Авторы инкубировали «свежие» биопсийные образцы опухолей человека в присутствии цитостатических препаратов и с помощью спектрофотометра количественно измеряли степень повреждения клеток по уровню редукции тетразолия. Исследователи отметили сопоставимость между результатами тестов in vitro и ответом больных на химиотерапию [12]. В 1977г. Hamburger A. W. и Salmon S. E. сообщили данные, в которых оценивалась лекарственная чувствительность злокачественных клеток больных с помощью метода колониеобразования [122]. Колoниеобразующие исследования были признаны "золотым стандартом" для тестирования лекарственной устойчивости in vitro. Однако, данные методы использовались для определения резистентности преимущественно при высокоагрессивных опухолях с плохим прогнозом. К тому же длительность клоногенных исследований составляла не менее 2 недель [26, 126, 144]. Эти обстоятельства вызвали временное снижение интереса к колониеобразующим тестам лекарственной устойчивости in vitro.

Однако уже в 1978г. появились первые сообщения об использовании краткосрочного 4-дневного культурального метода DiSC (differential staining cytotoxicity) для исследования резистентности к цитостатическим препаратам в «свежих» опухолевых клетках больных [153]. Тест DiSC основан на различном окрашивании «живых» и погибших клеток определенным красителем вследствие неодинаковой структурной целостности мембран этих клеток. Данный метод позволяет определить количество погибших клеток после цитотоксического воздействия препаратов, а также вычислить долю нормальных клеток в популяции, переживающей лечение [9, 15]. Была показана одинаковая чувствительность бластных клеток крови и костного мозга к химиопрепаратам in vitro [10].

В 1983 г. Mossmann Т. опубликовал данные по использованию метода МТТ для определения резистентности опухолевых клеток in vitro [99]. Он заключается в колориметрическом количественном определении клеточной выживаемости, которое основано на расщеплении МТТ (соли тетразолия) митохондриальным ферментом сукцинатдегидрогеназой ‘живых’ клеток с образованием продукта - голубого формазана, определяемого с помощью спектрофотометра. В 1988 г. Pieters R. и соавт. адаптировали данный тест для оценки лекарственной устойчивости при детских острых лейкозах [107].

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10