МТТ-метод
MTT-тест - колориметрический метод количественного определения клеточной выживаемости и пролиферации, основанный на расщеплении МТТ (соли тетразолия) митохондриальным ферментом сукцинатдегидрогеназой живых клеток с образованием продукта - голубого формазана, определяемого с помощью спектрофотометра. Учитывая, что в данном методе невозможно различить опухолевые и неопухолевые клетки, МТТ-метод применяли для исследования образцов, содержащих не менее 80% бластных клеток. Результаты теста считали надежными, если через 4 дня культивирования в контроле сохранялось 70% живых клеток. Использовали 96-луночный планшет. Ставили 2 контроля: 1)клетки без цитостатических препаратов; 2)чистая бессывороточная среда. В лунки вносили от 100 до 300 тыс клеток, 200 мкл среды, цитостатические препараты в 5 различных концентрациях. После инкубации в течение 96 час. при 37°С в среде, содержащей 5% СО2 в каждую лунку добавляли МТТ 10 мкл, который разводили PBS до концентрации 5 мг/мл. Клетки инкубировали с МТТ в течение 5-6 час. Затем средуудаляли. Добавляли 150-200 мкл DMSO (диметилсульфоксид, растворяющий формазан). На спектрофотометре Multiscan автоматически определяли оптическую плотность раствора в лунках за вычетом контроля. Все контроли и концентрации ставили в триплетах, из которых вычисляли среднее значение.
В DiSC-тесте вычисляли LD50, в МТТ-тесте - LD70. Если значения LD50 или LD70 превышали исследуемую максимальную концентрацию или были меньше применяемой минимальной концентрации, для статистического анализа использовали соответственно значения тестируемых максимальной и минимальной концентраций в качестве LD50 или LD70. Клетки больного считали чувствительными к данному цитостатическому препарату in vitro, если его концентрация была ниже медианы для этого химиопрепарата in vitro [133].
2.2.4 Цитогенетические исследования
Цитогенетические исследования до начала и в ходе терапии проведены у 30 больных в кариологической лаборатории ГНЦ РАМН (руководитель – проф. , д. м.н. ). Цитогенетический анализ костного мозга выполняли прямым методом и методом культивирования клеток с равномерной и G-дифференциальной окраской хромосом (G-banding), а при недостаточном количестве метафаз в костном мозге (<15) – методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
В группе больных, получивших ПХТ, кариотип определен у 10 человек до начала лечения, у 6 больных повторно после курса ПХТ. В группе пациентов, которые принимали иматиниб мезилат, исследование проведено у 21 больного до начала терапии, и у 12 - через 3, 6 и 12 месяцев лечения, а также на момент рецидива заболевания.
2.3 СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Проводили с помощью пакета Statistica 6.0 при участии лаборатории медицинской статистики ГНЦ РАМН (руководитель – к. т.н.). Анализ включал медианы возраста, концентраций химиопрепаратов, медианы наблюдения. Для оценки достоверности различий в группах с числом больных менее 8 человек использовали двусторонний непараметрический критерий Mann-Whitney [165], в группах пациентов численностью более 8 человек с той же целью применяли двусторонний критерий Student [164]. Чтобы оценить влияние чувствительности или резистентности к тому или иному цитостатическому препарату in vitro на выживаемость, использовали регрессионную модель (модель пропорциональных интенсивностей Cox с зависящими от времени ковариатами). Для сравнения различий частоты достижения ответа в группах пациентов, получавших ПХТ и иматиниб мезилат, применяли непараметрический критерий c2. Расчет кривых безрецидивной и общей выживаемости проведен по методу Kaplan-Meier. Достоверность различий выживаемости больных определена с помощью непараметрического критерия Wilcoxon.
ГЛАВА 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. КЛИНИКО-ГЕМАТОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ БК ХМЛ
Суммарные клинико-гематологические характеристики 28 пациентов до начала ПХТ и 21 больного до начала терапии иматинибом, представлены в таблице 3.
В первой группе больных, получавших ПХТ, в большем числе наблюдений (68%) был впервые диагностированный БК ХМЛ. Это группа сравнительно молодых лиц (медиана возраста – 38,5 лет) с примерно одинаковым распределением по полу. Отмечали хорошую соматическую сохранность более половины больных до начала лечения (статус 1 и 2 по шкале ECOG имели 62% пациентов). У 4 больных выявили очаги экстрамедуллярного поражения (в 2 случаях – «саркоматизация» с вовлечением лимфатических узлов, у 1 пациента – специфический плеврит, и у 1 – опухолевое поражение костей таза и поясничного отдела позвоночника).
Вторую группу составили пациенты, получавшие иматиниб (n=21), которые были практически одного возраста с больными из 1-й группы (медиана возраста 41 год). Соотношение по полу и распределение по вариантам БК ХМЛ также было примерно одинаковым. Медиана содержания бластных клеток в крови и/или костном мозге и наличие очагов экстрамедуллярного поражения чаще обнаруживалось у пациентов из первой группы, получавших ПХТ. В группе больных, принимавших иматиниб, лишь у 1 больной с ЛБК ХМЛ была выявлена нейролейкемия. Примечательно, что несмотря на большую «предлеченнность» пациентов в группе «иматиниб», частота клональной эволюции в этой группе до начала лечения препаратом не превысила частоту клональной эволюции у менее предлеченных больных, получавших ПХТ.
Таблица 3. Сравнительные клинико-гематологические данные больных до начала терапии.*
Данные | ПХТ (n=28) | иматиниб (n=21) |
Возраст, годы | 38,5 (21 – 65) | 41 (21 – 67) |
Пол, м:ж | 15:13 | 11:10 |
Первичные:предлеченные | 22:6 | 8:13 |
Продолжительность ХФ (дни) | – 2931) | 1–5782) |
Продолжительность ФА (дни) | – 640) | |
НБК:ЛБК | 18:10 | 13:8 |
Медиана уровня лейкоцитов, х109 /л | 20 (1,7-165) | 18,4 (0,9-134,7) |
Медиана уровня тромбоцитов, х109 /л | 113,5 (12-1315) | |
Медиана уровня гемоглобина, г/л | 99,5 (61-139) | 92 (55-123) |
Средние размеры селезенки, см | 6,3 | 9,4 |
Медиана содержания бластных клеток в крови или костном мозге, % | 52 (30-96) | 33 (2-76) |
Наличие очагов экстрамедуллярного роста, n, % | 4 (19%) | 1 (4%) |
Наличие дополнительных хромосомных аномалий, n, % | 5 (24%) | 7 (32%) |
Статус по ECOG до начала терапии, n, % 1 - 2 3 - 4 | 62 38 | 43 57 |
Медиана наблюдения (дни) | – 1254) | – 807) |
*Примечание: в скобках указаны крайние величины, перед скобками – средние и медианы......................................................................................................................................................................................
3.2. СОПОСТАВЛЕНИЕ ЦИТОХИМИЧЕСКОГО И ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ВАРИАНТОВ БК ХМЛ
Варианты БК ХМЛ у больных, получавших ПХТ
Варианты БК удалось установить у всех больных, включенных в исследование. Совпадение вариантов при цитохимическом и иммунофенотипическом исследованиях выявлено в 82%. Нелимфоидный вариант БК обнаружен у 18 больных (64% во всей группе), лимфоидный – у 10(36%) человек.
Лимфоидный вариант диагностировали в тех случаях, если бластные клетки имели как цитохимические (крупногранулярный гликоген), так и иммунофенотипические характеристики лимфоидных клеток (CD10, CD19, CD20, CD22).
Нелимфоидный вариант БК устанавливали больным, у которых бластные клетки имели цитохимические (PAS-реакция диффузного или диффузно-гранулярного типа), так и иммунологические маркеры бластных клеток (CD33, CD13, CD15, CD11b).
У большинства пациентов удается дифференцировать нелимфоидный (НБК) и лимфоидный (ЛБК) варианты заболевания.
Сопоставление результатов цитохимического и иммунологического исследования бластных клеток больных, получавших ПХТ, приведено в таблице 4.
Таблица 4. Сопоставление результатов цитохимического и иммунологического исследования бластных клеток у больных с БК ХМЛ до начала ПХТ
№ | Ф. И.О. | Цитохимическое заключение | Иммунологическое заключение |
1 | Б. А.С. | ЛБК (PAS гранулярная + в 60% клеток) | Не исследовали |
2 | Б. З.А. | ЛБК (MPO-отриц, липиды-отриц, PAS гранулярная + в 42% клеток) | Cмешанный вариант БК (CD13+, CD11b+, CD10+, СD19+, CD20+) |
3 | Б. В.П. | НБК (миеломонобластный: MPO+, α-нафтилэстераза ++, полностью ингбируется фторидом натрия, PAS в диффузном и диффузно-гранулярном виде) | НБК (миеломонобластный: CD33+, CD11b+, CD7+) |
4 | Б. Г.В. | ЛБК (первичный) (PAS гранулярная + в 56% клеток) | Не исследовали |
Рецидив по типу НБК (миеломонобластный: MPO+, α-нафтилэстераза ++, полностью ингбируется фторидом натрия, PAS в диффузном и диффузно-гранулярном виде ) | НБК (миеломонобластный: CD34+, CD13+, CD11b+, CD10+) | ||
5 | Г. А.Г. | НБК (MPO+ в 68% клеток, PAS гранулярная + в 5% клеток) | НБК (миеломонобластный: CD33+, CD11b+, CD15+) |
6 | Г. Г.Р. | НБК (МРО+) | НБК (CD34+) |
7 | И. И.Е. | НБК (МРО+, α-нафтилэстераза +, не подавляется фторидом натрия, PAS в диффузно-гранулярном виде) | НБК (CD33+, CD13+, CD15+) |
8 | К. В.И. | НБК (миеломонобластный: MPO+, α-нафтилэстераза ++, полностью ингбируется фторидом натрия, PAS в диффузном и диффузно-гранулярном виде) | Нельзя дать заключение, т. к. на клетках отсутствуют поверхностные маркеры |
9 | К. В.П. | НБК (МРО+) | НБК (CD34+) |
10 | К. В.А. | НБК (МРО+) | НБК c экспрессией монобластных маркеров (CD13, CD11b) |
11 | К. Т.Н. | НБК (миеломонобластный: MPO+, α-нафтилэстераза ++, полностью ингбируется фторидом натрия, PAS в диффузном и диффузно-гранулярном виде) | НБК (миеломонобластный: CD13+, CD11b+) |
12 | К. В.И. | МБК (МРО+) | ЛБК (CD10+) |
13 | Л. И.С. | ЛБК (PAS гранулярная + в 70% клеток) | ЛБК (CD34+, CD10+, CD19+, CD22+) |
14 | М. Т.А. | ЛБК (PAS гранулярная + в 65% клеток) | Cмешанный вариант БК (CD33+, CD11b+, CD10+, CD19+, CD20+) |
15 | М. О.Б. | НБК (МРО+) | Н БК (миеломонобластный: CD34+, CD33+, CD13+, CD15+, CD11b+) |
16 | Н. И.И. | НБК (МРО+) | НБК (CD33+, CD13+, CD15+) |
17 | П. В.А. | МБК (МРО+) | Cмешанный вариант БК с (CD13+, CD11b+, CD10+, СD19+, CD20+) |
18 | С. Е.М. | ЛБК (PAS гранулярная + в 67% клеток) | ЛБК (CD10+, CD19+, CD22+) |
19 | П. И.Ф. | Бласты напоминают картину при саркоматизации, лимфоидные с примесью монобластов (МРО – 8% слабо +, PAS – 80% в гранул. форме, реже и слабо – в дифф.-гран.; a-НЭ – 82% + в гран. виде, 12% клеток не подавляются NaF | НБК (CD34+, CD33+) |
20 | С. В.А. | МБК с незначительной примесью лимфоидных маркеров (редко PAS в гранулярной форме) | Не исследовали |
21 | С. В.Н. | НБК (МРО+) | НБК (CD33+, CD13+, CD14+) |
22 | С. М.П. | ЛБК с примесью миелоидных маркеров (PAS –92% + гран., МРО-5%+, судан черный Б – 7%+, a-НЭ – 56% слабо+) | Не исследовали |
23 | Т. А.Н. | НБК (миеломонобластный) | Смешанный БК (CD34+, CD13+, CD11b+, CD10+) |
24 | Ш. С.А. | НБК (МРО+) | НБК (CD33+, CD13+, CD14+, CD15+) |
25 | Ш. В.А. | МБК (МРО+) | Cмешанный вариант БК (CD33+, CD13+, CD20+) |
26 | Я. Е.А. | Вариант не определен (МРО-1%+, PAS-негативные; a-НЭ – не выявлена | Cмешанный вариант БК (CD10+, CD19+, CD20+, CD13+) |
27 | С. О.М. | ЛБК (PAS гранулярная + в 75% клеток) | ЛБК (CD10+, CD19+, CD22+) |
28 | Г. С.А. | ЛБК (PAS гранулярная + в 60% клеток) | Не исследовали |
В 22% наблюдений (6 человек) был установлен диагноз смешанного варианта БК ХМЛ. В этих случаях для уточнения дальнейшей тактики терапии учитывались преобладающие иммунологические маркеры (лимфоидной или миелоидной направленности).
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 |
