На правах рукописи

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВТОРИЧНЫХ МИЕЛОДИСПЛАЗИЙ ПРИ ЛИМФОМАХ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

НОВОСИБИРСК – 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор

доктор медицинских наук,

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор

доктор медицинских наук,

профессор

Ведущая организация: НИИ гематологии и переливания крови ФГУ (Киров)

Защита состоится «____»______2009 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д001.048.01 при Научном центре клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: , г. Новосибирск, 630117. Тел/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦКЭМ СО РАМН.

Автореферат разослан «_____»____________2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д. б.н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия в гематологии произошли значительные успехи, принципиально изменились подходы в лечении, улучшился прогноз для больных гемобластозами (, , 2002). Заболевания, для которых раннее не существовало эффективной специфической терапии, стали потенциально излечимыми, увеличились число и продолжительность ремиссий. В настоящее время полная ремиссия достигается у 60% больных неходжкинскими злокачественными лимфомами и более чем у 80% пациентов с лимфомой Ходжкина (, 2007, Chapuy., M. Shipp, 2009, Gisselbrecht C., 2009). Однако существуют факторы, которые снижают эффективность противоопухолевой терапии. Одним из них является вторичная миелодисплазия, которая обнаруживается еще до начала специфической терапии. Под вторичной миелодисплазией или дисмиелопоэзом понимают комплекс морфологических нарушений в клетках костного мозга, который выявляется на фоне существующей опухоли крови, при злокачественных образованиях, после химио - и лучевой терапии, при анемиях и других заболеваниях (Detlef Haase, 2008). Ее следует отличать от первичного миелодиспластического синдрома, который является клональным заболеванием, возникающим на уровне стволовой клетки и характеризующимся неэффективным гемопоэзом, клинически проявляющимся цитопениями в периферической крови (Boultwood J., Galili N., Raza A., 2009, Brunning R. D. et al., 2008, Wainscoat J. S., 2001). В последнее десятилетие особое внимание уделяется изучению биологических и клинических особенностей гемобластозов с диспластическими изменениями клеток. Ряд исследовательских групп рассматривают вторичную миелодисплазию (ее отдельные варианты) в качестве неблагоприятного прогностического признака (, 2005, Goasquen J. et al., 2006). Вместе с тем, многие вопросы патогенеза дисмиелопоэза при онкогематологических заболеваниях, причины и роль дисплазии кроветворения в формировании цитопении и неэффективного гемопоэза, влияние миелодисплазии на течение заболеваний и эффективность терапии изучены недостаточно. Остаются неуточненными морфологические особенности клеток костного мозга, нет четких критериев его диагностики. Мало изучены проявления дисплазии и неэффективного гемопоэза в зависимости от иммуноморфологических особенностей клеток, уровня пролиферации и апоптоза.

Наиболее частым проявлением миелодисплазии, наряду с тромбоцитопенией и лейкоцитопенией, является анемия (Vabpel P., 2001, Cazzola M., Malcovaty L., 2005). Патофизиология анемии при злокачественных новообразованиях включает взаимодействие ряда факторов. В том числе – между популяцией опухолевых клеток и иммунной системой, что способствует активации макрофагов и повышенной экспрессии различных цитокинов, которые приводят к укорочению периода жизни эритроцитов, нарушению реутилизации железа костным мозгом, неадекватной продукции эритропоэтина (ЭПО), супрессии эритроидных предшественников, что и вызывает развитие анемии при неопластических процессах (, 2003, Kunikane H., 2001). Неадекватная продукция ряда растворимых ингибиторов миелопоэза клетками опухоли, активированными иммунокомпетентными клетками в период онкогенеза, приводит к неэффективному эритропоэзу, тромбоцито - и лейкопении (, 1999, Hellstrom-Lindberg E., Cazzola M., 2008, Papadaki H., 2009).

Учитывая вышеизложенное, изучение цитоморфологических проявлений миелодисплазии при гемобластозах является актуальным, так как позволит уточнить молекулярно-биологические особенности изменений кроветворения при лимфомах, определить влияние дисмиелопоэза на выживаемость этих пациентов.

Цель исследования: изучить цитологические и молекулярно-биологические особенности вторичных миелодисплазий у больных лимфомами и оценить влияние миелодисплазии на эффективность терапии.

Задачи исследования:

1. Изучить цитологические проявления вторичных миелодисплазий у больных лимфомами.

2. Исследовать особенности анемического синдрома у больных лимфомами с вторичной миелодисплазией и без нее.

3. Выявить взаимосвязь между степенью выраженности миелодисплазии и экспрессией антигенов-маркеров апоптоза и пролиферативной активности на опухолевых клетках.

4. Проанализировать выживаемость больных гемобластозами с миелодисплазией и без диспластических изменений костного мозга.

Научная новизна. Впервые показаны структура и цитологические особенности вторичных миелодисплазий у больных лимфомами, которые, в отличие от дисплазий у больных первичным миелодиспластическим синдромом, характеризуются отсутствием бластных форм, гиперплазии эритрона, макроцитоза зрелых эритроцитов и высоких показателей сидероцитов костного мозга, менее выраженной мегалобластоидностью ядер эритрокариоцитов. Выявлено, что наличие вторичной миелодисплазии, выявляемой на этапе первичной диагностики, ухудшает течение опухолевого процесса и снижает эффективность противоопухолевой терапии. Обнаружено, что у пациентов с дисплазией кроветворения чаще выявляют анемию и тромбоцитопению. Доказано, что проведение химиотерапии увеличивает степень выраженности цитоморфологических проявлений дисмиелопоэза. Отмечено, что случаи с наиболее выраженными диспластическими изменениями сопровождаются гиперэкспрессией опухолевыми клетками белков-регуляторов апоптоза (bcl-2, c-myc и мутантного р-53) и активацией механизмов множественной лекарственной устойчивости (Р-гликопротеина) и сочетаются с худшим прогнозом, низкой четырехлетней выживаемостью.

Практическая значимость работы. Показана высокая частота встречаемости вторичных миелодисплазий у больных лимфомами на этапе диагностики основного заболевания. Доказано, что дисплазия кроветворения оказывает отрицательное влияние на течение лимфопролиферативных заболеваний. При выраженных диспластических изменениях кроветворения в большем проценте случаев наблюдается низкая эффективность химиотерапии и частые рецидивы заболевания. Выявлена связь вторичной миелодисплазии со снижением экспрессии рецепторов к ЭПО, что может способствовать развитию резистентности к эритропоэтину. Доказано, что варианты гемобластоза с наиболее выраженными морфологическими проявлениями вторичной миелодисплазии и гиперэкспрессией опухолевыми клетками белков-регуляторов апоптоза (bcl-2, c-myc и мутантного р-53) и множественной лекарственной устойчивости (Р-гликопротеина) сочетаются с худшим прогнозом, что определяет необходимость выявления признаков вторичной миелодисплазии на этапе диагностики опухолевого процесса для последующей прогностической оценки эффективности терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1.  Вторичные миелодисплазии у больных лимфомами характеризуются отсутствием бластных форм, гиперплазии эритрона, макроцитоза зрелых эритроцитов и высоких показателей сидероцитов костного мозга, менее выраженной мегалобластоидностью ядер эритрокариоцитов.

2.  В генезе анемического синдрома у больных неходжкинскими лимфомами с миелодисплазией большую роль играет снижение экспрессии рецепторов к эритропоэтину и числа клеток, экспрессирующих эти рецепторы.

3.  Цитоморфологические проявления вторичных миелодисплазий обнаруживают высокую прямую корреляцию с гиперэкспрессией опухолевыми клетками белков-регуляторов апоптоза (bcl-2, c-myc и мутантной формы р-53), множественной лекарственной устойчивости (Р-гликопротеина) и неблагоприятным течением заболевания, что ухудшает показатели выживаемости пациентов.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены на Юбилейной конференции, посвященной 40-летию гематологической службы г. Новосибирска (2004); 21(XLIV) сессии общего собрания Сибирского отделения РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы онкологии» (2003); международных конференциях «Фундаментальные науки - биологии и медицине» (Новосибирск, 2005, 2006, 2007, 2008); на ежегодных научно-практических конференциях «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2003, 2004, 2005, 2006); на I съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2005); на выездной сессии Президиума СО РАМН, посвященной проблемам онкологии и онкогематологии (Новосибирск, 2006), на 3-межрегиональной научно-практической школе-семинаре «Фундаментальные и прикладные исследования в онкогематологии» (Новосибирск, 2006).

Внедрение результатов исследования. Полученные в работе результаты внедрены в практику работы гематологического отделения МУЗ ГКБ № 2 г. Новосибирска. Материалы диссертации получили отражение в учебном процессе на кафедре гематологии и трансфузиологии лечебного факультета.

Работа выполнена на кафедре гематологии и трансфузиологии лечебного факультета Новосибирского государственного медицинского университета (зав. кафедрой – проф. ), на базе Городского гематологического центра МУЗ ГКБ № 2 (главный врач – проф. , зав. отделением – к. м.н. ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ, из них 5 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 183 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных результатов исследования, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка цитированной литературы. Содержит 38 таблиц, 12 рисунков, 4 фотографии. Библиография включает 45 отечественных и 229 иностранных авторов. Весь представленный материал получен, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика обследованных больных

Группу обследуемых составили 143 больных онкогематологическими заболеваниями: неходжкинскими злокачественными лимфомами (НХЗЛ) – 73 пациента, лимфомой Ходжкина (ЛХ) – 30 больных и 40 - первичным миелодиспластическим синдромом (МДС), госпитализировавшихся в г. в специализированное гематологическое отделение муниципального учреждения здравоохранения городской клинической больницы №2 г. Новосибирска.

Среди пациентов, страдающих гемобластозами, преобладали мужчины - 88 человек (61,5%), женщин было,5%). Возраст обследуемых варьировал от 16 до 74 лет, преобладали лица среднего и старшего возраста 50-69 лет (50,2%), при этом средний возраст составил 46,2±3,5 года.

В анализируемой группе больных лимфомами наибольшее число пациентов – 61 человек (59,2%) страдали неходжкинскими лимфомами IV стадии, у 5 человек (4,9%) диагностирована I стадия, 5 человек (4,9%) имели II стадию и 2 человека (1,9%) – III стадию. В группе больных лимфомой Ходжкина II стадия была диагностирована у 13 пациентов (12,6%), III стадия – у 9 (8,7%), IV стадия – у 8 человек (7,8%), I стадия не выявлена ни у одного больного.

В группе больных первичным миелодиспластическим синдромом у наибольшего числа пациентов – 23 человек (57,5%) была диагностирована рефрактерная анемия (РА), у 10 пациентов (25,0%) – рефрактерная анемия с кольцевидными сидеробластами (РАСК), у 7 (17,5%) – рефрактерная анемия с избытком бластов (РАИБ).

Больные, включенные в исследование, получили от 4 до 8 курсов полихимиотерапии, в среднем 4,7 курсов. В терапии использовались следующие протоколы: при индолентных НХЗЛ – СОР (циклофосфан, винкристин, преднизолон), СНОР (циклофосфан, винкристин, преднизолон, доксорубицин), при агрессивных НХЗЛ – СНОР, СНОЕР (циклофосфан, винкристин, преднизолон, доксорубицин, вепезид), DНАР (дексаметазон, цитозар, цисплатин), при лимфоме Ходжкина – ABVD (адриабластин, блеомицин, винбластин, дакарбазин), BEACOPP (циклофосфан, доксорубицин, вепезид, прокарбазин, преднизолон, винкристин, блеомицин).

Общеклинические методы исследования

Пациенты обследовались с использованием стандартного набора клинических и инструментальных методов, включавших исследование показателей гемограммы, миелограммы, трепанобиоптата. При наличии лимфаденопатии или органных поражений проводилась обязательная биопсия опухоли с морфологическим исследованием ткани лимфоидной неоплазии. В целях изучения распространенности НХЗЛ и верификации стадии заболевания использовались инвазивные (ЭФГДС, ФКС и другие) и неинвазивные методы (УЗИ внутренних органов, рентгеновская компьютерная томография или магниторезонансная томография). Исследовались основные биохимические показатели, в том числе общая лактатдегидрогеназа, уровень белка плазмы крови, билирубин, трансаминазы, щелочная фосфатаза. На этапе первичной диагностики, в динамике наблюдения и лечения все больные проходили предусмотренные стандартными протоколами химиотерапии обследования.

Специальные методы исследования

Проводилось цитологическое исследование препаратов периферической крови и пунктатов костного мозга с оценкой морфологии элементов и наличия диспластических изменений. Оценку дисплазии элементов костного мозга проводили в соответствии с критериями, предложенными J. Goasquen и соавторами, принятыми в качестве стандарта в классификации ВОЗ (2000). В эритроидном ряду в процентах определяли число клеток с мегалобластоидными признаками, многоядерные формы, наличие анизо - и пойкилоцитоза эритрокариоцитов, наличие цитоплазматических мостиков, элементов с признаками кариорексиса, наличием базофильной пунктации эритроцитов, телец Жолли. Дисплазия эритроидного ростка диагностировалась при наличии более 50% измененных форм. Оценивали не менее 25 клеток. Гранулоцитарный росток расценивался как дисплазированный при наличии более 50% клеток с признаками дисплазии: анизоцитозом гранулоцитов, гиперсегментацией ядер нейтрофилов, гипогрануляцией, наличием пельгероидных форм. Анализировали не менее 25 клеток. Дисплазия мегакариоцитарного ростка устанавливалась при наличии микроформ и/или одноядерных форм мегакариоцитов более чем в 50% клеток. Подсчитывали не менее 6 клеток. Ростки гемопоэза со сниженной клеточностью рассматривались как недисплазированные.

Проводилось измерение среднего диаметра эритроцитов с помощью окуляра-микрометра.

Использовалась методика цитохимического окрашивания препаратов пунктатов костного мозга на выявление гранул гемосидерина с подсчетом процентного содержания сидероцитов.

Исследование обмена железа (сывороточное железо, общая железосвязывающая способность сыворотки крови (ОЖСС), коэффициент насыщения трансферрина (КНТ)) осуществлялось в лаборатории МУЗ ГКБ№2. Также определялся уровень ферритина сыворотки крови методом иммуноферментного анализа в лаборатории Областного диагностического центра. Уровень сывороточного эритропоэтина, витамина В12 и фолиевой кислоты в сыворотке крови исследовались в лаборатории диагностика» методом ферментативно-усиленной хемилюминесценции (технология DPC, США), являющимся модернизированным иммуноферментным анализом с высокой специфичностью и чувствительностью (исследование выполнено совместно с к. м.н. ).

Основной молекулярно-биологической технологией данной работы являлось иммуноцитохимическое исследование биопсийного материала опухоли.

С целью характеристики иммунологического фенотипа была использована панель моноклональных антител (МКА). Использовались концентрированные, лиофилизированные и ready-to-use МКА, приобретенные у компаний-лидеров по производству реактивов для молекулярно-генетических исследований: DAKO, Novocastra, R&D и других.

Список моноклональных антител (МКА), входивших в исследовательскую панель, включал следующие позиции и соответствующие им гибридомные клоны:

1. МКА против белков-регуляторов апоптоза и онкопротеинов (CD95 (Fas-лиганд) (DX2), p-53 (DO7), вcl-2 (клон 100/D5), с-myc (онкопротеин) (9E11)).

2. Маркеры пролиферативной активности (Ki-67 (MIB-1)).

3. МКА против белка – продукта гена множественной лекарственной резистентно­сти (MDR1) (p-glycoprotein (клон JSB-1)).

Метод иммуноцито(гисто)химического исследования фенотипа клеток опухолевого субстрата

Исследование иммунологического фенотипа опухолевых клеток осуществлялось с помощью систем визуализации (LSAB+, LSAB2 (DAKO), основанных на стреп­тавидин-биотиновой или полимерной (EnVision Systems (DAKO)) методиках с использованием цитохимической метки щелочной фосфатазой (для иммуноцитохимического исследования) или пероксидазой.

Использовался стандартный метод иммуногисто(цито)химического исследова­ния.

Основным материалом для работы являлся субстрат опухоли, полученный методом открытой или пункционной (при поражении костного мозга) биопсии опухоли. Исследовались мазки стернального пунктата или трепанобиоптата.

Статистическая обработка результатов исследования

Первичным материалом исследования являлись истории болезни пациентов с гемобластозами, амбулаторные карты, компьютерная база данных Городского гематологического центра, содержащая паспортные, клинические и клинико-лабораторные показатели по каждому случаю, протоколы иммуноцито(гисто)химических исследований и заключения по ним.

Вся информация была преобразована в формат электронных таблиц Exсel. Сформированная база данных настоящего исследования в последующем проходила математическую обработку с помощью пакета прикладных математических программ STATISTIKA 6 версия (StatSoft Inc.) с использованием статистических возможностей Excel.

При анализе клинических, морфологических и параклинических данных были использованы методы описательной статистики с подсчетом средних величин числовых показателей, ошибки средних (р<0,05)и другие варианты анализа:

- непараметрическое сравнение (критерии Манна-Уитни, Вальда-Вольфовица, Колмогорова-Смирнова).

- коэффициент корреляции Спирмена для оценки взаимосвязи между параметрами с определением коэффициента ранговой корреляции (, 2001).

Целесообразность применения методик непараметрического сравнения диктовалась тем, что, по данным ряда исследований (, 1990), для медико-биологических показателей этот подход дает более стабильные и надежные оценки статистических характеристик.

Многолетняя выживаемость пациентов в группах исследовалась с помощью метода анализа цензурированных данных с использованием функции вероятности выживания по Каплану и Мейеру с расчетом логарифмического рангового критерия (log-rank) для оценки достоверности различий выживаемости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Цитоморфологические особенности кроветворения у больных лимфомами и первичным МДС до начала химиотерапии

Согласно литературным данным, миелодисплазия часто встречается при гематологических заболеваниях. Как показали с соавт. (2005), при остром миелобластном лейкозе частота миелодисплазии составляет 65,2%, с соавт. (2008) описывают эритроидную дисплазию у 16% больных типичной апластической анемией.

В нашем исследовании признаки дисплазии элементов костного мозга у больных лимфомами отмечены у 64,1% пациентов еще до начала специфической терапии. Частота встречаемости одно - и двухлинейной миелодисплазии достоверно не отличалась от таковой у больных первичным миелодиспластическим синдромом как до, так и после лечения, тогда как трехлинейная миелодисплазия до начала полихимиотерапии (ПХТ) встречалась реже: при неходжкинских злокачественных лимфомах (НХЗЛ) - в 38,4% случаев, лимфоме Ходжкина (ЛХ) – в 23,3% случаев. После проведения пациентам ПХТ трехлинейная миелодисплазия определялась уже у 50,0% больных ЛХ и 65,8% больных НХЗЛ, причем в последнем случае она достоверно не отличалась от таковой у больных первичным миелодиспластическим синдромом (МДС) (77,5%) (табл.1).

Таблица 1.

Частота встречаемости мультилинейной миелодисплазии у больных лимфомами и первичным МДС

Среди признаков дисплазии эритроидного ряда наиболее часто отмечено наличие цитоплазматических мостиков - у 42,5% пациентов с неходжкинскими лимфомами до ПХТ и у 50,7% после лечения, что достоверно не отличалось от частоты встречаемости при первичном МДС – 55,0%. Многоядерные нормоциты встречены у 32,9% больных НХЗЛ до ПХТ и у 46,6% после, при первичном МДС – у 57,5% пациентов. Мегалобластоидность ядер эритрокариоцитов наблюдалась у 15,1% больных лимфомами до ПХТ и у 40,0% после полихимиотерапии и также достоверно не отличалась от частоты встречаемости при первичном МДС – у 37,5% (15) (табл. 2).

Таблица 2

Морфологические изменения клеток эритроидного ряда у больных лимфомами и первичным МДС

Дизгранулоцитопоэз до начала специфической противоопухолевой терапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями проявлялся гипогрануляцией нейтрофилов у 56,2% пациентов НХЗЛ до ПХТ и у 80,8% после, у 33,3% - с ЛХ до и 63,3% после ПХТ (р<0,05). Частота встречаемости гипогранулированных нейтрофилов при лимфомах после начала ПХТ достоверно не отличалось от показателей при первичном МДС – 80,0%. У 12,3% больных НХЗЛ до ПХТ отмечено появление пельгероидных форм гранулоцитов, число которых после ПХТ возросло до 34,2% и было аналогично таковому при первичном МДС – 55,0% случаев (р>0,05) (табл.3).

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3