Оптимизация режимов лечения больных с бластным кризом хронического миелолейкоза с учетом лекарственной чувствительности бластных клеток in vitro 14.00.29 – гематология и переливание крови (стр. 3 )

Терапия пациентов с НБК ХМЛ была менее унифицированной, однако, половине из них (7 из 14 ) была проведена агрессивная ПХТ по программам 7+3 с идарубицином, VAC, протоколу BFM-83 I и II фазы.

Необходимо отметить, что до начала исследования 6 пациентов с БК ХМЛ из группы ПХТ (3 – с ЛБК, 3 – с НБК) уже получали лечение по поводу БК ХМЛ по другим программам. Из 3 больных с ЛБК первый получал гидреа и роферон; вторая больная - единичные введения винкристина, рубомицина и 6-меркаптопурин; третья больная принимала иматиниб мезилат. Среди больных с НБК все 3 предлеченных пациента получали ПХТ по программе 7+3. Ни в одном случае (ЛБК, НБК) эффект не был достигнут.

В связи с этим, указанные больные были переведены на программы терапии II линии. Из предлеченных пациентов с НБК 1 больной получил курс ПХТ по схеме 7+3 с идарубицином, вторая пациентка – курс по программе VAC и третья больная – терапию по протоколу BFM-83 I и II фазы. Ответ на лечение по программам II линии анализировался в настоящем исследовании.

Большинство больных, принимавших иматиниб мезилат (n=21), получали курсы полихимиотерапии на предыдущих этапах наблюдения (n=13, 59%). Программы проведенной ранее терапии были разнообразными и весьма разнородными.

Поддерживающая терапия включала гидреа, 6-меркаптопурин, курсы ПХТ по схемам СОАР, 7+3 (5+2), AVAMP 1 раз в 1,5-2 мес., вепезид, у 3 больных – курсы малых доз цитозара в сочетании с приемом весаноида. Двое больных (1 – в рецидиве БК, 1 – во 2 ФА) получали иматиниб мезилат.

В настоящее исследование включен 21 больной, получавший иматиниб мезилат. Первоначальная доза препарата у каждого из них составила 600 мг. Тактика терапии иматиниб мезилатом представлена ниже.

Модификация доз иматиниб мезилата

Токсичность оценивалась по общим критериям токсичности Нью-Йоркского Ракового Института (National Cancer Institute, Bethesda.Cancer Therapy Evaluation Program. Common Toxicity Criteria, version 2.0, March 1998) [19].

Изменение доз иматиниб мезилата проводилось согласно алгоритму, предложенному в клиническом испытании расширенного доступа к препарату иматиниб мезилат (CLINICAL TRIAL OF EXPANDED ACCESS TO STI571, 2000).

Модификация дозы в связи с негематологической токсичностью

При наличии негематологической токсичности 2 степени, продолжающейся более 2 дней, прием препарата прекращался до тех пор, пока степень токсичности не снижалась до 1. После отмены прием иматиниба возобновлялся в дозе 600 мг в день. Если явления токсичности 2 степени возобновлялись, прием препарата прекращали до тех пор, пока степень токсичности не снижалась до 1. После отмены прием иматиниба возобновляли в сниженной дозе - 400 мг в день. При возобновлении токсичности 2 степени аналогичным образом производили снижение дозы до 300 мг в день.

При развитии негематологической токсичности 3-4 степени прием иматиниба прекращали до тех пор, пока степень токсичности не снижалась до 1. Затем прием препарата возобновляли в сниженной дозе 400 мг в день. При возобновлении токсичности 3-4 степени аналогичным образом производили снижение дозы до 300 мг в день.

Модификация дозы в связи с гематологической токсичностью

При анемии любой степени, нейтропении или тромбоцитопении 1-3 степени снижения дозы не предусматривалось. Проводили трансфузии эритроцитарной массы при появлении жалоб «анемического характера». Снижение дозы не предусматривалось при тромбоцитопении 4 степени, если уровень тромбоцитов удавалось поддерживать с помощью переливаний тромбоцитов. При невозможности трансфузий тромбоцитов и при нейтропении 4 степени предусматривался следующий алгоритм:

1) в течение первых 28 дней терапии изменений дозы не производили;

2) через 28 дней терапии у пациентов с нейтро - или тромбоцитопенией 4 степени, продолжавшихся более 2 недель, производили стернальную пункцию. При малоклеточном костном мозге и количестве бластов <10% дозу снижали до 400 мг/день.

Если нейтропения 4 степени и/или тромбоцитопения 4 степени персистировали в течение еще 2 недель, исследование аспирата повторяли. При снижении клеточности костного мозга и наличии <10% бластов дозу препарата снижали до 300 мг/день.

Если нейтропения 4 степени и/или тромбоцитопения 4 степени сохранялись еще 2 недели, и при повторном исследовании костного мозга наблюдали аналогичную картину, прием иматиниба прекращали до тех пор, пока абсолютное число нейтрофилов (АЧН) не увеличивалось до >1,0 x 109/л и количество тромбоцитов не возрастало до >20 x 109/л, после чего прием препарата возобновляли в дозе 300 мг/день.

Если костный мозг был достаточно клеточным, и количество бластов превышало 10%, прием иматиниба продолжали в дозе 600 мг/день.

Если во время перерывов в терапии или во время приема сниженной дозы препарата в крови или костном мозге появлялись бласты, или возрастало их количество, прием препарата возобновляли в полной дозе 600 мг/день.

При отсутствии гематологического ответа после приема препарата в течение не менее 4 недель в дозе 600 мг/день мы повышали дозу иматиниба до 800 мг/день. Пациентам, у которых гематологический ответ не был полным через 2 месяца терапии, или развился рецидив после полного гематологического ответа (подтвержденный результатами гемограммы и/или миелограммы с интервалом в 2 недели), дозу иматиниба повышалиь до 800 мг/день. Эту суточную дозу препарата разделяли на 2 приема по 400 мг.

При проведении как химиотерапии, так и лечении иматиниб мезилатом, мы использовали любую сопутствующую терапию, необходимую для поддерживающего лечения пациентов и в целях их безопасности. На фоне терапии иматиниб мезилатом допускали интратекальную химиотерапию как лечение или профилактику нейролейкемии. Введение других противоопухолевых препаратов не было предусмотрено.

Пациенты с гиперлейкоцитозом в крови > 20 х 109/л получали аллопуринол 300 мг в день за 48-24 ч до начала приема иматиниб мезилата. При стабилизации уровня лейкоцитов и нормальных показателях мочевой кислоты прием аллопуринола прекращали.

Гидроксимочевину в дозе 5 г в день применяли в течение не более 7 дней от начала приема иматиниб мезилата.

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1 Цитохимические исследования

Проведены нами у 39 пациентов. Использованы следующие цитохимические методы исследования:

-определение мукополисахаридов (PAS-реакция) по Mac-Manus;

-определение миелопероксидазы по van Dein;

-определение активности a-нафтилацетатэстеразы по Hayhoe и соавт.;

-в ряде случаев – определение фосфолипидов с применением судана черного Б по Hayhoe и соавт.

Лимфоидный вариант БК устанавливали при гранулярной PAS-реакции и отсутствии реакций на миелопероксидазу и α-нафтилэстеразу. Нелимфоидный вариант БК ХМЛ устанавливали при положительной реакции на миелопероксидазу, а также при диффузно-гранулярной и диффузной PAS-реакции.

При наличии в опухолевых клетках α-нафтилацетатэстеразы, легко подавляющейся фторидом натрия, регистрировали наличие моноцитарного компонента (миеломонобластного БК ХМЛ).

Реакцию считали положительной при выявлении ее не менее чем в 10% бластных клеток.

2.2.2. Иммунофенотипирование

Выполнено у 34 больных: у 21 из 27, получивших ПХТ, и у 13 из 21, принимавших иматиниб.

Среды, сыворотки.

Для приготовления клеточных суспензий использовали синтетическую среду 199 на растворе Хенкса производства НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН РФ, г. Москва.

Для постановки реакции иммунофлюоресценции использовали IFA-среду: PBS, содержащий 2% ТЭС, 0,1% азида натрия и 0,01М Hepes.

Реактивы

Раствор для лизиса эритроцитов: 10-кратный концентрат (Beckton Dickinson) разводили дистиллированной водой и применяли по 0,5 мл на одну процедуру лизиса.

Фиколл-верографин: 9% фиколл 400000 (Pharmacia Fine Chemicals), 34% верографин (Югославия). Смесь готовили из 12 частей 9% фиколла и 5 частей верографина. Плотность смеси 1,076 г/см.

Гепарин: 50 ед/мл в 199 среде.

Желатин: 10% раствор

Раствор для фиксирования клеток: 1% формалин, приготовленный на физиологическом растворе.

Таблица 2. Моноклональные антитела (МКА), используемые при иммунофенотипировании ХМЛ БК

Выделение клеток

Выделение мононуклеарных клеток крови и костного мозга

В пробирку с раствором желатина (1 мл) у пациента брали кровь 9 мл из локтевой вены или костный мозг 2 мл при стернальной пункции, перемешивали пипеткой. Помещали пробирку в термостат на 40 минут. Затем пробирку вынимали, удаляли надосадочную жидкость, клетки дважды отмывали в среде 199 и подсчитывали в камере Горяева.

Реакция поверхностной имунофлюоресценции

Непрямая реакция поверхностной иммунофлюоресценции

5 х 105 клеток инкубировали с 20 мкл МКА в течение 30 мин при 20°С, после чего клетки дважды отмывали PBS. Затем клетки инкубировали с 20 мкл бараньей антисыворотки против иммуноглобулинов мыши, меченной FITC в течение 30 мин при 4°С, после чего дважды отмывали PBS и ресуспензировали в PBS, содержащем 1% формалин.

Прямая реакция поверхностной иммунофлюоресценции

5 х 105 клеток инкубировали с 20 мкл меченных FITC (флюоресцинизотиоцианатом) или РЕ (фикоэритрином) МКА в течение 30 мин при 4°С, после чего дважды отмывали PBS и ресуспензировали в PBS, содержащем 1% формалин.

Проточно-цитометрический анализ

Методом иммунофенотипирования и проточной цитофлюорометрии определялась экспрессия антигенов на бластных клетках. Анализ проводился на проточном цитометре FACScan (Beckton Dickinson). Выделение опухолевых клеток (гейтинг) выполнялось на основе параметров прямого и бокового светорассеяния лазерного луча, дающих возможность распределения в двойном измерении клеточных популяций в зависимости от размера клетки и степени гранулярности цитоплазмы. В каждой пробе анализировалось 5000 событий.

Программное обеспечение

Анализ данных, полученных с помощью проточного цитофлюориметра FACScan, проводили с использованием программного обеспечения фирмы Hewlett Packard, комплектуемого вместе с проточным цитофлюориметром (программы “FACScan” и “Paint-a-Gate”).

Каждый маркер считали диагностически значимым, если он выявлялся не менее чем в 20% исследуемых клеток.

Лимфоидный бластный криз (ЛБК) ХМЛ устанавливали при наличии маркеров, характерных для лимфоидной дифференцировки – антигенов CD10, CD19 и/или CD22.

Нелимфоидный бластный криз (НБК) ХМЛ диагностировали по экспрессии поверхностных антингенов миелоидных и моноцитарных клеток: CD15, CD13, CD14 и CD11b.

Смешанный вариант БК ХМЛ устанавливали при определении на бластных клетках больного антигенов 2 клеточных линий – миелоидной и лимфоидной дифференцировки.

2.2.3 Исследование лекарственной устойчивости in vitro

Для исследования ЛУ in vitro применялись методы DiSC (differential staining cytotoxicity) и MTT (на основе соли тетразолия 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида – сокращенно MTT). Изучали чувствительность к следующим цитостатическим препаратам in vitro: рубомицину, винкристину, цитозару, вепезиду, преднизолону, метотрексату, 6-меркаптопурину, идарубицину, карбоплатину, а также к иматинибу.

Стадии тестирования лекарственной чувствительности in vitro:

1.Выделение клеток.

2.Инкубация клеток с лекарственными препаратами.

3.Оценка жизнеспособности клеток.

4.Интерпретация результатов.

Метод DiSC (differential staining cytotoxicity)

Бластные клетки из образцов крови или костного мозга больных, содержащих менее 80% бластов, выделяли в градиенте плотности фиколл-верографин. Затем добавляли среду RPMI и цитостатические препараты. В исходной смеси содержалось не менее 100 тыс клеток. Эту смесь суспензии бластных клеток с химиопрепаратами разводили на 5 концентраций в бессывороточной среде, так, чтобы в каждой лунке оставалось 200 мкл смеси, и инкубировали в течение 96 час. при 37°С в среде, содержащей 5% СО2. Затем из каждой лунки отбирали 150 мкл клеточной суспензии и к оставшимся 50 мкл добавляли 50 мкл красителя на 5-10 мин. За это время на предметные стекла наносили клеточную суспензию с различными концентрациями цитостатических препаратов. Затем предметные стекла центрифугировали в цитоцентрифуге в течение 10 мин при 1200 об./мин После окончания центрифугирования на каждом стекле под микроскопом с увеличением х 90 под иммерсионным маслом подсчитывали количество «живых клеток» (погибшие клетки окрашивались в зеленый цвет красителем Fast Green Nigrosin). Допустимым считалось наличие не менее 80% живых клеток в контроле. Затем мазки окрашивали гематоксилин-эозином по стандартной методике. Производили подсчет «живых» опухолевых клеток по формуле: количество живых бластов/ (количество «живых» бластов + количество погибших незрелых и вызревающих клеток + количество «живых» вызревающих и зрелых клеток) х 100%.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10