Hoe Fluorescentie Quenching In Proteïne- en Membraansystemen Wordt Gebruikt in Biochemisch Onderzoek

Een van de populairste quenchers die wordt gebruikt in proteïneonderzoek is acrylamide. Het pionierswerk over het quenching van proteïnen met acrylamide werd uitgevoerd door Maurice Eftink en zijn promotor Camillo Ghiron. Eftink zette zijn studies over acrylamide voort, en zijn werk is essentieel voor iedereen die zich in dit vakgebied wil verdiepen (zie bijvoorbeeld de review van Eftink uit 1991 in de aanvullende literatuur). Een belangrijke reden voor de populariteit van acrylamide is de eenvoud waarmee het kan worden toegepast: het hoeft alleen maar aan de cuvet te worden toegevoegd die het proteïne bevat. Een voorzorgsmaatregel is echter dat men moet opwekken bij 295 nm of hoger, aangezien acrylamide steeds meer zal absorberen naarmate de golflengte afneemt. Dit kan een probleem vormen als men bijvoorbeeld tyrosine-residuen wil bestuderen. Bovendien is acrylamide verre van een universele quencher; het zal niet alle fluoroforen even effectief quenzen. Zoals Eftink et al. (1987) aantonen, is acrylamide bijvoorbeeld uitstekend voor indolgerelateerde verbindingen, maar een slechte quencher voor verschillende naftaleengebaseerde verbindingen en zal het acridine, fluoresceïne, eosine Y of proflavine helemaal niet quenzen.

Quenching van levensduur van enkele nanoseconden, zoals de fluorescentie van proteïnen, met moleculair zuurstof vereist een drukcel die in staat is om tot 100 atm zuurstof vast te houden. Dit komt door de relatief lage oplosbaarheid van moleculair zuurstof in waterige oplosmiddelen. Bij 1 atm en 25°C is de zuurstofconcentratie in een lucht-geëquilibreerde oplossing slechts 0,001275 M. Bij een druk van 100 atm zal de zuurstofconcentratie in waterige oplossingen ongeveer 0,13 M zijn. Als men echter over een geschikte drukcel beschikt, kan zuurstofquenching een waardevolle methode zijn om quenching te bestuderen zonder de complicaties van de lading of polariteit van het quencher-molecuul. Experimenten die zuurstofquenching van de intrinsieke tryptofaanfluorescentie in proteïnen onderzochten, uitgevoerd door Lakowicz en Weber, toonden aan dat O2-moleculen gemakkelijk kunnen doordringen in de binnenkant van proteïnen, wat hielp bij het vaststellen van het vakgebied van proteïndynamica.

Fluorescentiequenching is niet alleen nuttig voor het bestuderen van lipide-bilagen, maar ook voor het analyseren van de tryptofaanfluorescentie van membraaneiwitten. Een methode genaamd distributieanalyse (DA), ontwikkeld door Alexey Ladokhin in de jaren 90, maakt gebruik van lipide-gehechte quenchers, zoals bromolipiden of lipiden met spin-gelabelde groepen. Quenchingstudies met pyreen-lipiden hebben de distributie van zuurstof en stikstofmonoxide in verschillende membranen bestudeerd. De lange opgewonden levensduur van pyreen maakt het mogelijk om de relatief lage concentraties van deze gasvormige moleculen te detecteren.

De aanwezigheid en eigenschappen van membraanmicrodomeinen, zoals de vaak controversiële "raft" domeinen, zijn ook belangrijk voor de discussie over biomembranen. Fluorescentiequenching wordt vaak gebruikt in studies die gericht zijn op het begrijpen van deze microdomeinen. Verschillende typen quenching-assays zijn ook ontwikkeld voor het bestuderen van membraanfusie. In het geval van vesiculaire fusie kan een populatie vesikels worden gelabeld met een fluorofore en een andere populatie met een quencher, waarna de quenching optreedt bij fusie. Een alternatieve benadering is om vesikels die geen fluoroforen bevatten te mengen met vesikels die ze wel bevatten, wat leidt tot een afname van de fluorofore concentratie per vesikel bij fusie en dus een verlichting van de quenching.

Hoe Werkt Confocale Fluorescentiemicroscopie en Wat Zijn de Voordelen?

Confocale fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van een techniek die het mogelijk maakt om scherpere en gedetailleerdere beelden te verkrijgen van monsters die fluorescentie vertonen. De techniek is gebaseerd op het gebruik van een pinhole, een klein gat voor de detector, dat ervoor zorgt dat alleen het licht dat afkomstig is van het focale punt van het monster wordt doorgelaten. Hierdoor worden lichten die uit verschillende diepten van het monster komen, gefilterd en wordt het uiteindelijke beeld scherp en gedetailleerd.

Het voordeel van confocale microscopie is niet alleen een verbeterde beeldkwaliteit, maar ook de mogelijkheid om het scherpstelpunt langs de Z-as te bewegen. Dit maakt het mogelijk om afbeeldingen van verschillende secties binnen het monster te verkrijgen. Deze secties kunnen dan gecombineerd worden om een driedimensionale reconstructie van het monster te maken, wat enorm waardevol is voor biologische en biomedische toepassingen.

Hoewel confocale microscopie in de jaren 1950 door Marvin Minsky werd voorgesteld, werd de techniek pas in de late jaren 1970 wijdverspreid, toen lasertechnieken werden ontwikkeld die het mogelijk maakten om de techniek te verbeteren. Een veelgebruikte methode voor het scannen van monsters in een confocale microscoop is raster scannen. In deze benadering wordt de positie van het laserlicht op het monster gecontroleerd door een paar galvanometrische spiegels die onafhankelijk van elkaar kunnen bewegen. Hierdoor wordt het excitatielicht in een herhalend patroon over het monster gescand, wat resulteert in een gedetailleerd beeld.

Een alternatief voor raster scannen is het gebruik van een draaiend schijfconfocale microscoop, waarin het excitatielicht door twee roterende schijven met microlenzen en pinholes wordt geleid. Deze techniek maakt het mogelijk om meerdere plekken van het monster tegelijk te belichten, wat resulteert in snellere beeldacquisitie in vergelijking met de raster scanmethode.

Een andere benadering van confocale beeldvorming is de Selectieve Vlakbelichting Microscopie (SPIM), ook wel lichtblaasmicroscopie genoemd. In deze methode wordt een dunne lichtstraal gebruikt om verschillende vlakken in het monster te verlichten, wat het mogelijk maakt om afbeeldingen van verschillende diepten in het monster te verkrijgen zonder dat er een pinhole nodig is. Het grote voordeel van SPIM is dat het inherent confocaal is en snellere tijdsbeelden mogelijk maakt, wat belangrijk is voor het verminderen van fototoxiteit bij langdurige opnames.

Belangrijk voor de lezer is het besef dat hoewel de hierboven beschreven methoden en technieken aanzienlijke verbeteringen bieden ten opzichte van traditionele microscopie, er altijd keuzes moeten worden gemaakt op basis van de specifieke vereisten van het experiment. Het gebruik van confocale en andere geavanceerde microscopen vereist zorgvuldig afwegen van de technische mogelijkheden en de wetenschappelijke vraag die men wil beantwoorden. De keuze voor raster scannen versus draaiend schijf scannen, bijvoorbeeld, zal afhangen van de snelheid en de resolutie die gewenst zijn in het experiment. Daarbij komt dat confocale microscopie met zijn driedimensionale reconstructies een ongelooflijke hoeveelheid informatie biedt, maar de resultaten vaak afhankelijk zijn van de kwaliteit van de optische instrumenten en de gebruikte fluoroforen.

Waarom Polarisatie/Anisotropie een Populaire Methode is in Klinische Chemie en Geneesmiddelenonderzoek

Polarisatie en anisotropie zijn twee fundamentele concepten die vaak worden toegepast in biochemische en biophysische rapporten. De populariteit van deze methoden in klinische chemie en geneesmiddelenonderzoek komt voort uit hun vermogen om interacties van moleculen, zoals eiwit-eiwitinteracties, nauwkeurig te detecteren. Polarisatie, of de mate van anisotropie, speelt een cruciale rol bij het begrijpen van de dynamiek van moleculaire interacties in biologische systemen. Deze technieken zijn van groot belang geworden in het veld van fluorescerende spectroscopie en hebben zich bewezen als uitstekende methoden voor het detecteren van moleculaire veranderingen, waaronder FRET (Förster Resonance Energy Transfer).

Daarnaast is de fluoriscentielevensduur, een essentieel aspect in veel fluoriscentietechnieken, cruciaal bij het begrijpen van deze processen. Fluorescentielevensduur is de tijd tussen de absorptie van een foton door een fluorofore en de daaropvolgende emissie van een foton. Deze waarde verschilt per fluorofore en is afhankelijk van de omgeving en de interacties waaraan het molecuul deelneemt. In tegenstelling tot radioactief verval, waar de exacte tijd van fotonemissie willekeurig is, kunnen we de levensduur van de fluorescente toestand zeer nauwkeurig bepalen door een groot aantal absorptie- en emissieprocessen te volgen. Dit maakt de techniek uiterst waardevol voor het begrijpen van dynamische moleculaire interacties, waaronder die welke plaats vinden tijdens FRET-experimenten. Het meten van fluorescente levensduur is ook een krachtige benadering bij geavanceerde microscopische technieken zoals Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), waar het in kaart brengen van de variaties in levensduur in cellulaire structuren en netwerken van groot belang is.

Voor wie geïnteresseerd is in het toepassen van fluorescente technieken in biomedisch onderzoek, is het cruciaal om niet alleen de basisprincipes van fluorescentie en de specifieke technieken te begrijpen, maar ook de mogelijke valkuilen en artefacten die optreden bij dergelijke metingen. Het juiste gebruik van fluorescentiemetingen kan krachtig zijn, maar het vereist ook een grondig begrip van de onderliggende principes en mogelijke fouten. Een solide basis in de theoretische aspecten van fluorescence zorgt ervoor dat de experimenten juist worden uitgevoerd en geïnterpreteerd, wat essentieel is voor betrouwbare onderzoeksresultaten.

De toepassing van deze technieken heeft inmiddels een breed scala aan gebruiksomgevingen gevonden, van basisonderzoek in moleculaire biologie tot klinische diagnostiek. Fluorescentie heeft de afgelopen decennia een revolutie teweeggebracht in de biowetenschappen, en het gebruik van geavanceerde fluorescente technieken, zoals FLIM en FRET, zal naar verwachting alleen maar toenemen. De wetenschap achter deze technieken blijft zich ontwikkelen, en nieuwe methoden en toepassingen worden voortdurend ontdekt. Daarom is het belangrijk om niet alleen de huidige technologieën te begrijpen, maar ook open te staan voor innovaties die de grenzen van wat mogelijk is met fluorescerende metingen blijven verleggen.

Hoe Raman-verstrooiing de Fluorescentiemetingen kan Beïnvloeden

Met behulp van de bekende vergelijking kan men eenvoudig de verwachte golflengte voor een Raman-piek van water berekenen, afhankelijk van de excitatie-golflengte. Wanneer men vermoedt dat er een Raman-piek aanwezig is, kan men uiteraard de oplosmiddel-fluoroforen gebruiken in plaats van het monster, met dezelfde instellingen als voor de monsteranalyse. Op deze manier zal men de Raman-piek gemakkelijk kunnen detecteren in het oplosmiddel-spectrum. Een snellere manier is om de excitatiegolflengte met 5 of 10 nm te verschuiven, en als de vermoedelijke piek zich overeenkomstig aanpast, heeft men waarschijnlijk de Raman-piek gevonden.

Een voorbeeld hiervan is te zien in de uncorrecteerde emissie van een verdunde oplossing van het serumalbumine van runderen, geëxciteerd bij 270, 280 en 290 nm. Bij 280 nm excitatie kan men een duidelijke piek rond 310 nm waarnemen, aangezien tyrosine rond 310 nm uitzendt, wat suggereert dat het eiwit tyrosine- en tryptofaaneffecten vertoont. Echter, bij excitatie van 270 nm blijkt dat de “schouder” van de piek zich naar kortere golflengten verplaatst. Bij 290 nm verschuift de piek naar langere golflengten, maar de emissie van het eiwit blijft ongewijzigd. Het is dus duidelijk dat deze piek het gevolg was van de Raman-verstrooiing van water, en het was puur toeval dat de intensiteit van de Raman-piek vergelijkbaar was met de fluorescentie van het eiwit.

Een handige manier om dit experiment uit te voeren, is door te starten met de hoogste mogelijke eiwitconcentratie die praktisch is, de polarisatie/anisotropie te bepalen en vervolgens het monster twee keer te verdunnen door de helft van het monstervolume te verwijderen en dezelfde hoeveelheid buffer toe te voegen. Ideaal gezien zou de polarisatie/anisotropie afnemen naarmate het eiwit dissocieert, zoals weergegeven in Figuur 5.21. Na meerdere herhalingen van deze procedure is het niet ongebruikelijk dat de experimentator opmerkt dat de polarisatie/anisotropie begint te stijgen. Dit is een duidelijke indicatie dat de Raman-piek steeds belangrijker wordt. Omdat de Raman-piek een verstrooiingsfenomeen is, is deze sterk gepolariseerd.

Verder blijkt dat de oplosmiddeloplossingen veel fluorescentier kunnen vertonen wanneer ze op lagere golflengten worden geëxciteerd. Dit komt doordat UV-absorberende moleculen bijna overal in water aanwezig zijn, tenzij er bijzondere zorg wordt besteed aan het voorbereiden van het monster.

Endtext

Waarom het aantal fotonen essentieel is voor nauwkeurige spectrofluorimetrie-metingen

Bij spectrofluorimetrie speelt de precisie van de metingen een cruciale rol in de betrouwbaarheid van de verkregen data. Hoewel veel spectrofluorimeters gebruik maken van fotonentelling om een hoge gevoeligheid te bereiken, blijkt uit ervaring dat sommige gebruikers de waarde van goede telstatistieken niet volledig begrijpen. Dit kan vooral problematisch zijn bij polarisatiemeting, waar de precieze bepaling van de polarisatie vaak belangrijk is voor de interpretatie van de resultaten.

Een van de belangrijkste factoren die de precisie van een fotonentelling beïnvloedt, is het aantal verzamelde fotonen. De precisie van een meting wordt bepaald door de vierkantswortel van het aantal verzamelde fotonen, zoals eerder uiteengezet in de hoofdstukken 3 en 5. Dit betekent dat wanneer er slechts een klein aantal fotonen wordt verzameld—bijvoorbeeld enkele honderden per meting—de precisie van de meting aanzienlijk wordt aangetast. In sommige gevallen, zoals bij bepaalde polarisatiemetingsexperimenten, wordt er bijvoorbeeld minder dan duizend fotonen verzameld, wat resulteert in een slecht nauwkeurige meting.

Het is essentieel om te begrijpen dat de precisie van een fotonentelling toeneemt met het aantal verzamelde fotonen. Dit werd al aangetoond in het werk van Jameson et al. (1978), waarbij de precisie van polarisatiemeting verbeterde van 0,008 naar 0,0008 wanneer het aantal verzamelde fotonen werd verhoogd van 10.000 naar 1.000.000. Het verhogen van het aantal fotonen dat wordt verzameld vereist echter meer tijd en kan in sommige gevallen praktische uitdagingen met zich meebrengen. Daarom moet de keuze voor het aantal te verzamelen fotonen zorgvuldig worden afgewogen, afhankelijk van de vereiste nauwkeurigheid en de beschikbare meettijd.

Het belang van fotonentelling in spectrofluorimetrie kan niet genoeg benadrukt worden. Voor een nauwkeurige meting is het cruciaal dat de operator van de spectrofluorimeter begrijpt dat een groter aantal fotonen resulteert in een lagere meetfout en dus hogere precisie. Dit inzicht kan helpen om onrealistische verwachtingen te vermijden, zoals het verkrijgen van betrouwbare polarisatiewaarden bij een laag aantal fotonen.

Naast het verhogen van het aantal verzamelde fotonen, moeten ook andere factoren in overweging worden genomen om de kwaliteit van de metingen te waarborgen. Het gebruik van geschikte filters, het controleren van de instrumenten op mogelijke defecten en het zorgvuldig kalibreren van de spectrofluorimeter zijn ook van groot belang voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten. Het verwaarlozen van deze aspecten kan de nauwkeurigheid van de metingen verder beperken, zelfs als het aantal fotonen voldoende is.

Verder is het van belang om te begrijpen dat de efficiëntie van de fotonentelling ook afhankelijk is van de gebruikte detectoren. Moderne detectoren, zoals avalanche fotodiodes of hybride detectoren, bieden verbeterde gevoeligheid en kunnen bijdragen aan een betere fotonentelling, vooral bij lage lichtintensiteit. Het juiste gebruik van deze technologieën kan de kwaliteit van de metingen aanzienlijk verbeteren, zelfs wanneer er maar een beperkt aantal fotonen beschikbaar is.