Hoe beïnvloedt conjugatie de lichtabsorptie in moleculen?

In de gasfase zijn de absorptielijnen van atomen zeer scherp. De breedte van de lijnen wordt uitsluitend bepaald door de druk en temperatuur, meestal in het bereik van 10−2 tot 10−1 Å. De energieniveaus zijn duidelijk gescheiden en de absorberende toestanden kunnen volledig worden gekarakteriseerd. Voor moleculen in oplossing is de situatie echter veel complexer. In plaats van een scherpe absorptielijn wordt een brede band waargenomen. Deze breedte ontstaat door de elektronische, vibratoire en roterende overgangen die kunnen plaatsvinden.

waarbij ΔE de energiedifferentie is tussen het j-de en het nulste niveau, en P0 en Pj de degeneraties van de grondtoestand en het j-de niveau zijn, oftewel het aantal toestanden met dezelfde energie. Bij kamertemperatuur bevinden zich meestal maar een klein aantal moleculen in de hogere vibratoire niveaus, aangezien de energieverschillen typisch 3 kcal/mol zijn. Daarom wordt voor praktische doeleinden aangenomen dat lichtabsorptie altijd plaatsvindt vanuit moleculen in het laagste niveau van de grondtoestand.

De meest waarschijnlijke afstand voor het nulste niveau is de evenwichtige interatomaire afstand, ro. Voor hogere vibratoire niveaus wordt de verdeling bimodaal of plurimodaal, waarbij de extreme waarden het belangrijkst zijn. Bij een bepaalde waarde van r, rd, wordt de interactie verwaarloosbaar en kunnen de atomen zich verder uit elkaar trekken zonder verdere verandering in de vibratoire toestand. Het verschil in energie tussen deze toestand en v=0 is de dissociatie-energie (D) van het molecuul, die wordt bepaald door de bindingsenergie tussen de atomen.

Het Franck-Condon Principe

Absorptie of emissie in polyatomische moleculen wordt bepaald door het Franck-Condon principe, dat voor het eerst werd geformuleerd door James Franck in 1925 en later geformaliseerd door Edward Condon in 1926. In de eenvoudigste vorm kan het Franck-Condon principe als volgt worden geformuleerd: veranderingen in de elektronische verdeling gebeuren veel sneller dan veranderingen in bindingshoeken en -afstanden. Daarom kan de nucleaire configuratie van een molecuul, dat wil zeggen de reeks bindingsafstanden en -hoeken, niet merkbaar veranderen tijdens het absorberen of uitzenden van licht door het molecuul.

Bij brede absorptiebanden is de lange-golfstaart vaak thermisch gevoelig. Het verlagen van de temperatuur resulteert vaak in een verschuiving van de bandrand naar kortere golflengten, doordat de thermisch opgewarmde populatie afneemt.

Effect van Conjugatie op Absorptie

Een nuttige, zij het vereenvoudigde manier om lichtabsorptie door moleculen met conjugatie te beschouwen, is via de moleculaire orbitalen theorie, die een lineaire combinatie van atomische orbitalen (LCAO) gebruikt om moleculaire orbitalen te vertegenwoordigen die het hele molecuul beslaan. Deze moleculaire orbitalen kunnen worden geclassificeerd als bindende, antibindende en niet-bindende orbitalen. In de meeste systemen van belang voor de fluorescentiepraktijk, die meestal aromatische moleculen zijn, zijn de π−π* overgangen verantwoordelijk voor de lichtabsorptie in de lagere energiebereiken (in enkele gevallen spelen n−π* overgangen een rol).

Aangezien π-orbitaalbinding optreedt in koolstof-koolstof dubbele bindingen, zijn moleculen met dubbele bindingen van belang, vooral wanneer er een systeem van afwisselende enkele en dubbele bindingen aanwezig is, wat de delocalisatie van π-elektronen mogelijk maakt, ofwel conjugatie. Hoe groter de conjugatie in een molecuul, hoe lager de energie van de π−π* overgang, wat resulteert in een rode verschuiving (ook wel een bathochrome verschuiving genoemd) in de absorptie. Dit effect wordt geïllustreerd in de spectra van polyenen, zoals weergegeven in het diagram.

Naast de verschuiving van de absorptieband in de rode richting, neemt de sterkte van de absorptie toe met de mate van conjugatie. Moleculen met een uitgebreid conjugatiesysteem vertonen typisch een sterkere absorptie met een groter molair extinctiecoëfficiënt. Dit effect wordt verder versterkt bij cis-trans-isomerisatie, waarbij cis-isomeren doorgaans absorberen bij kortere golflengten met een lagere extinctiecoëfficiënt dan hun trans-tegenhangers.

Indien het geconjugeerde systeem van een molecuul aanvullende chemische groepen bevat, zoals carbonyl-, amido- of azo-groepen, kunnen de absorptiekenmerken verder worden aangepast. Deze groepen kunnen de elektronendichtheid binnen het molecuul beïnvloeden, wat de lichtabsorptie verder kan moduleren.

Hoe de Oriëntatie van Monsters de Fluorescentiemeting Beïnvloedt: Belangrijke Overwegingen en Technieken

Bij het uitvoeren van fluorescentiemetingen is het van cruciaal belang om rekening te houden met de oriëntatie van het monster in relatie tot de opwekking van licht. Dit kan een aanzienlijke invloed hebben op de kwaliteit van de verkregen gegevens. Bijvoorbeeld, parasitair licht afkomstig van het opwekkingssysteem, zoals Rayleigh-geesten, kan rechtstreeks worden gereflecteerd naar de emissiearm van het optische pad. Dit kan de nauwkeurigheid van de metingen verstoren door ongewenste reflecties die interfereren met de fluorescerende signalen.

Om deze processen te vergemakkelijken, bieden sommige instrumenten een variabele hoek voor de monsterhouder, wat het mogelijk maakt om de oriëntatie van het monster ten opzichte van het opwekkingslicht te regelen. Dit is bijzonder nuttig voor vaste monsters, zoals bij het onderzoeken van fluorescerende eigenschappen van papier, waarbij de oriëntatie van de monsterhouder het mogelijk maakt om het lichtpad te optimaliseren voor een duidelijker signaal.

Naast de standaard cuvetten zijn er verschillende gespecialiseerde cuvetten beschikbaar die zijn ontworpen voor specifieke toepassingen. Microcuvetten kunnen bijvoorbeeld zeer kleine volumes opvangen, zelfs in de orde van microliters, terwijl andere cuvetten speciaal zijn ontwikkeld voor anaerobe metingen of als doorstroomcellen. Voor degenen die verder willen verkennen welke soorten cuvetten beschikbaar zijn, wordt verwezen naar aanvullende literatuur, zoals de Gryczynskis' boek over praktische fluorescence spectroscopie.

Wat betreft plate readers, de eerste mikroliterplaat werd in 1951 ontwikkeld door Gyula Takátsy. Sindsdien zijn er enorme vooruitgangen geboekt in de ontwerpen van zowel de platen als de lezers zelf. De meest gangbare formaten zijn de 96-wells (8x12) platen, maar er zijn ook platen met een veel hogere capaciteit, waaronder de 384-, 1536- en zelfs 3456-well formaten. Deze hogere capaciteitsplaten zijn bijzonder nuttig voor toepassingen zoals high-throughput screening, die oorspronkelijk bedoeld was voor cellenculturen, maar snel werd aangepast voor andere gebruiksdoeleinden zoals drug discovery.

Een belangrijke stap in de evolutie van plate readers was de integratie van fluorescence metingen. Tegenwoordig kunnen deze instrumenten niet alleen fluorescentie-intensiteiten meten, maar ook spectra, polarisatie en levensduur van de fluorescentie. De mogelijkheid om spectrale informatie te verkrijgen maakt het gemakkelijker om gedetailleerde analyses te doen van fluorescentiegedrag onder verschillende omstandigheden, wat onmiskenbaar nuttig is in diverse wetenschappelijke disciplines.

Het begrijpen van emissiespectra is cruciaal voor veel toepassingen in de fluorescence-spectroscopie. Deze spectra geven de relatie weer tussen de fluorescente intensiteit en de golflengte van het uitgezonden licht. Emissiespectra kunnen worden gebruikt voor zowel kwalitatieve als kwantitatieve toepassingen. In sommige gevallen wordt de intensiteit van het uitgezonden licht gemeten om de hoeveelheid fluorescerend materiaal in een monster te bepalen. Dit is een veelgebruikte methode in sensor-applicaties, waar moleculen worden ontworpen om specifiek te binden aan ionen, antigenen of andere biomoleculen.

Verder kunnen emissiespectra ook belangrijke informatie bieden over de lokale omgeving van de fluoroforen. Sommige fluoroforen vertonen bijvoorbeeld een verschuiving naar langere golflengten (roodverschuiving) als de polariteit van hun oplosmiddelomgeving toeneemt. Dit gedrag wordt veel gebruikt bij de ontwikkeling van milieugevoelige sensoren, die de mogelijkheid hebben om veranderingen in de omgeving van de fluoroforen te detecteren.

Naast de kwantificering van fluorescerende stoffen, kunnen emissiespectra ook een rol spelen in studies naar de intrinsieke fluorescentie van eiwitten. Bijvoorbeeld, de intrinsieke tryptofaanfluorescentie van een eiwit kan nuttig zijn om structurele veranderingen te monitoren, zoals die welke optreden tijdens het binden van een ligand, het samenvoegen van subeenheden of het vouwen en ontvouwen van het eiwit.

Een ander belangrijk aspect is de wijziging van de fluorescentie-intensiteit als gevolg van quenching, waarbij de aanwezigheid van een quenchermolecuul de emissie van het fluorofore vermindert. In sommige gevallen, vooral bij intrinsieke fluorescentie in eiwitten, kan de verandering in emissie niet alleen door intensiteit worden gemeten, maar moet het volledige spectrum worden geanalyseerd om veranderingen in het rendement te detecteren, vooral wanneer een verschuiving in golflengte optreedt.

Naast de basisprincipes van fluorometrie zijn er tal van toepassingen waarin gedetailleerde kennis van spectrale karakteristieken essentieel is voor een succesvol experiment. Het gebruik van variabele-hoek monsterhouders, gespecialiseerde cuvetten en geavanceerde plate readers biedt wetenschappers meer flexibiliteit en precisie bij het uitvoeren van experimenten. Het begrijpen van hoe de oriëntatie van het monster en de eigenschappen van de gebruikte apparatuur de resultaten beïnvloeden, is essentieel voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare data in fluorescence spectroscopie.

Waarom Fluorescentie-emissiespectra Essentieel Zijn voor Kwaliteit en Betrouwbaarheid van Metingen

Fluorescentieonderzoek biedt talrijke mogelijkheden voor het begrijpen en analyseren van biologische en chemische systemen. Terwijl intensiteitsmetingen op zichzelf voldoende kunnen zijn voor bepaalde toepassingen, vooral wanneer men werkt met microscopen of multiwall platenlezers, is het essentieel om bij het werken met in vitro-systemen altijd emissiespectra van monsters vast te leggen. Deze spectra kunnen cruciale informatie verschaffen, die je in staat stelt om potentiële problemen te voorkomen die anders misschien onopgemerkt zouden blijven.

Een van de klassieke moeilijkheden die zich voordoet, is het gebruik van extreem lage concentraties, waarbij het "monster-signaal" wordt overschaduwd door fluorescerende en/of verstrooide achtergrondsignalen. Moderne fluorescentieapparatuur is zo gevoelig dat er bijna altijd een “signaal” wordt gedetecteerd, zelfs als het monster extreem verdund is. Dit kan leiden tot valse interpretaties van de data. Daarom is het vastleggen van emissiespectra een waardevolle praktijk voor iedereen die met fluorescentie in laboratoria werkt.

Bij de eerste verkenning van een reeks emissiespectra werd een aantal algemene richtlijnen geformuleerd:

1. In een zuivere stof die zich in oplossing bevindt in een unieke vorm, blijft het fluorescentiespectrum invariant en onveranderd, ongeacht de golflengte van de excitatie.

2. Het fluorescentiespectrum ligt bij langere golflengten dan het absorptiespectrum.

3. Het fluorescentiespectrum is in grote lijnen een spiegelbeeld van de absorptieband met de laagste frequentie.

Deze punten kunnen geïllustreerd worden door fluoresceïne te gebruiken, een van de meest populaire fluoroforen die in veel experimenten wordt toegepast. Fluoresceïne is de eerste synthetische fluorofore stof, en de absorptie- en emissiespectra van fluoresceïne in een alkalische oplossing (0,01 N NaOH) geven waardevolle inzichten in de relatie tussen absorptie en emissie. Zoals te zien is in de spectra van fluoresceïne, verschuift het emissiemaximum naar langere golflengten in vergelijking met het absorptiespectrum. Dit verschijnsel komt overeen met de algemene richtlijnen en is een belangrijk kenmerk van het gedrag van fluoroforen.

Een belangrijk aspect van fluorescentiemetingen is dat de emissie-intensiteit vaak wordt weergegeven in "arbitraire eenheden". Dit komt omdat de waargenomen fluorescentie-intensiteit afhankelijk is van verschillende instrumentparameters zoals lampintensiteit, sluitschuifbreedte, efficiëntie van de monochromator en andere optische instellingen van het meetapparaat. Dit maakt het moeilijk om absolute fluorescentie-intensiteit zonder enige context te vergelijken, aangezien de gemeten intensiteit ook wordt beïnvloed door de instrumentinstellingen en de aard van de fluorofore stof.

De belangrijkste redenen waarom emissiespectra niet variëren met de excitatiegolflengte, kunnen worden verklaard door het Perrin–Jabłoński-diagram, dat de energietransities van moleculen beschrijft. Dit diagram toont aan dat de excitatieprocessen zo snel plaatsvinden (op de schaal van femtoseconden) dat er geen herstructurering van het molecuul is tijdens de excitatie. Emissie vindt plaats vanuit het laagste vibratieniveau van de eerst opgewarmde elektronische toestand, wat de onafhankelijkheid van de emissie van de golflengte van de excitatie verklaart.

De verschillen in emissie-intensiteit als gevolg van variërende excitatiegolflengten moeten echter niet worden verward met veranderingen in het emissiespectrum zelf. In gevallen waar het emissiespectrum aanzienlijk verschilt afhankelijk van de excitatiegolflengte, kan dit duiden op de aanwezigheid van meerdere fluoroforen in het monster, die verschillende absorptie- en emissiespectra vertonen.

Waarom verschilt het excitatie- en absorptiespectrum in fluorescence-experimenten?

Het is vaak te zien dat het gecorrigeerde excitatie-spectrum niet overeenkomt met het absorptie-spectrum van een eiwit. De reden voor dit verschil is de mogelijke energieoverdracht van tyrosine naar tryptofaan, wat inhoudt dat een deel van het licht dat door de tyrosine-residuen wordt geabsorbeerd, kan leiden tot de excitatie van tryptofaan. Dit fenomeen zal dieper besproken worden in Hoofdstuk 12.

Naast deze basisprincipes zijn er geavanceerdere scantechnieken die van cruciaal belang kunnen zijn bij het analyseren van fluorescentie. Twee van deze technieken zijn (1) de excitatie-emissie matrix (EEM) benadering en (2) de synchronisatie scanmethoden.

De EEM-benadering, geïntroduceerd door Gregorio Weber in 1961, houdt in dat emissiespectra worden verkregen bij verschillende excitatiegolflengten, of omgekeerd, dat excitatiespectra worden verzameld bij verschillende emissiegolflengten. Het idee is dat verschillende fluoroforen verschillende spectrale eigenschappen vertonen, zowel in termen van excitatie als emissie, of beide. De resulterende matrix van intensiteitswaarden die over een bereik van beide golflengten wordt verzameld, is uniek voor elke specifieke mengeling van fluoroforen. In de vroege werken van Weber was de motivatie om te achterhalen hoeveel componenten aanwezig waren in een mengsel. Tegenwoordig wordt deze techniek gebruikt om een unieke "vingerafdruk" van een monster te verkrijgen, wat helpt bij de monsterkarakterisatie of zelfs forensische doeleinden. Een voorbeeld van een EEM is de analyse van ANS gebonden aan BSA, waarbij drie pieken worden waargenomen: de tryptofaan-emissie van BSA, ANS geëxciteerd door diep- en midden-UV, en ANS geëxciteerd via energieoverdracht van de tryptofanen in BSA. De EEM-techniek is ook toegepast op verschillende gebieden, zoals de karakterisering van wijnen en de analyse van organisch materiaal in water, bodems en olie. In de afgelopen jaren is de toepassing van de EEM-techniek in wateronderzoek aanzienlijk toegenomen, vooral gezien de bezorgdheid over de vorming van desinfectiebijproducten bij het gebruik van chloor of andere chemische desinfectiemethoden in drinkwaterbehandeling.

Synchronisatie scanmethoden bieden een alternatieve benadering voor het onderzoeken van mengsels van fluoroforen. In deze techniek worden zowel de excitatie- als de emissiemonochromators tegelijkertijd gescand met een specifieke golflengteverschil (Δλ). Het spectrum dat wordt verkregen varieert afhankelijk van de waarde van Δλ en de spectrale kenmerken van de componenten in het monster. Dit resulteert in een spectroscopische "vingerafdruk" die uniek is voor elk monster en dus nuttig is voor analytische doeleinden. Er zijn verschillende varianten van synchronisatie scanmethoden, zoals constante golflengte, constante energie, en variabele hoeksynchronisatie scanning, hoewel een gedetailleerde bespreking van deze technieken buiten het bestek van dit boek valt.

Naast het gebruik van geavanceerde scantechnieken is het belangrijk om te begrijpen dat de nauwkeurigheid van fluorescentie-analyse sterk afhankelijk is van de juiste interpretatie van de spectrale gegevens. Dit vereist niet alleen kennis van de gebruikte technieken, maar ook een diepgaand begrip van de fysische en chemische eigenschappen van de te analyseren monsters. Fluctuaties in de omgeving, zoals temperatuur en pH, kunnen bijvoorbeeld de emissie van fluoroforen beïnvloeden, wat van invloed kan zijn op de uiteindelijke resultaten. Daarom is het essentieel dat wetenschappers die deze technieken gebruiken, zorgvuldig aandacht besteden aan de voorwaarden waaronder de metingen worden uitgevoerd en geschikte corrigerende stappen nemen wanneer dat nodig is.

Hoe fluorescentie-eiwitten de wetenschap transformeren: Van GFP tot de evolutie van nieuwe fluorescerende eiwitten

De idee dat stoffen, zoals textiel of papier, die verouderd zijn of gelig zijn geworden, weer wit kunnen worden gemaakt door blauw licht toe te voegen, is een optische illusie die tot de verbeelding spreekt. Dit effect van “optische bleking” werd populair in de industrie van wasmiddelen en in de papierproductie, en wordt tegenwoordig zelfs gebruikt om tanden witter te maken. Veel van deze bleekmiddelen zijn gebaseerd op stilbenen, zoals 4,4′-diamino-2,2′-stilbenedisulfonzuur, een verbinding die bijvoorbeeld wordt aangetroffen in sommige synthetische wasmiddelen.

Fluorescente eiwitten, oorspronkelijk ontdekt in de kwal Aequorea victoria, bevatten een bijzonder eiwit, de beroemde Groene Fluorescente Eiwit (GFP). De ontdekking van GFP in 1962 door Shimomura en zijn collega's, die de natuurlijke groene bioluminescentie van deze kwal veroorzaakten, legde de basis voor een revolutie in de moleculaire biologie. In de decennia die volgden, werd het volledige potentieel van GFP gerealiseerd, vooral toen recombinanttechnieken werden ontwikkeld waarmee onderzoekers mutaties in het oorspronkelijke GFP-eiwit konden aanbrengen.

Wat deze eiwitten bijzonder maakt, is de autocatalytische cyclisatie van een specifieke reeks van drie aminozuren: Ser65, Tyr66 en Gly67. Dit proces is verantwoordelijk voor het ontstaan van de fluorofore chemische structuur die verantwoordelijk is voor de karakteristieke groene fluorescentie van GFP. Dit eiwit speelt niet alleen een rol in de kwal zelf, maar biedt nu wetenschappers de mogelijkheid om eiwitten in levende cellen te visualiseren. Dit werd voor het eerst mogelijk in de jaren ’90 toen moleculaire biologen GFP koppelden aan andere eiwitten, zodat ze deze met fluorescentiemicroscopie konden observeren.

Deze techniek, die wetenschappers in staat stelt om moleculen en structuren binnen cellen en weefsels in levende organismen te volgen, is een doorbraak die de moderne biologie heeft getransformeerd. GFP zelf werd snel de gouden standaard voor fluorescentie-eiwitten, maar al snel werden er nieuwe, verbeterde versies van het eiwit ontwikkeld, evenals eiwitten met verschillende kleurvariaties, zoals het Gele Fluorescente Eiwit (YFP), het Cyan Fluorescente Eiwit (CFP) en het Enhanced Green Fluorescente Eiwit (EGFP). Deze versies hebben niet alleen verschillende kleuren van fluorescentie, maar ook verbeterde fotostabiliteit en hogere quantumopbrengsten, wat hen nog nuttiger maakt voor cellulaire en moleculaire beeldvorming.

Naast GFP werden ook andere fluorescerende eiwitten ontdekt, zoals de rode fluorescerende eiwitten (zoals DsRed), die net als GFP worden gekarakteriseerd door hun vermogen om fluorofores te creëren uit hun primaire aminozuursequentie. Deze nieuwe varianten bieden wetenschappers de mogelijkheid om meerdere eiwitten in één experiment tegelijkertijd te volgen, door de verschillende kleurige fluorescentie van elk eiwit te gebruiken. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van techniek genaamd Fluorescentie Resonantie Energie Transfer (FRET), waarmee de interacties tussen eiwitten in levende cellen nauwkeurig kunnen worden bestudeerd.

Tegelijkertijd werd ook ontdekt dat sommige fluorescentie-eiwitten, zoals het wildtype GFP, in staat zijn om te dimeriseren, wat de interactie van GFP met andere gekoppelde eiwitten kan verstoren. Dit kan problematisch zijn bij experimenten waarbij de koppeling van GFP aan andere eiwitten nauwkeurig moet worden gevolgd. Om deze problemen te vermijden, zijn er verschillende mutaties ontwikkeld die dimerisatie verhinderen, bijvoorbeeld de A206K-mutatie, die nu veel wordt gebruikt in nieuwe GFP-constructen.

Wat verder belangrijk is, is het besef dat deze fluorescentie-eiwitten meer zijn dan alleen een technisch hulpmiddel; ze vertegenwoordigen een nieuwe manier van denken over moleculaire interacties en cellulaire dynamiek. De mogelijkheid om levende cellen en moleculen in real-time te visualiseren, heeft een revolutie teweeggebracht in het begrip van biologie. Elke mutatie, elke verandering in de structuur van deze eiwitten kan nieuwe inzichten opleveren en leidt tot een dieper begrip van de fundamentele biologische processen die het leven aandrijven.