- мониторирование динамики лечения по этим показателям.
Эритроцитозы
Повышение количества эритроцитов в крови - эритроцитоз - может наблюдаться при различных состояниях (таблица 13).
Таблица 13
¦ Эритроцитозы ( и , 1997) ¦
+----+----+
¦Основные патогенетические ¦ Клинические формы (ситуации) ¦
¦ группы ¦ ¦
+----+----+
¦Абсолютные эритроцитозы ¦ ¦
¦(обусловлены повышенной ¦ ¦
¦продукцией) ¦ ¦
¦- первичный эритроцитоз ¦Эритремия ¦
¦- симптоматические ¦ ¦
¦эритроцитозы: ¦ ¦
¦- вызванные гипоксией ¦- заболевания легких ¦
¦ ¦- врожденные "синие" пороки сердца ¦
¦ ¦- наличие аномальных Hb ¦
¦ ¦- пребывание на больших высотах, ¦
¦ ¦синдром Пиквика (ожирение) ¦
¦- вызванные повышенной ¦- гипернефроидный рак, рак ¦
¦продукцией эритропоэтина ¦надпочечников ¦
¦ ¦- рак печени ¦
¦ ¦- гидронефроз и поликистоз почек ¦
¦ ¦- стеноз почечной артерии ¦
¦ ¦- рак яичников ¦
¦ ¦- ангиобластома мозжечка ¦
¦- связанные с избытком ¦- синдром Кушинга ¦
¦адренокортикостероидов или¦- феохромоцитома ¦
¦андрогенов ¦- гиперальдостеронизм ¦
+----+----+
¦Относительные эритроцитозы¦- Потеря жидкости организмом ¦
¦(следствие ¦(потоотделение, рвота, понос, ожоги, ¦
¦гемоконцентрации) ¦прием диуретиков, алкоголизм) ¦
¦ ¦- Стресс ¦
+----+----+
¦Смешанный эритроцитоз ¦Физиологический эритроцитоз ¦
¦(вследствие сгущения крови¦новорожденных ¦
¦и плацентарной трансфузии)¦ ¦
L----+-----
Увеличение массы циркулирующих эритроцитов > 25% от нормы или Hb >185 г/л для мужчин и > 165 г/л для женщин требует дальнейшего обследования больного для исключения эритремии.
Использование лейкоцитарных параметров крови
Гематологические анализаторы, определяющие 18 параметров крови и дифференцирующие три популяции лейкоцитов, могут быть использованы для динамического наблюдения (мониторирования) за состоянием лейкоцитарной формулы больного, у которого при первичном исследовании крови автоматизированный дифференцированный счет лейкоцитов соответствовал визуальному анализу лейкограммы. Эти анализаторы не предназначены для проведения скрининга нормы и патологии. В качестве примеров возможных ошибок, связанных с отсутствием визуального контроля, приводятся следующие наблюдения.
1. При дифференцированном подсчете лейкоцитов на гематологическом анализаторе, дифференцирующем WBC на три популяции (3Diff), подсчитано:
9
WBC - 8,7 x 10 /л LYM% - 25%, MON% - 10%, GRN% - 65%
Все показатели лейкограммы укладываются в нормальные величины, заложенные в "память" гематологического анализатора, и он может не выдать никаких "сигналов тревоги". Но специалист, оценивающий это исследование, должен прекрасно представлять, что при MON% - 10% содержание эозинофилов у конкретного больного может быть 4% и 9%, в последнем случае необходимо изучать причину эозинофилии.
2. При дифференцированном подсчете лейкоцитов на гематологическом анализаторе, дифференцирующем WBC на три популяции (3Diff), подсчитано:
9
WBC - 8,7 x 10 /л LYM% - 25%, MON% - 5%, GRN% - 72%
В данном случае показатели гранулоцитов укладываются в пределы нормы, однако нельзя судить о соотношении палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов. Только подсчитанная визуально лейкоцитарная формула может уточнить истинное распределение гранулоцитов у данного пациента.
Таким образом, оптимальным является обязательное сочетание исследования лейкограммы на гематологическом анализаторе и микроскопического исследования крови.
Изменения относительных величин популяций лейкоцитов при подсчете лейкоцитарной формулы (%) не всегда идут параллельно с изменением абсолютного количества клеток (#). Поэтому при изменении числа лейкоцитов необходимо обращать внимание на их абсолютное содержание в крови, которое можно рассчитать по формуле:
WBC х (%)
(#) = ,
100
где:
(#) - абсолютное количество анализируемой популяции клеток;
WBC - абсолютное количество лейкоцитов периферической крови;
(%) - процентное содержание анализируемой популяции клеток.
9
Например, WBC - 6,0 x 10 /л LYM% - 45%, следовательно:
6,0 х 45 9
LYM # = = 2,8 x 10 /л.
100
Преимуществом использования гематологических анализаторов является быстрое получение таких данных по всем дифференцируемым клеткам, позволяющих отказаться от ручного подсчета абсолютного количества клеток.
В качестве примера приводится два наблюдения значения подсчета абсолютного количества лейкоцитов.
При дифференцированном подсчете лейкоцитов на гематологическом анализаторе, дифференцирующем WBC на три популяции (3Diff), подсчитано:
9 9
WBC - 5,0 х 10 /л LYM% - 55% (# 2,75 x 10 %), MON% - 5%,
GRN% - 40%
9 9
WBC - 12 х 10 /л LYM - 55% (# 6,6 x 10 /л), MON% - 5%,
GRN% - 40%
В первом случае имеется относительный лимфоцитоз, т. к. при пересчете абсолютное содержание лимфоцитов остается в пределах нормы, во втором наблюдении имеется как относительный, так и абсолютный лимфоцитоз, требующий проведения дополнительных исследований для уточнения диагноза.
Отклонения клеточного состава лейкоцитов периферической крови отражаются в изменении формы лейкоцитарной гистограммы, которая приобретает черты, характерные для той или иной формы патологического состояния.
Нейтрофильный лейкоцитоз
9
Нейтрофильный лейкоцитоз (нейтрофилез) (более 6,0 x 10 /л)
может быть следствием:
- усиленной продукции клеток в костном мозге;
- повышенной миграции нейтрофилов из костного мозга в кровь;
- перераспределения нейтрофилов из маргинального в циркулирующий пул;
- задержки миграции нейтрофилов из крови в ткани;
- сочетанного действия вышеперечисленных причин.
Нейтрофилез может быть реактивной и опухолевой природы (таблица 14).
Таблица 14
¦ Причины развития нейтрофильного лейкоцитоза ¦
+++
¦ Реактивный ¦ Опухолевый ¦
+++
¦- Инфекции (бактериальные, грибковые, ¦- Миелопролиферативные¦
¦паразитарные) ¦заболевания ¦
¦- злокачественные новообразования ¦ ¦
¦- гемолитические анемии ¦ ¦
¦- острая кровопотеря ¦ ¦
¦- лекарственные препараты ¦ ¦
¦- воспалительные и некротические процессы¦ ¦
¦- ацидоз, эклампсия, уремия, подагра ¦ ¦
¦- лимфогранулематоз ¦ ¦
¦- физические и эмоциональные нагрузки ¦ ¦
¦- беременность ¦ ¦
L+-
Выраженный нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево свидетельствует о максимальной активности гемопоэза, что прогностически благоприятно. Относительный нейтрофилез со сдвигом влево при наличии лейкопении свидетельствует об истощении гранулоцитарного костномозгового резерва и является крайне неблагоприятным признаком.
Рис. 79. Лейкоцитарная гистограмма периферической крови
9
больного с лейкоцитозом (13,1 х 10 /л) и палочкоядерным
сдвигом (11%).
Рисунок не приводится.
Рис. 80. Лейкоцитарная гистограмма периферической крови
больного в развернутой стадии ХМЛ.
Рисунок не приводится.
Рис. 81. Периферическая кровь больного
в развернутой стадии ХМЛ.
Рисунок не приводится.
Рис. 82. Лейкоцитарная гистограмма периферической крови
больного ХМЛ с эозинофильно-базофильной ассоциацией.
Рисунок не приводится.
Рис. 83. Периферическая кровь больного с ХМЛ с выраженной
эозинофильно-базофильной ассоциацией.
Рисунок не приводится.
Лейкопения с нейтропенией
9
Лейкопения с нейтропенией (менее 2,0 х 10 /л) может быть
функциональной и органической (таблица 15).
Таблица 15
--
¦ Причины развития нейтропении ¦
+------+-----+
¦ Функциональная ¦ Органическая ¦
+------+-----+
¦- Инфекции (бактериальные, ¦- Острые лейкозы ¦
¦грибковые, вирусные, ¦- Лимфопролиферативные заболевания ¦
¦вызванные простейшими, ¦- Миелодиспластический синдром ¦
¦риккетсиями) ¦- Мегалобластные анемии ¦
¦- Алиментарная дистрофия, ¦- Наследственная доброкачественная ¦
¦голодание ¦нейтропения, циклическая ¦
¦- Лекарственные препараты ¦нейтропения, синдром Чедиака-Хигаши ¦
¦- Анафилактический шок ¦- Лучевая болезнь ¦
¦- Аутоиммунные заболевания ¦- Агранулоцитоз ¦
¦ ¦- Апластическая анемия ¦
L------+------
Рис. 84. WBC-гистограмма периферической крови больного
с нейтропенией и относительным лимфоцитозом.
Рисунок не приводится.
Агранулоцитоз - резкое уменьшение числа гранулоцитов в
периферической крови вплоть до их исчезновения. Критериями
диагностики агранулоцитоза являются снижение лейкоцитов менее
9 9
1 х 10 /л, гранулоцитов менее 0,75 х 10 /л.
Эозинофилия
Эозинофилия - увеличение количества эозинофилов в крови более
9
5% (0,4 х 10 /л).
Таблица 16
¦ Причины развития эозинофилии ¦
+-+-------+
¦ Реактивная ¦ Опухолевая ¦
+-+-------+
¦- Паразитарные инфекции ¦- Острый лейкоз с ¦
¦- Аллергические заболевания ¦эозинофилией (М4эоз) ¦
¦- Аутоиммунные заболевания ¦- Эозинофильный лейкоз ¦
¦- Лекарственные препараты ¦ ¦
¦- Гранулематозные процессы ¦ ¦
¦- Лимфогранулематоз ¦ ¦
¦- Злокачественные новообразования ¦ ¦
L-+
Рис. 85. WBC-гистограмма периферической крови больного
с эозинофилией.
Рисунок не приводится.
Эозинопения
Эозинопения - снижение количества эозинофилов в крови менее
9
0,2 х 10 /л или анэозинофилия - отсутствие эозинофилов в крови -
встречается на первом этапе воспалительного процесса, при тяжелых
гнойных инфекциях, шоке, стрессе, эклампсии и в родах,
интоксикациях различными химическими соединениями, тяжелыми
металлами.
Базофилия
Базофилия может наблюдаться при аллергических заболеваниях, в ранней фазе ревматизма, при хроническом миелоидном лейкозе, миелофиброзе, эритремии. Тучноклеточный лейкоз сопровождается увеличением тучных клеток в костном мозге и крови.
Рис. 86. WBC-гистограмма периферической крови больного
с базофилией.
Рисунок не приводится.
Лимфоцитоз
Лимфоцитоз - относительное (более 37%) или абсолютное (более
9
3,0 х 10 /л) увеличение количества лимфоцитов.
Таблица 17
¦ Причины развития лимфоцитоза ¦
+---+-----+
¦ Реактивный (поликлональный) ¦Опухолевый (моноклональный)¦
+---+-----+
¦- Вирусные и паразитарные инфекции ¦- Лимфопролиферативные ¦
¦- Гранулематозные процессы ¦заболевания ¦
¦- Аутоиммунные заболевания ¦ ¦
¦- Злокачественные новообразования ¦ ¦
L---+------
Рис. 87. WBC-гистограмма периферической крови больного
с инфекционным мононуклеозом.
Рисунок не приводится.
Рис. 88. Периферическая кровь больного
с инфекционным мононуклеозом.
Рисунок не приводится.
Рис. 89. WBC-гистограмма периферической крови больного
с хроническим лимфолейкозом.
Рисунок не приводится.
Рис. 90. Периферическая кровь больного с ХЛЛ
Рисунок не приводится.
Лимфоцитопения
9
Лимфоцитопения - содержание лимфоцитов менее 1,0 х 10 /л,
наблюдается при острых инфекционных заболеваниях, милиарном
туберкулезе (висцеральная форма), системной красной волчанке,
почечной недостаточности, в терминальной стадии злокачественных
новообразований, лимфогранулематозе, как ранний признак острой
лучевой болезни, в терминальной стадии СПИД, вторичных
иммунодефицитах. У детей и подростков лимфоцитопения (менее 1,0
9
х 10 /л) возможна в результате аллергизации организма и при
наследственном иммунодефиците.
Моноцитоз
9
Моноцитоз - количество моноцитов более 0,7 х 10 /л.
Таблица 18
¦ Причины развития моноцитоза ¦
+--+------+
¦ Реактивный ¦ Опухолевый ¦
+--+------+
¦- Инфекции вирусные, ¦- Острый монобластный и ¦
¦паразитарные, бактериальные, ¦миеломонобластный лейкозы ¦
¦вызванные простейшими ¦- Хронический моноцитарный и¦
¦- Воспалительные заболевания ¦миеломоноцитарный лейкозы ¦
¦- Аутоиммунные заболевания ¦ ¦
¦- Гранулематозные процессы ¦ ¦
¦- Злокачественные новообразования ¦ ¦
L--+-------
Рис. 91. WBC-гистограмма периферической крови больного
с моноцитозом.
Рисунок не приводится.
Моноцитопения
Моноцитопения - снижение содержания моноцитов менее 0,09 х
9
10 /л. Уменьшение числа моноцитов наблюдается при гипоплазии
и аплазии костного мозга, острых лейкозах, волосатоклеточном
лейкозе, острых инфекциях при применении некоторых лекарственных
препаратов.
Рис. 92. WBC-гистограмма периферической крови больного
с моноцитопенией.
Рисунок не приводится.
Возможности высокотехнологичных гематологических анализаторов
Возможности современных высокотехнологичных анализаторов гораздо шире по сравнению с 18-параметровыми счетчиками крови. Они снабжены соответствующими программами обнаружения незрелых клеток, активированных лимфоцитов, стволовых гемопоэтических клеток. Обозначения флагов дифференциальных параметров, указывающих, например, на присутствие незрелых гранулоцитов, отличаются в анализаторах в зависимости от фирмы-производителя. Это могут быть LIC (Large Immature Cells), которые, в свою очередь, подразделяются на IMG (Immature Granulocytes) - незрелые гранулоциты, IMM (Immature Monocytes) - незрелые моноциты, IML (Immature Lymphocytes) - незрелые лимфоциты (Pentra DX 120). При наличии более 2,5% LIC рекомендовано микроскопическое исследование мазка крови. В анализаторах фирмы Beckman-Coulter (LH500, LH750) флаг обозначается как Immature Gran.
В гематологическом анализаторе ХЕ-2100 Sysmex предусмотрена программа IG Master, в которой чувствительность и специфичность обнаружения незрелых гранулоцитов составляет 95,9% и 89,3% соответственно. Использование при представлении анализа крови флагов при выходе параметров за пределы установленных референсных значений позволяет провести раннее обнаружение септических или иных патологических состояний, требующих дополнительного обследования для установления диагноза и назначения соответствующей терапии.
При лимфоцитозах или наличии измененных по объему лимфоцитов появляются следующие флаги: "Atypical Lymphocytes, Variant Lymphocytes, Reactive Lymphocytes, Abnormal Lymphocytes".
Рис. 93. Дифференцировочная (DIFF) гистограмма
светорассеивания XE-2100 (Sysmex), демонстрирующая
локализацию различных типов лейкоцитов.
Рисунок не приводится.
Рис. 94. Дифференцировочная (DIFF) гистограмма
светорассеивания XE-2100 (Sysmex), демонстрирующая
локализацию активированных лимфоцитов.
Рисунок не приводится.
Рис. 95. Периферическая кровь, активированные лимфоциты.
Рисунок не приводится.
Эволюция созревания клетки отражается на ее морфологии. В современных гематологических анализаторах стало возможным распознавать функциональную трансформацию клетки, исходя из концепции "морфология отражает функцию". Различные этапы созревания клеток оцениваются по синхронности созревания ядра и цитоплазмы и могут быть оценены по стандартным критериям. Разработка новых технологий, исследовательских программ автоматизированного анализа крови основана на знании событий, происходящих в процессе клеточного цикла, функций и морфологии клеток, их изменений при воздействии различных факторов, вызывающих диспластические процессы, апоптоз. Так, в анализаторах фирмы Культер (LH500, LH750) имеется программа WBC Research Population data (RPD), в которой оценивается 24 дополнительных параметров в виде среднего значения (М) и стандартного отклонения (SD) всех трех (VCS) измерений. Исследуемые показатели сравниваются с референсными значениями. Тщательный анализ гистограмм и скатерограмм распределения клеток, данных исследовательской программы (RPD) помогает детально охарактеризовать клеточные популяции и обнаружить имеющиеся отклонения.
Использование тромбоцитарных параметров крови
Одним из важных параметров общего анализа крови является количество тромбоцитов, определяющее зачастую вероятность развития тромбоза или геморрагического синдрома. В то же время количество тромбоцитов не отражает их функциональную активность (рис. 96 - не приводится). Поэтому для прогноза развития вышеперечисленных состояний необходимо использование дополнительных, более информативных показателей тромбоцитов, а также исследование системы гемостаза.
Среди тромбоцитарных показателей используются средний объем тромбоцитов (MPV), ширина распределения тромбоцитов по объему (PDW), тромбокрит (РСТ), а также новые показатели - фракция незрелых тромбоцитов (IPF), средний тромбоцитарный компонент (МРС).
При отсутствии в крови гемопоэтических стимулов общий объем
циркулирующих тромбоцитов довольно постоянен. В патологических
условиях количество и объем тромбоцитов могут меняться. При
снижении продукции тромбоцитов гемостатический потенциал может
быть частично компенсирован за счет повышения их объема. В
обратной ситуации при повышении количества тромбоцитов выше 450 х
9
10 /л объем тромбоцитов не снижается ниже определенного
физиологического уровня. Соответственно общий объем
тромбоцитарного пула в крови возрастает пропорционально увеличению
количества тромбоцитов. Это может приводить к изменениям MPV, PDW,
РСТ и гистограммы распределения тромбоцитов по объему.
В гематологическом анализаторе ХЕ-2100 (SYSMEX) фракция незрелых тромбоцитов (IPF) измеряется специальной программой IPF Master с использованием флюоресцентных красителей. Незрелые тромбоциты - это крупные клетки, которые содержат большое количество РНК, необходимое для интенсивного синтеза белков, участвующих в созревании тромбоцитов. В какой-то степени фракция незрелых тромбоцитов аналогична фракции незрелых ретикулоцитов, она отражает активность тромбоцитопоэза.
Референсные значения IPF - 1,1-10,3%.
Фракция незрелых тромбоцитов может быть использована в дифференциальной диагностике тромбоцитопений, которые наиболее часто могут быть вызваны либо нарушенной продукцией в костном мозге, либо повышенным их потреблением.
Нарушение продукции тромбоцитов наблюдается после химиотерапии, лучевой терапии, трансплантации костного мозга или стволовых гемопоэтических клеток, апластической анемии. Во всех этих наблюдениях содержание IPF находится в пределах нормы.
Состояния, сопровождающиеся повышенным потреблением или деструкцией тромбоцитов (ДВС-синдром, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, кровотечения, тромботические микроангиопатии - синдром Мошковича, гемолитикоуремический синдром), характеризуются увеличением фракции незрелых тромбоцитов до 30-50%.
Параметр фракции незрелых тромбоцитов может быть использован при мониторинге регенерации костномозгового гемопоэза после химиотерапии, лучевой терапии, трансплантации костного мозга или стволовых клеток. Показатель IPF повышается на 1-2 дня раньше, чем общее количество тромбоцитов после аутологичной или аллогенной трансплантации стволовых гемопоэтических клеток, цитотоксической химиотерапии, и на 2-7 дней раньше после аллогенной трансплантации костного мозга. Таким образом, определение этого показателя может быть информативным для оценки продукции костным мозгом тромбоцитов.
После трансплантации костного мозга или стволовых клеток имеется определенный промежуток времени, когда регенераторная способность костного мозга еще не восстановлена, поэтому больные нуждаются в трансфузии эритроцитарной и тромбоцитарной массы. Мониторинг за показателем IPF позволяет сократить число таких трансфузий, т. к. является более ранним предвестником восстановления тромбоцитопоэза в костном мозге по сравнению с общим количеством тромбоцитов.
IPF используется в мониторинге терапии идиопатической и аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры. На фоне эффективного лечения повышенные значения IPF возвращаются к норме параллельно с повышением общего количества тромбоцитов, т. е. этот параметр обратно коррелирует с числом PLT.
МРС (mean platelet component) - средний тромбоцитарный компонент, является новым параметром в анализаторах серии Advia 120, Advia 2120. По данным литературы, этот показатель характеризует плотность и гранулярность тромбоцитов. Нормальные значения - 259 +/- 6,6. МРС коррелирует с функциональной активностью тромбоцитарного звена и может использоваться среди других показателей в качестве предвестника острых ишемических осложнений, а также риска развития тромбоза.
Снижение количества PLT в крови - тромбоцитопения - может развиваться в результате:
- снижения продукции тромбоцитов (наследственные и приобретенные заболевания - онкогематологические заболевания, метастазы злокачественных новообразований в костный мозг, апластическая анемия, заболевания соединительной ткани, мегалобластные анемии, заболевания печени, воздействие ионизирующей радиации, цитостатической терапии, вирусные инфекции, ночная пароксизмальная гемоглобинурия и др.);
- повышенной деструкции тромбоцитов - инфекции, эклампсия беременных, гемолитико-уремический синдром (ГУС), ВИЧ-инфекция, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, системная красная волчанка, хронический лимфолейкоз, хронический активный гепатит, посттрансфузионная тромбоцитопения, гемодиализ, кровотечения, спленомегалии (болезни накопления, лимфомы, волосатоклеточный лейкоз, миелопролиферативные заболевания), иммунные тромбоцитопении;
- в результате потребления PLT - ДВС-синдром.
Повышение количества тромбоцитов в крови - тромбоцитоз - наблюдается при различных заболеваниях (таблица 19).
Таблица 19
¦ Причины развития тромбоцитозов ¦
+---+-----+
¦ Тромбоцитоз ¦ Заболевания и синдромы ¦
+---+-----+
¦Реактивный ¦Спленэктомия, острая кровопотеря, острый гемолиз,¦
¦ ¦состояние после операции, злокачественные ¦
¦ ¦новообразования, ревматоидный артрит, туберкулез,¦
¦ ¦язвенный колит, остеомиелит ¦
+---+-----+
¦Опухолевый ¦Миелопролиферативные заболевания ¦
L---+------
Подсчет гемопоэтических клеток-предшественников (НРС) с помощью SYSMEX XE-2100
В настоящее время трансплантация гемопоэтических стволовых клеток широко используется при гематологических, онкологических заболеваниях, некоторых аутоиммунных заболеваниях. В ряде случаев она является единственным излечивающим методом (хронический миелолейкоз, апластические анемии, острые лейкозы). Для пересадки стволовых клеток необходимо иметь трансплантат, состоящий либо из аутологичных, либо из аллогенных клеток. Основными его источниками являются клетки костного мозга, периферической и пуповинной крови. В качестве источника стволовых клеток как для детей, так и для взрослых все чаще выступает периферическая кровь, в связи с чем существует серьезная потребность в быстром, надежном методе оценки содержания стволовых клеток в периферической крови. Эта информация жизненно необходима для определения оптимального времени сбора (афереза) стволовых клеток и мониторирования приживления трансплантата.
Для достижения оптимального клинического результата трансплантации стволовых клеток необходима достаточная концентрацию этих клеток. В настоящее время с целью характеристики содержания в трансплантатах клеток-предшественников существует три метода. Это метод проточной цитофлюориметрии для количественной оценки CD34+ клеток, который используется наиболее часто, требует квалифицированных специалистов, четкой стандартизации, занимает достаточно длительное время и дорогостоящий. Метод определения колониеобразующей способности (CFU-GM) не является практическим методом для стандартного клинического мониторинга, так как требует 14 дней для полного завершения. Третий метод - это подсчет стволовых клеток периферической крови на основании относительно нового потенциального маркера - Гемопоэтическая Клетка-Предшественник (НРС), определяемого некоторыми гематологическими анализаторами, выпускаемыми Корпорацией SYSMEX, включая SE-9000, SE-9500 и ХЕ-2100.
Истинные стволовые клетки и ранние гемопоэтические клетки-предшественники имеют меньший размер по сравнению с линейно коммитированными клетками-предшественниками, и по мере их созревания они постепенно сначала увеличиваются в размерах, а затем прогрессивно уменьшаются. Эти процессы сопровождаются выраженными изменениями в цитоплазме, характеризуемыми преимущественно потерей диффузного голубого цитоплазматического окрашивания, которое представляет собой активно синтезирующий белки эндоплазматический ретикулум. Затем клетки фокусируют свою метаболическую активность в сторону образования внутриклеточных гранул, в результате цитозоль подвергается ряду характерных изменений, преимущественно вследствие аккумуляции в клетках большого количества гранул. К концу последовательного процесса созревания клетки цитоплазма становится резко гранулярной. Кроме того, изменяется хроматиновая структура ядра. На ранних этапах развития хроматиновая сеть имеет крупные открытые ячейки, легко различимые ядрышки. В процессе созревания ядерный хроматин становится более плотным и в случае нейтрофилов дольчатым.
Поверхностная мембрана ранних клеток-предшественников специфически адаптирована для адгезии к стромальным клеткам костного мозга, что необходимо для поддержания важных свойств этих клеток - самообновления и направленной дифференцировки. Такие адгезированные клетки нечасто покидают костный мозг. В большинстве случаев они так плотно приклеены к строме, что им приходится изменять свою мембрану для мобилизации из костного мозга и выхода в циркуляцию. Эти процессы сопровождаются изменениями в содержании поверхностных мембранных белков и в способе взаимодействия этих белков с цитоскелетом, что делает клетки более деформируемыми. Это позволяет им продвигаться через сосудистый эндотелий и, в конечном итоге, в межтканевое пространство. Мембранные изменения также значительно изменяют чувствительность клеток к лизису неионными детергентами.
Методика подсчета НРС основана на дифференциальном лизисе мембран зрелых клеток, при этом более незрелые клетки остаются относительно интактными вследствие различий в содержании липидов в клеточных мембранах. Измерение происходит на IMI - канале (Immature Information) анализатора с использованием радиочастотных (RF), импедансных (DC) сигналов и селективного лизиса детергентом. Сигнал DC идентифицирует изменения в размере клеток, которые сначала становятся больше, затем меньше, сигнал RF меняется в ответ на изменения в хроматиновой структуре и цитоплазматической зернистости (рис. 99 - не приводится). Направления локализации кластеров клеток, которые видны на диаграмме светорассеяния канала IMI (сигнал RF против сигнала DC), выявляют изменения, которые происходят в процессе последовательного созревания клеток. Это дает визуальное доказательство того, как клетки изменяются в процессе созревания. Характеристика, которая, возможно, наименее хорошо понятна, это вопрос селективного лизиса детергентом. Ранние клетки-предшественники имеют более ригидную мембранную структуру, и они нечувствительны к лизису неионными детергентами. По мере созревания клетки мембрана становится более текучей и деформируемой, и когда созревание завершено, детергент разрывает клеточную мембрану.
Таким образом, анализ НРС с помощью анализаторов фирмы SYSMEX базируется на одновременном выявлении RF и DC импедансных сигналов с последующим применением адаптивного кластерного анализа для определения специфической области на диаграмме светорассеяния канала IMI, что, основываясь на описанной последовательности созревания, выявляет гемопоэтические клетки предшественники.
CD34+ клетки постоянно обнаруживаются в узкой области региона НРС диаграммы светорассеяния канала IMI. Фактически все эти клетки регистрируются в том же регионе, где ранее были идентифицированы гемопоэтические клетки-предшественники.
Для исследования НРС рекомендуется использовать антикоагулянт EDTA. Количество НРС остается стабильным в течение 4 часов, после этого периода их оценка недостоверна. Очевидно, стволовые клетки теряют способность оставаться резистентными к лизису детергентом. Исследования стабильности НРС в образцах пуповинной крови, взятых на цитратном (CPD) антикоагулянте, показывают менее 10% потери клеток при хранении их в условиях комнатной температуры до 4 часов.
В норме у детей и взрослых гемопоэтические стволовые клетки не выявляются в периферической крови.
Основным вопросом при оптимизации сбора стволовых клеток периферической крови (PBSC) является точное определение сроков начала афереза. НРС - параметр, который позволяет идентифицировать материал с высоким содержанием CD34+ и колониеобразующей активностью. Возможность выявлять образцы с высоким содержанием жизнеспособных гемопоэтических клеток-предшественников, отделяя их от тех, которые не соответствуют минимальным критериям для использования, представляет интерес для банков пуповинной крови.
- В процессе мониторинга за больными после мобилизации стволовых клеток из костного мозга не следует проводить определение содержания CD34+ клеток методом проточной цитофлюориметрии до тех пор, пока не будут выявлены в периферической крови НРС. При их количестве менее 10/мкл сбор стволовых клеток следует отложить.
- Если содержание НРС > 30/мкл, рекомендуется начинать процедуру афереза, не ожидая результатов определения CD34+.
Таким образом, НРС является новым и весьма информативным маркером, который может быть использован в лабораториях учреждений, занимающихся трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток.
Контроль качества на гематологических анализаторах
Современные анализаторы, используемые в клинико-диагностических лабораториях, - это, как правило, "черные ящики", которые программируются на входе, результат получается на выходе. Уверенность в получаемых результатах может быть обеспечена только при использовании программ контроля качества.
Согласно 1.5.3. Приложения 1 к Приказу 45: "Регулярно проводимая внешняя оценка качества и повседневно проводимый внутрилабораторный контроль качества дополняют, но не заменяют друг друга. Внешняя оценка качества направлена, прежде всего, на выявление систематических ошибок лабораторных методов и обеспечение единства измерений на территории страны, а внутрилабораторный контроль качества предназначен для поддержания стабильности аналитической системы, выявления и устранения недопустимых случайных и систематических погрешностей".
Сущность контроля качества заключается в сопоставлении результатов исследования проб с результатами исследования контрольного материала и измерении величины отклонения.
Внешний контроль качества обеспечивается в России Федеральной системой внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК). В перечне услуг, предоставляемых ФСВОК, есть программы, предназначенные для оценки качества гематологических показателей, определяемых на анализаторах. Программы внешней оценки качества ФСВОК ежегодно адаптируются под конкретные задачи текущего момента. Поэтому подробный анализ этих программ проводить в этой книге не будем. Однако подчеркиваем, что участие во внешней оценке качества при работе на гематологических анализаторах является обязательным, и будет учитываться как один из основных критериев при сертификации клинико-диагностических лабораторий любого подчинения.
Внутрилабораторный контроль качества
Внутрилабораторный контроль качества - объективная проверка результатов лаборатории, осуществляемая ежедневно непосредственно в лаборатории, преимущественно с целью оценить воспроизводимость. Внутрилабораторный контроль качества решает две основные задачи: контроль переменных внешних факторов (разные партии реагентов, калибровочных материалов и пр.) и контроль стабильности выполнения методики в лаборатории. Цель внутрилабораторного контроля качества - выявление и устранение отклонений от стабильного выполнения теста в лаборатории, т. е. выявление и устранение недопустимых аналитических ошибок.
Для того, чтобы контроль качества отвечал поставленным перед ним задачам, он должен быть:
1. Систематическим, повседневным, проводиться по единым правилам, т. е. анализ контрольных проб должен включаться в обычный ход работы лаборатории;
2. Охватывать все области измерений (норма, высокие и низкие патологические значения);
3. Производиться в реальных условиях работы лаборатории (так же, как обычные пробы пациентов, т. е. тем же персоналом и в тех же условиях);
4. Объективным (желательно "шифровать" контрольный материал, чтобы исполнитель не знал, где опыт, а где контроль).
Принцип проведения внутреннего контроля качества
Принцип проведения внутреннего контроля достаточно прост: периодически (в каждой серии) нужно проводить измерение одного и того же контрольного материала, а результаты этих измерений заносить на контрольную карту.
Хорошо организованная система внутреннего контроля качества позволяет достаточно эффективно выявлять ошибки, связанные с:
- внешними варьирующими факторами (реагенты, калибраторы, расходные материалы);
- внутренними варьирующими факторами (организация в лаборатории "домашних реактивов", обучение персонала, обслуживание приборов, ведение документации, реакция персонала на возникающие проблемы).
Для оценки качества исследований рассчитываются следующие статистические показатели:
1. Среднее арифметическое значение или средняя арифметическая
(Х ):
ср
SUM X
i
Х = ------,
ср n
где:
X - значения конкретных измеренений;
i
n - число измерений.
2. Отклонение от правильного значения, то есть разница между истинной величиной (мю) и средней арифметической, отражает величину систематической ошибки (b) и, соответственно, точность определений (В, %):
b (абсолютная величина) = Х - мю или
ср
Х - мю
ср
В (отклонение, %) = х 100%.
мю
3. Стандартное отклонение (сигма - "сигма", SD стандартная девиация, дисперсия):
____________
/ 2
/SUM(X - Х )
/ i ср
сигма = \/ --.
n - 1
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 |
