Механизмы анксиолитического и антидепрессантного действия тенотена (Экспериментальное исследование) (стр. 2 )

Исследования поведения в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ) выполнялись по классической методике, описанной Рellow, S., File, S.E., [1986], исследования в тесте «открытое поле» - по методике, описанной Bruhwyler, J. et al. [1995].

Оценка антиагрессивной активности тенотена

Оценка антиагрессивной активности тенотена проводилась с помощью тестов мотивированной и немотивированной агрессии.

В тесте немотивированной агрессии крыс парами высаживали на электродный пол камеры из плексигласа (27,5 х 27,5 х 40 см), на который подавали переменное напряжение, постепенно увеличивавшейся амплитуды, начиная с 15 В. Раздражение подавали периодами по 3 сек с интервалом 1 сек до возникновения агрессии в ответ не менее, чем на три импульса одной силы. Это напряжение считали пороговым. Агрессивной реакцией считали такое поведение крыс, при котором они обе вставали на задние лапы мордами друг к другу, наносили удары лапами и кусали друг друга. Антиагрессивное действие препарата выражалось в повышении порога агрессивной реакции у крыс, измеряемого по величине напряжения при котором появлялись агрессивные реакции.

В тесте мотивированной агрессии [Буров, Ю. В., Салимов, Р. М., 1976] изучали интенсивность агрессивной реакции, вызванной у пары крыс стремлением избежать наказания на тесной безопасной скамейке. Пару крыс на 2 мин помещали в камеру, на электродный пол которой подавали импульсы переменного напряжения 35 В длительностью 3 сек с интервалами 1 сек. Об антиагрессивном действии препаратов судили по способности крыс совместно находится на безопасной скамейке. Критерием выраженности эффекта препаратов в данном тесте служила длительность совместного избегания.

Оценка антидепрессантной активности тенотена

Антидепрессантную активность изучали с помощью теста вынужденного плавания [Porsolt, R.D. et al., 1978; Андреева, Н. И., 2000] и его модификации [Nomura, et al.,1982].

В тесте вынужденного плавания по Porsolt крыс помещали в сосуд с водой диаметром 40 см, глубиной 60 см и температурой воды 25о С. После безуспешных попыток выбраться крысы зависали в воде в состоянии неподвижности (иммобилизации). Длительность иммобилизации является показателем выраженности депрессивного состояния, а сокращение длительности иммобилизации – показатель антидепрессантного действия препаратов.

В модификации теста вынужденного плавания по Nomura крыс помещали в сосуд с колесами и за 10 мин регистрировали количество оборотов колес. Способность препарата увеличивать количество оборотов колес свидетельствует о его антидепрессантном эффекте.

Оценка миорелаксантного действия тенотена и его влияния на координацию движений

Стандартным методом для оценки возможного нейротоксического действия препаратов, проявляющегося в миорелаксации и нарушении координации движений, является исследование поведения животных на специальном вращающемся стержне [Воронина, Т. А., , 2000]. Крыс помещали на стержень диаметром 4 см, вращающийся со скоростью 10 об/мин и в течение 2 мин регистрировали число упавших животных и латентный период падения со стержня.

Оценка влияния тенотена на способность к обучению и память

Метод выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) основан на том, что животное может избежать аверсивного воздействия (удара током) пассивно, не выполняя определенные действия [Воронина, Т. А., Островская, Р. У., 2005]. Крыс помещали в установку фирмы Lafaette Instruments Co. (США), которая состояла из освещенной площадки, закрепленной на высоте и соединенной с затемненной камерой, на пол которой подавалось электроболевое раздражение в течение 10 сек, в результате чего предпочитаемая в норме затемненная камера становилась опасной. На следующие сутки проводили тестирование УРПИ. Для этого крыс помещали на освещенную площадку и в течение 3 мин регистрировали латентный период первого захода в темную камеру и общую длительность пребывания в ней.

Регистрация биоэлектрической активности структур мозга

Каждому животному под наркозом (нембутал, 40 мг/кг в. м.) вживляли 4 электрода по стереотаксическому атласу для крыс [Буреш, Я. и др., 1962]: в сенсомоторную область коры (СК, 1,5-2 мм от брегмы вперед, 1,5 мм от сагитального шва и 2 мм в глубину), латеральное поле гипоталамуса (ГПТ, 2 мм назад от брегмы, 1,2-1,5 мм в сторону от сагитального шва, 8 мм в глубину), дорзальный гиппокамп (ГПК, 3 мм назад от брегмы, 3 мм в сторону от сагитального шва и 3 мм в глубину) и индифферентный электрод вживляли в носовую кость черепа (0,5 мм в глубину).

Первую сессию регистрации биоэлектрической активности проводили через 5-6 дней после операции по вживлению электродов. Запись ЭЭГ и ее анализ по Фурье начинали через 15 минут после помещения крысы в экспериментальную камеру. Сначала у животного регистрировали фоновую активность (контрольная запись), затем вводили тестируемые препараты и при непрерывной регистрации электрической активности в программу компьютера заносили данные ЭЭГ через 5, 10, 20 минут, 1 и 2 часа после введения вещества. Вторую сессию проводили после пятидневного введения препаратов (до последнего – 5-го – введения вещества и через 30 минут после последнего введения вещества). Для записи ЭЭГ использовали компьютерный электроэнцефалограф «Нейро-КМ» на базе компьютера IBM P4P800WM c программным комплексом «BRAINSYS» для спектрально-когерентного анализа биоэлектрической активности [Митрофанов, А. А., 2007]. Для спектрально-когерентного анализа ЭЭГ выбирали безартефактные отрезки электроэнцефалограмм. Длительность обрабатываемых отрезков ЭЭГ была не менее 60 сек. Средние значения мощности спектров определяли в диапазоне от 0 до 32 Гц с шагом в 1 Гц и выделением стандартных диапазонов дельта-, тета-, альфа-, бета1-, бета2- частот.

Изучение участия нейромедиаторных систем в реализации анксиолитического и антидепрессантного эффектов тенотена

С целью блокады ГАМК-А рецептора использовали его антагонист бикукуллин (ICN Biomedicals Inc., США) в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно [Olsen, et al., 1984], а для блокады хлорного канала ГАМК-бензодиазепиного рецепторного комплекса - пикротоксин (ICN Biomedicals Inc., США) в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно [Corda, et al.,1991].

В исследовании влияния тенотена на ГАМК-В-ергическую систему использовали агонист ГАМК-В рецепторов баклофен (ICN, США), который вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг [Gilboe, L. et al., 2000], и антагонист ГАМК-В рецепторов факлофен (ICN, США), который вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг [Gilboe, L,2000].

При изучении влияния тенотена на серотонинергическую систему использовали избирательный антагонист 5-НТ2/5-НТ1С серотониновых рецепторов кетансерин (ICN, США), который вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг и предшественник серотонина 5-ОТФ (ICN, США), который вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг.

Радиолигандный анализ

Клетки и мембраны, выделенные из клеток яичника китайского хомячка (CHO), и клеток линии 293 почки человеческого эмбриона (HEK) стабильно экспрессирующие человеческие 5HT1A, 5HT2A, 5HT2B, 5HT2C рецепторы, были выращены и произведены компанией CEREP (Франция) согласно классическому способу получения клеточных линий и мембранных препаратов. Мембраны, экспрессирующие σ1-рецепторы человека, полученные из клеток линии Jurkat, были приготовлены компанией CEREP по традиционным методам. Тенотен тестировался в количестве 1% в объемном отношении и/или в количестве 10% в объемном отношении в дубле. Для каждого анализа проводилось исследование референтного соединения (контрольного вещества) в качестве положительного контроля (табл. 1).

Таблица 1: Условия проведения радиолигандного анализа

Анализ влияния тенотена на функциональное состояние рецепторов серотонина

Анализ влияние тенотена на рецепторные эффекты агонистов и антагонистов 5HT1A проводился путем измерения внутриклеточной концентрации цАМФ с использованием технологии HTRFâ (CisBio, Bagnols-sur-Cèze, Франция). Анализы на агонисты и антагонисты 5HT2A, 5HT2B и 5HT2C проводились посредством мобилизационного кальциевого анализа с помощью технологии CellLuxâ (Perkin Elmer). Все анализы антагонистов проводились с использованием контрольного агониста при концентрации, обеспечивающей 80 % от его максимального эффекта. Все клеточные функциональные анализы проводились в соответствии с указаниями производителя и стандартными технологическими протоколами компании CEREP. Тенотен был изучен в двух концентрациях – 1% в объемном соотношении и/или 10% в объемном соотношении в дубле.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5