Начало 80-х годах на Западе, в первую очередь в США, без преувеличения можно охарактеризовать как биотехнологический бум, последовавший за компьютерным бумом. Ассигнования на развитие биотехнологии – как государственные, так и частные, - были очень велики, и инвесторов не отпугивало, что деньги вкладываются в проекты, для которых не до конца исследованы не только рентабельность, но и техническая осуществимость. В биотехнологию вкладывался венчурный капитал - с высокой степенью риска и сверхприбылью в случае успеха.

В это время возникли сотни биотехнологических компаний, большинство из которых возглавляли ученые. Скорость роста акций вновь созданной биотехнологической фирмы Genentech (США) в 1980 г. была самой высокой в истории американского фондового рынка [[35], p.193]. К 1988 г. более 1000 компаний США так или иначе были связаны с биотехнологией.

Стремительное развитие биотехнологии детерминировано не только внешними причинами (социально-политическими факторами), но и внутренними факторами - собственной логикой развития биологических наук, которые познают клетки на все более глубоком уровне, что открывает более широкие возможности их практического использования также, как это происходило при выходе физики и на атомный и субатомный уровень. От экспериментов, изучающих функционирование в клетке имеющегося в ней генетического материала, исследователи перешли к генетическим манипуляциям. Представление об организмах, как запрограммированных системах уступает место деятельности по их перепрограммированию, сближая биотехнологию с микроэлектроникой, робототехникой, системотехникой.

Научные основы новых направлений развивались с середины ХХ века в рамках молекулярной биологии, исследующей строение и функционирование живых клеток и их частей на уровне молекул. Возникновение этой отрасли изменило биологию, превратив ее в точную науку. Без фундаментальных работ Ф. Крика и Дж. Уотсона (1953, Англия) по установлению структуры ДНК, а также их предшественников и последователей было невозможно достигнуть современных результатов в области биотехнологии.

Как и предупреждали наиболее трезвомыслящие ученые, развитие новейшей биотехнологии в 80 – 90-х годах шло медленнее и оказалось более дорогостоящим, чем ожидали энтузиасты. Наиболее амбициозная задача – окончательное избавление от рака и вирусных заболеваний (в том числе, СПИДа), несмотря на существенные достижения, не решена. К концу 1980-х годов количество вновь создаваемых биотехнологических компаний упало, и они теперь чаще создаются бизнесменами, чем учеными. Развитие биотехнологии стали во многом определять многопрофильные крупные компании. Ряд крупных фирм переводит деньги из химической индустрии в постиндустриальную биотехнологию [[36]]. В результате жесткой конкуренции в середине 90-х годов многие биотехнологические компании столкнулись с серьезными проблемами. Так, три из десяти компаний, имевших наихудшие биржевые результаты в 1994г. в США, были биотехнологическими [[37]]. В 1998 году было закрыто около 20 биотехнологических компаний из-за ухудшения финансирования, в то же время наиболее успешные компании имеют стабильный рост прибылей (например, 28% у Genzyme General с 1991)[[38]]. 1998 год был в США рекордным по количеству вновь одобреных ФДА продуктов новейшей биофармацевтики (16 наименований, из них наиболее успешны противораковый перцептин фирмы Gentech и обезболивающий целебрекс (фирма Monsanto)[[39]]. В целом, после бума 80-х годов новейшая биотехнология вошла в фазу устойчивого развития, количество и ассортимент ее продуктов на рынке стабильно растет, и, вероятно, почти все население мира так или иначе употребляет эти продукты.

5.1  Инженерная энзимология

Инженерная энзимология – это отрасль биотехнологии, базирующаяся на использовании каталитических функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном состоянии или в составе клеток для получения соответствующих целевых продуктов. Ферменты как биологические катализаторы давно применялись в самых различных областях — в пищевой, фармацевтической, текстильной, кожевенной, бумажной промышленности, производстве моющих и косметических средств, фотоматериалов, в тонком органическом синтезе, медицине, сельском хозяйстве и т. д. [[40]].

Качественно новый этап в развитии, позволяющий говорить о возникновении новейшей высокой технологии – развитие и внедрение в промышленность методов иммобилизации ферментов и клеток, т. е. связывания их с носителем, благодаря чему стабилизируется и пролонгируется ферментативная активность, возможно повторное применение ферментов, они не загрязняют конечный продукт.

Первые попытки иммобилизации делались еще в конце XIX в. (). В 1916 г. было показано, что инвертаза, если адсорбировать ее на угле или на алюмогеле, сохраняет каталитическую активность. Целенаправленная разработка катализаторов на основе иммобилизованных ферментов началась лишь в 50-х годах, существенные успехи достигнуты к концу 60-х годов. Первое промышленное производство с использованием иммобилизованных ферментов было организовано в 1969 году, и иммобилизованных клеток - в 1973 г. [[41]].

Одна из самых крупных современных областей применения ферментов – производство глюкозо-фруктозного сиропа (заменителя сахара), организованное в 60-х годах. Иммобилизованные ферменты и клетки применяются также при производстве медикаментов, аминокислот, и многих продуктов, часто заменяя традиционные микробиологические производства. Методы иммобилизации имеют большое значение для развития новых биотехнологических процессов, основанных на использовании клеток животных и растений. Иммобилизованные ферменты и клетки употребляются также в качестве биосенсоров для определения наличия и концентрации различных веществ в медицине, сельском хозяйстве, контроле уровня загрязнения окружающей среды, в химической промышленности, биотехнологии и т. д. В России созданы конкурентоспособные на мировом рынке системы очистки газовоздушных выбросов (ИБХ РАН).

5.2  Генная инженерия

Генная инженерия - совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы. Термин “генная инженерия” ввел в научный оборот нобелевский лауреат Э. Тэйтум еще в 1963г., он же четко определил ее задачи (опубликовано в 1965г.[[42]]). Возникновение генной инженерии условно относят к 1972г., когда была создана первая рекомбинантная молекула ДНК (П. Берг и др., США).

Можно выделить три типа генных воздействий:

- введение в организм чужеродных генов (как полученных из генома других организмов, так синтезированных искусственно) для изменений свойств и признаков последнего;

- избирательная активация гена (“адресное ” разрушение гена, “антисмысловая” блокировка гена или производимой им РНК), позволяющая вывести из строя любой ген внутри живой клетки;

- направленное изменение гена (адресный мутагенез in vivo, генная инженерия in vitro - ex vivo) в любую сторону.

5.2.1  Введение чужеродного гена в организм

Наиболее распространенный и коммерчески реализованный в настоящее время тип генного воздействия - введение в организм чужеродных генов. Создание трансгенного организма осуществляется в несколько этапов: получение генетического материала (фрагментов ДНК — генов), включение фрагмента чужеродной ДНК в вектор, перенос внесенных генов в клетку, закрепление их в ней, идентификация (скрининг и селекция) клеток, которые приобрели желаемые гены.

Возможно три направления — введение генов в клетки бактерий и дрожжей, в соматические клетки (растений, животных, человека) и в зародышевые клетки.

Получение генов.

Гены для клонирования могут быть непосредственно выделены из генома донорских клеток, получены путем копирования матричных РНК или с помощью химико-ферментативного синтеза.

Для выделения гена, несущего определенную функциональную информацию, из донорской клетки можно использовать различные методы (например гидродинамическое дробление или ультразвук). Однако основной инструмент ученых - рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы). Эти ферменты способны узнавать специфические места ДНК (сайты) и расщеплять нуклеотидные последовательности в ДНК на фрагменты в этих строго определенных участках. Биологическая роль рестриктаз, например, в клетках прокариот заключается в активном метилгидролизе чужеродной ДНК, проникающей в клетки извне, собственная хромосомная ДНК при этом остается незатронутой благодаря специальному механизму защиты. Первая рестриктаза была выделена в 1968 г., но она не вызвала интереса и практически не применяется. Через два года были выделены более активные ферменты этой группы, которые расщепляли ДНК по специфическим последовательностям оснований с получением фрагментов. Это открытие стало одним из основных в развитии технологии рекомбинантных ДНК, так как молекулярные биологи получили средство для разрезания ДНК точно в желаемых местах и для изолирования генов. В настоящее время известно свыше 500 рестриктаз и для многих из них определены узнаваемые последовательности. Значительное число рестриктаз производится в качестве конечных продуктов биотехнологии, например, такими компаниями как Sigma (США), Pharmacia (Швеция), Serva (Германия) и др.

Фрагменты ДНК, полученные тем или иным методом, разделяют с помощью электрофореза в гелях, из которых их экстрагируют и проводят анализ выделенных и очищенных фрагментов. Из 160 мкг ДНК нематоды Caenorabiditis elegans удается получать 2-4 мкг какого-либо одного фрагмента.

Метод выделения генов имеет недостатки: набор рестриктаз, доступных на рынке, велик, но ограничен, поэтому часто трудно подобрать рестриктазу, позволяющую вырезать точно заданный участок, и фрагменты ДНК включают лишние нуклеотидные последовательности или в них не достает части нуклеотидной последовательности гена.

Дополнительные сложности возникают при использовании в качестве доноров эукариотных клеток (грибы, растения, животные и пр.), в которых гены, кодирующие белок, имеют мозаичную структуру. В них чередуются экзоны - участки, кодирующие белок, и интроны - промежуточные, некодирующие участки (термины предложены У. Гилбертом в 1978 году). В клетке первичная РНК, синтезированная на такой ДНК, подвергается модификации, в результате которой участки, соответствующие интронам вырезаются, а значащие участки сшиваются и образуется зрелая матричная РНК (мРНК), на которой синтезируется белок (сплайсинг или процессинг мРНК). В процессе дифференцировки эукариотических клеток обнаружена неоднотипность сплайсинга, а именно то, что в одном случае предстает интроном, в другом может оказаться экзоном, и наоборот. Следовательно, существуют гены, способные кодировать не один белок.

Эти проблемы позволяет решить ферментативный синтез генов на основе выделенной из клетки мРНК. Этот наиболее распространенный метод получения генов основан на использовании обратной транскрипции, позволяющей получить ДНК без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей непосредственно на основе мРНК. Это явление было предсказано советским генетиком (работы были начаты еще до войны, но, как и все работы по генетике в СССР, прерваны и возобновились лишь в начале 60-х годов). Специальный фермент - ревертаза катализирует синтез нити ДНК, комплиментарной мРНК. Полученную одноцепочечную нить используют для синтеза второй нити ДНК с помощью ДНК-полимеразы или ревертазы.

В 1979 году таким способом был получен ген гормона роста человек (соматотропина), позднее - ряд других генов.

Химико-ферментативный синтез индивидуального гена впервые был осуществлен в годах в группе, работающей в США под руководством индийского химика Г. Кораны. Метод включает химический синтез коротких (8-16 звенных) одноцепочных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами и сшивку нулеотидов (с помощью лигаз, описанных ниже) с образованием двухцепочечных полинуклеотидов. Для этого необходимо иметь полную информацию о нуклеотидной последовательности гена. Последовательность нуклеотидов в гене может быть воссоздана на основе первичной структуры соответствующего белка. Этим методом получены гены соматостатина, инсулинов и пр.

Введение гена в вектор

Вектор — молекула ДНК, способная переносить в клетку чужеродную ДНК и обеспечивать там ее размножение или — реже включение в геном. Название "вектор для клонирования" введено М. Томасом в 1974г. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК (р-ДНК).

Вектор-самый важный компонент процесса клонирования. Он должен обеспечивать относительную легкость накопления и выделения его в достаточном количестве. Векторы должны размножаться в клетке-хозяине, и при введении чужеродной ДНК их функции не должны существенно нарушаться. Для клонирования ДНК можно использовать различные векторы - плазмиды, вирусы, фаги, которые в естественных условиях служат инструментом для переноса чужеродной генетической информации.

Плазмиды - малые молекулы, несущие по нескольку генов, присутствующие в клетках многих микроорганизмов, растений, животных наряду с большой молекулой наследственной ДНК. Эти внехромосомные детерминанты наследственности являются автономными структурами, несущими свою информацию в виде небольшой циклической ДНК. К ним относится, например, половой фактор — F-фактор, а также факторы лекарственной резистентности (фактор R), которые изучаются с 1955 г., когда в Японии от больного дизентерией была выделена дизентерийная палочка, устойчивая к ряду антибиотиков и сульфамидов.

Встраивание чужеродного фрагмента ДНК в геном вектора осуществляется в два этапа: сначала ДНК вектора разрезается с помощью рестриктаз, а затем в них встраивается чужеродный фрагмент.

Различают два типа фрагментов ДНК. Некоторые из них имеют на концах структуры, способные соединяться друг с другом - короткие гомологичные последовательности нуклеотидов (липкие концы), другие не имеют таких структур (фрагменты с тупыми концами).

Соединение фрагментов с тупыми концами осуществляется под действием лигаз - ферментов, впервые описанных в 1967г. К такому концу пришивают лигазой однонитчатую липкую цепь нуклеотидов, а к другому фрагменту — комплементарную ей. При смешивании их растворов липкие концы находят друг друга и соединяются водородными связями, а затем их сшивает лигаза. Вскоре было обнаружено, что фаг Т4 образует лигазу, соединяющую тупые концы. При комбинации различных рестриктаз и лигаз можно практически в любом месте разрезать ДНК и сшить ее. Поэтому открытие этих ферментов привело к необыкновенному расширению экспериментальных возможностей биологии, позволило проникнуть в глубь явлений.

Для сшивания фрагментов ДНК используют линкеры и адапторы. Линкер (от англ. link - соединять} - это синтетический, короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания для ряда рестриктаз; он может быть присоединен к концам фрагмента ДНК, полученного с помощью какой-либо рестриктазы, в процессе реконструирования рДНК. Адаптор-это линкер, содержащий больше, чем один сайт узнавания рестриктазой, и обеспечивающий получение фрагментов от действия одной рестрикционной эндонуклеазы для включения в сайт другой рестриктазы, то есть адаптор предназначен для объединения фрагментов с несовместимыми концами.

При конструировании векторов в них вводят гены-маркеры, кодирующие легко распознаваемые признаки для обнаружения и отбора последующих трансформантов, и несколько сайтов узнавания различными рестриктазами в целях получения для клонирования серии разных молекул ДНК.

Перенос генов в клетки-реципиенты

Перенос генов в клетки-реципиенты осуществляется путем трансформации, коньюгации или трансфекции. Наиболее распространенный метод - трансформация. Это - перенос свободной ДНК вектора в реципиентную клетку, при котором происходит рекомбинация и интегрирование однонитиевого фрагмента ДНК в хромосому реципиента или внехромосомную генетическую систему.

После переноса генов лишь небольшая часть клеток несет нужный ген. Клетки-реципиенты, обладающие нужными свойствами, надо выделить из общей массы традиционным методом искусственного отбора. Для идентификации клеток используют современные методы анализа (определение последовательности ДНК, иммунологический анализ и пр.). Для того чтобы найти клетки, получившие плазмиду со встроенным в нее чужим геном, необходимо проанализировать большое количество клонов (идентичное потомство одной клетки - нечто вроде шотландского клана).

Основным объектом генетических манипуляций долгое время были прокариоты (бактерии). Позднее исследователи начали работать и с низшими эукариотами (дрожжами), а затем и с клетками высших эукариотов (растений, животных). Работы по трансформации более сложных клеток высших эукариот вначале не приносили успеха, так как не были известны способы выделения ДНК отдельных генов, не была достаточно разработана генетика клеточных культур, не было четких методов контроля реверсии мутантов и способа проверки генетической природы трансформации, но позднее эти трудности были преодолены.

Одна из сложных проблем генной инженерии растений – крайне ограниченный набор векторов, доступных исследователям. Перенос генов в растения начали осуществлять в 1981 г. В 1983 г. был успешно введен бактериальный ген в табак [[43]]. При этом в качестве вектора была использована Ti-плазмида Agrobacterium tumefaciens — почвенной бактерии, вызывающей корневой рак у двудольных растений. Эта плазмида - самый распространенный вектор в манипуляциях с растительными клетками. Она может быть использована для переноса генов в большое количество двудольных растений — картофель, бобы, яблоки, соя, розы и т. д. Для злаков и других растений, которые не поражаются корневым раком, необходимо подбирать либо другие векторы, либо использовать изощренные методы заражения этой бактерией, разработанные за последние годы (электропорация, бомбардировка частицами, микроинъекция). Так, бомбардируя ядра клеток растений “снарядами” из рДНК Ti-плазмиды с помощью генных ружей удалось в лабораториях получить трансгенный ячмень, новые сорта орхидей и пр.

Для животных, в отличие от растений, меньше проблем с поиском векторов, их при работе с культурами клеток животных найдено сравнительно много.

Получение жизнеспособных животных и растений из клеток, полученных методами генетической инженерии, осуществляется методами клеточной биотехнологии.

5.2.2  Адресное расщепление и изменение гена

Пионерские работы в этой области выполнил в начале 1970-х годов . Метод основан на том, что зная структуру гена - мишени можно синтезировать “антисмысловую” ДНК или РНК - фрагмент ДНК или РНК, полностью комплиментарный смысловой (т. е. кодирующей белок) нити гена. Такой фрагмент прилипнет точно “по адресу” - к тому гену - мишени, блокируя его. Если этот фрагмент несет на себе пришитую химическую группу, разрушающую цепь ДНК в месте контакта или модифицирующую ее - ген будет инактивирован или модифицирован, что можно использовать, в частности, в медицине. Для обнаружения каких-либо генов в организмах используют такие антисмысловые ДНК или РНК, соединенные с маркерами (ДНК - или РНК-зонды).

5.3  Клеточная инженерия

Клеточная инженерия объединяет ряд методов манипуляций с клетками растений и животных - соматическая гибридизация, манипуляция с эмбрионами и т. д.

Соматическая гибридизация – это слияние (фузия) лишенных оболочки соматических клеток или их частей. Она позволяет преодолеть физиологическую несовместимость и скрещивать неродственные виды, создавать межвидовые гибриды культурных растений с их дикими сородичами. Соматическая гибридизация имела, особенно на первых порах, некоторое преимущество по сравнению с переносом генов, так как для этого метода нет необходимости знать молекулярные основы действия генов. Одно из крупных достижений - создание гибридом. Так назвали клетки, полученные путем слияния (фузии) соматических клеток животных (или человека) и клеток опухоли – миеломы. Гибридомы соединяют свойства соматической клетки с бессмертием клеточных линий миеломы.

В 1975 году г. Кёллер и С. Мильштейн, работавшие в Кембридже, сообщили о новом способе получения иммунных белковых антител повышенной специфичности, известных сегодня как моноклональные, с помощью гибридом [[44]]. В 1984 г. эти ученые и руководивший работами Н. Ерне получили Нобелевскую премию по медицине за это достижение.

Большое значение имеет пересадка соматических ядер в зрелые яйцеклетки с целью клонирования (получения идентичных копий) взрослых животных. Удачные опыты над амфибиями осуществлялись сравнительно давно, проводились попытки получить живое млекопитающее из соматической клетки взрослого животного. И вот в феврале 1997 года появилось сенсационное сообщение – осуществлено клонирование взрослой овцы [[45]]. Интерес представляет анализ примененной авторами методики. Для получения потомства они слили две клетки: ядро соматической клетки взрослой овцы, полученной из клеточной культуры в определенной стадии роста переносилось в неоплодотворенную яйцеклетку с удаленным ядром. Полученная таким образом яйцеклетка имплантировалась овце, которая естественным образом выносила и родила ягненка. При этом происхождение митохондрий у полученного животного в статье не обсуждается. Они могут быть от соматической клетки, от яйцеклетки или представлять смесь. В двух последних случаях нельзя говорить о точном клонировании, так как митохондрии наряду с ядром переносят часть наследственной информации, хотя и очень небольшую. Авторы вообще ни разу не употребляют слов клон, клонирование, их употребляют комментаторы. В статье были подчеркнуты сугубо научные аспекты. Главная цель, которую ставили перед собой авторы – доказать, что в дифференцированных клетках различных органов взрослых млекопитающих не происходит необратимых изменений генетического материала и они могут при соответствующих условиях дать жизнь новому организму. Авторы отмечают возможность применения своего достижения в сельском хозяйстве для улучшения генетики популяции животных, так как можно получить копии самых удачных животных, в том числе трансгенных.

После этого появились данные о клонировании других млекопитающих.

5.4  Клеточная биотехнология

Это важное направление новейшей биотехнологии сложилось в конце 60-х - начале 70-х годов на базе метода культур и тканей, развивавшегося с конца XIX века в основном как экспериментальный метод. Культивирование клеток растений и животных - важный инструмент исследований и в современной биологии.

Без этой техники невозможно создание животных и растений из клеток, полученных методами генетической и клеточной инженерии, на ней основано микроклональное размножение растений, она используется в животноводстве в репродукции животных, эти методики подробнее рассмотрены ниже.

Использование клеточных культур животных имеет небольшую предысторию. Сначала в производстве вакцин в качестве субстрата для размножения вирусов использовали ткани животных, однако для получения сложных вакцин и повышения стабильности процессов были разработаны клеточные культуры. В 50-х годах, когда возникла острая необходимость в вакцине против полиомиелита, в ее производстве использовали культуру клеток почек обезьян. Но там обнаружили эндогенные вирусы, попадавшие в вакцину. Тогда начали использовать диплоидные клетки человека. Вскоре были разработаны методы выращивания клеток животных в достаточных количествах. И сейчас производство вакцин - самая большая область применения культур клеток животных.

Вторая давняя область применения культур клеток животных - лабораторные исследования. В частности, их использовали для испытания лекарств, пищевых добавок и т. д. Применяемые для выращивания таких культур методы были очень сложными и это было скорее искусством, чем технологией.

В последние два десятилетия развилось от лабораторной технологии до крупномасштабного производства промышленное культивирование клеток животных. Этот метод позволяет реализовать на практике многие достижения генной и клеточной инженерии в новейших биотехнологических производствах.

Для организации рентабельных стабильных крупномасштабных производств с использованием клеток животных надо было решить ряд сложных проблем, казавшихся непреодолимыми. Эти клетки - очень хрупкие и легко повреждаются при перемешивании, обладают низкой продуктивностью по сравнению с бактериями, медленно растут, требуют сложных и дорогих сред, они не были достаточно изучены, процессы с их использованием требуют сложного технологического оформления и эффективного контроля. Взаимодействие многих наук и усилий технологов и разработчиков аппаратурного оформления процессов, использование достижений генной инженерии привели к тому, что в 80-х - 90-х годах удалось преодолеть большинство из перечисленных препятствий.

Одной из главных задач было создание культур клеток - эффективных продуцентов желаемого продукта. В природных условиях клетки животных (за некоторыми исключениями) производят мало белка, медленно растут. Производительность клеток иногда удается повысить с помощью генной инженерии. Так, за счет амплификации (многократного копирования в клетке) генов, отвечающих за синтез данного белка, удается повысить его синтез. Однако такие клоны часто нестабильны и плохо растут. Создаются также рекомбинантные клетки, в которых искусственно вызывается экспрессия гена, отвечающего за синтез белка. Для этого используются регуляторные последовательности различных вирусов.

Одна из самых сложных проблем - подбор питательных сред для выращивания культур клеток животных. Традиционно клеточные культуры выращивали на сыворотках животного происхождения (лимфа, плазма, позднее - эмбриональная жидкость и т. д.).Это сырье дорого, непостоянно по составу (состав от партии к партии существенно меняется), содержит много посторонних белков (что усложняет процесс выделения готового продукта). Более того, трудно исключить возможность заражения сырья различными вирусами, которые могут попасть и в готовый продукт. Например, рынок сырья для производства вакцин в Англии был разрушен после того как выяснилось, что вирус коровьего бешенства вызывает серьезное заболевание у человека.

Уже в 50-х годах, когда начало возникать крупномасштабное производство вакцин, осуществлялись попытки создать среды определенного состава. Одним из первых Г. Игл [[46]] разработал среду сложного состава - смесь аминокислот, минеральных веществ, витаминов, углеводов, содержащую 20% сыворотки (без этого не удавалось обеспечить удовлетворительный рост клеток). На таких средах осуществляются многие производства клеточной биотехнологии. Однако новые производства разрабатываются уже на средах полностью контролируемого состава, не содержащих сыворотки, такие среды доступны в настоящее время для большинства типов клеток.

При переходе к крупномасштабным производствам возникла необходимость усовершенствовать технологию и аппаратурное оформление процесса культивирования.

До недавнего времени клетки животных культивировали в монослойной глубинной культуре с низкой плотностью в ферментерах, созданных для культивирования микроорганизмов. Сейчас разработаны специальные ферментеры для крупномасштабного культивирования клеток животных с высокой плотностью. Как и в микробиологической промышленности, существует много различных технологических решений (ферментеры с перемешиванием, эрлифтные, турбинные и пр.). Клетки очень чувствительны к механическим напряжениям, поэтому их часто иммобилизуют - прикрепляют к поверхности различных носителей - полых волокон, керамических картриджей, стеклянных носителей, микроносителей и т. д. Использование микроносителей (микросфер диаметром от 100 до 400 мкм), особенно макропористых, в которых до 40% внутреннего объема заполняется клетками, позволяет защитить клетки от механического повреждения и выращивать их в суспензии. Используются также клетки, заключенные в капсулы, клеточные агрегаты.

Все шире используется непрерывное культивирование, хотя многие важные промышленные процессы (например, производство эритропойетина) осуществляются периодически. Это обусловлено, в частности, проблемой генной стабильности клеток и возможностью заражения, что ограничивает максимальную продолжительность их непрерывного культивирования.

При промышленном культивировании клеток животных проблема контроля и управления еще сложнее и важнее, чем в традиционной биотехнологии, так как клетки более чувствительны и менее стабильны, чем микроорганизмы. Для раннего обнаружения отклонений необходимо осуществлять постоянный мониторинг условий культивирования и состояния клеток. Для этого используют последние достижения современной технологии (ядерно-магнитный резонанс и лазеры для определения жизнеспособности, размеров и количества клеток в культуре, моноклональные антитела для иммунологического анализа и т. д.). Однако и сейчас проблему контроля нельзя считать решенной, не все важные параметры можно измерить существующими методами.

Большое значение для контроля имеет разработка математических моделей. Она осуществляется на основе модели Моно - Иерусалимского, и требует глубокого изучения метаболизма клеток. Дополнительная сложность моделирования обусловлена гетерогенностью систем - различными условиями в разных частях современного ферментера с высокой плотностью культуры.

Важнейшая стадия промышленного процесса - выделение, очистка и стандартизация готового продукта. Стоимость этих “хвостовых” стадий составляет в биофармацевтической промышленности 70-80% цены продукта, поэтому рентабельность процесса во многом определяется этими стадиями, они же играют решающую роль в безопасности продукта. Из-за лабильности продукта применимы только мягкие методы выделения и очистки, что трудно сочетать с требованием получения стерильного апирогенного продукта. Важная задача - определение полученного продукта, для этого используются биологические тесты, тесты на определение вредных примесей, на идентичность белка (в том числе, иммунологический анализ, частичный анализ последовательностей ДНК). Все эти тесты очень сложны и дороги.

Все стадии процесса, как всегда в биотехнологии, взаимосвязаны, поэтому осуществляется интегрированное проектирование процесса - одновременная оптимизация серии взаимодействующих операций, с удовлетворением строжайших требований безопасности.

5.5  Новейшая биотехнология в медицине.

5.5.1  Получение белков животных и человека.

Промышленное получение чистых белков животных и человека для медицинских целей - первое (и по времени возникновения и по значимости) направление новейшей биотехнологии. Эти белки представляют собой новое поколение лекарств и средств диагностики, они произвели переворот в современной биофармацевтической промышленности. Сейчас годовое производство этих средств в мире оценивается примерно в 20 млрд. дол.[[47]] (что равно всему официальному бюджету нашей страны).

Белки – основа жизни. Различные белки (гормоны, ферменты и пр.), вырабатываемые клетками животных, играют большую роль в обмене веществ и их недостаток в организме вызывает серьезные болезни. Известно около 200 наследственных заболеваний, обусловленных дефицитом какого-либо белкового фактора [[48]]. Так, под действием инсулина - пептидного гормона, вырабатываемого поджелудочной железой, сахар переносится из крови в клетки. При диабете нарушается синтез инсулина, его недостаток или отсутствие ведет к тому, что сахар остается в крови, отравляя мозг, перегружая почки. Механизм действия инсулина открыт канадским исследователем Ф. Бантингом (Нобелевская премия 1923 года). Белковую природу имеют и факторы свертывания крови, отсутствие которых вызывает различные формы гемофилии - болезни, сыгравшей роковую роль в российской истории ХХ века. При недостатке в организме гормона роста (соматотропина) развивается карликовость.

Белки играют важную роль в деятельности иммунной системы. Для борьбы с вирусными инфекциями, раком организм производит интерфероны. Они открыты в 1957 г. британским ученым А. Айзэксом. В организации иммунного ответа участвуют и интерлейкины - сравнительно короткие полипептиды, вырабатываемые лейкоцитами и лимфоцитами. Важнейшую роль играют антитела - специальные белки (иммуноглобулины), вырабатываемые организмом для связывания антигенов - бактерий, вирусов, “чужих” клеток, сложных органических веществ, которые распознаются иммунной системой как представляющие потенциальную опасность для организма.

В медицине для коррекции дефицита эндогенных молекул, повышения иммунитета использовали белки, полученные из тканей различных животных, например инсулин получали из поджелудочной железы свиней или коров. Такие белки достаточно дороги и слегка отличаются по строению от белка человека, что снижает их эффективность, может вызвать аллергическую реакцию у пациента. Путем химической модификации инсулин животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это удорожало готовый продукт. Многие белки животного происхождения вообще неприменимы в медицине, так как организм использует механизм защиты от чужих белков. В таком случае пытались использовать белки, получаемые из тканей человека (донорской крови, удаленных при операциях органов, трупного материала), которые еще дороже и дефицитнее. Так, для лечения и профилактики вирусных заболеваний и рака использовали интерферон, полученный из донорской крови. При этом на получение 0,1 грамма препарата требовалась кровь 90000 доноров [1]. Гормон роста соматотропин получали из гипофиза человека. Каждый гипофиз содержит менее 4 мг гормона, а для лечения одного ребенка, страдающего карликовостью, нужно около 7 мг в неделю в течении нескольких лет [1]. Химический синтез белков животных и человека также очень дорог. Поэтому перед учеными стала задача получить в промышленных условиях биотехнологическими методами белки, синтезируемые клетками животных и человека.

В 70-х годах методами генной инженерии удалось получить клетки микробов - продуцентов различных белков животного происхождения, вводя гены, отвечающие за синтез этих белков, в геном микроорганизма. Это открыло возможность организовать в промышленности микробиологический синтез белков животных и человека, опираясь на все достижения традиционной биотехнологии.

Первым продуктом, полученным методом генной инженерии, был человеческий инсулин. В 1978 году в США были проведены работы по раздельному синтезу А - и В-цепей человеческого инсулина с помощью сконструированного методами генной инженерии штамма кишечной палочки. В 1982 г. ФДА (Food and Drug Administration – орган, уполномоченный давать разрешение на коммерческое использование в США лекарств, пищевых продуктов и косметики) после долгих дискуссий одобрила и разрешила применение генно-инженерного инсулина (это был первый из полученных методами генной инженерии продуктов, получивший такое одобрение), и компания Eli Lilly выпустила его на рынок. Он оказался значительно дешевле свиного и бычьего инсулина и был идентичен человеческому белку по составу. Позднее производство генно-инженерного инсулина осуществили и в других странах, в том числе и в СССР (Институт биоорганической химии им. АН СССР).

Наиболее важная задача медицины конца ХХ века - борьба с вирусными инфекциями и раком, поэтому интерферон - белок, вырабатываемый для борьбы с этими болезнями самим организмом, привлекал пристальное внимание исследователей. В 1980 году компания Biogen, основанная учеными У. Гилбертом из Гарварда и Ч. Вайсманном из Цюриха произвела интерферон с помощью рекомбинантных ДНК. В том же году У. Гилберт вместе с П. Бергом и Ф. Сэнджером получил Нобелевскую премию по химии за успешное решение этой задачи. Позднее клинические испытания показали, что интерферон не так эффективен, как ожидалось и не решает полностью проблемы рака и вирусных инфекций, иногда он дает побочные эффекты. Однако он также разрешен к применению и используется в качестве лекарства от рака и вирусов и производится в коммерческих масштабах. В нашей стране конструирование микроорганизмов - продуцентов интерферона проводилось в рамках комплексной целевой программы “Биотехнология” при участии ВНИИ генетики, ИБФМ АН СССР, ИБХ АН СССР им. , Академии медицинских наук, Института эпидемиологии и микробиологии им. и др.

После первых успехов с интерфероном и инсулином стал очевиден коммерческий потенциал генной инженерии, она стала крайне привлекательной для инвесторов. Появление в 1980-х годах новой грозной вирусной болезни - СПИДа (по словам “к счастью для науки и к несчастью для человечества”[[49]]) способствовало росту интереса к этой отрасли.

Были достигнуты определенные успехи - получены генно-инженерный гормон роста соматотропин и его антагонист соматостатин и некоторые другие гормоны, интерлейкины, фактор свертывания крови для лечения гемофилии, белковые вакцины.

Однако развитие отрасли шло медленнее и стоило много дороже, чем первоначально ожидалось. Оказалось, что бактерии не могут воспроизвести аутентично многие белки, так как в животных клетках они преобразуются после трансляции (пострансляционная модификация), а в бактериях этого не происходит. Эта модификация может сильно влиять на активность белка, его стабильность и т. д., поэтому полученный с помощью бактерий белок может оказаться не пригоден для употребления в медицине. Кроме этого, нередко возникают проблемы и с культивированием бактерий, несущих ген чужеродного белка (белок может быть токсичен для бактерии, бактерии могут его разлагать и т. д.), с выделением готового продукта.

Поэтому для производства ряда белков применение клеточных культур оказалось более рациональным. Клетки животных и человека - очевидно идеальный продуцент для производства различных белков животного происхождения, но в 70-х годах технология культивирования этих клеток была почти не разработана и ее промышленная реализация казалась проблематичной. Успехи клеточной биотехнологии позволили преодолеть в 80-х - 90-х годах большинство из препятствий и начать выпускать ряд белков с помощью клеточных культур.

Этим методом производят целый ряд препаратов, разрешенных к применению в качестве лекарств: интерфероны (применяются для лечения и профилактики рака и вирусных инфекций), эритропоэтин (препарат от анемии), гормон роста человека (лечение карликовости), фактор VIII (для лечения гемофилии), фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов, активатор тканевого плазминогена (ТРА) для лечения тромбоза коронарных сосудов, вакцины (поверхностный антиген вируса гепатита В) и пр.

Важнейшая область применения клеточной технологии - производство моноклональных антител (МАТ). Разрабатываются методы получения стабильных линий гибридом для получения различных антител.

Моноклональные антитела используют в медицине для диагностики беременности, инфекционных заболеваний (при этом можно идентифицировать не только вид, но и серотип возбудителя), различных форм рака, ряда наследственных заболеваний, выявления предрасположенности к диабету, ревматоидному артриту и пр. Применяются они и для диагностики болезней животных и растений. Моноклональные антитела используют также в качестве лекарств. Используется их способность подавить иммунный ответ организма при пересадке тканей и органов, при некоторых аутоимунных заболеваниях. Так ортоклон ОКТ3 применяется при пересадке почек для предупреждения отторжения почечных трансплантатов. Препарат центоксин используется при септическом шоке. Для лечения рака можно использовать моноклональные антитела, коньюгированные с очень сильными токсинами, неприменимыми в обычной терапии. Они доставят яд точно по адресу - в раковую клетку, здоровые клетки при этом не пострадают. В фармацевтической и химической промышленности моноклональные антитела используют для очистки препаратов, например – генно-инженерных интерферонов. На их основе создаются также чувствительные датчики.

При любых подходах для создания оптимально работающих клеточных линий необходимо дальнейшее тщательное изучение регуляции клеточного механизма и механизма синтеза белка.

Исследования последних лет продемонстрировали возможности использования трансгенных растений в качестве дешевых и безопасных биореакторов, производящих различные гормоны, цитокины, моноклональные антитела, ферменты и другие фармацевтические средства [[50]]. Созданы трансгенные растения - продуценты вакцин против различных болезней (например, гепатита В), но коммерческие препараты не получены [[51]]. В настоящее время в мире запатентовано много трансгенных животных - например, способных производить гемоглобин человека, антитела, фибриноген, фактор коагуляции VII человека [[52]].

В России разработан и разрешен к применению в клинической практике ряд лекарственных средств и диагностикумов, полученных методами новейшей биотехнологии: a2-интерферон, интерлейкин -3, эритропоэтин, гранулоцит-колоний-стимулирующий фактор, вакцина против гепатита В, наборы для выявления хламидийной инфекции и пр., в различных стадиях разработки и испытаний находятся многие другие препараты для медицины и ветеренарии. Однако отсутствие финансирования тормозит внедрение в производство этих и других лекарственных препаратов. Так, до сих пор не удается найти 25 млн. долларов для строительства завода по производству факторов VIII и IX для лечения гемофилии, и тысячи наших граждан (в основном детей) обречены на мучительное, не эффективное лечение методиками 50-х годов с применением препаратов донорской крови и почти неизбежное заражение гепатитом, а скоро - и СПИДом.

5.5.2  Белковая инженерия

Новое направление - белковая инженерия - получение модифицированных, не существующих в природе белков с заданными свойствами. Такие белки применяются в научных исследованиях, возможно их использование в медицине.

Природные белки имеют свою молекулярную архитектонику - то это вытянутые, то специфически изогнутые или скрученные структуры. Поэтому в научной литературе, посвященной белковой инженерии, можно встретить выражение "архитектурный дизайн", когда говорят о конструировании молекул белков с заданной архитектурой по специально подобранным аминокислотным текстам.

Белковая инженерия в любом проявлении будет базироваться в основном на продуктах экспрессии естественных и рекомбинантных генов. Методы генной инженерии в сочетании с методами химического синтеза генов и специфической модификации нуклеиновых кислот позволяют получать белки, содержащие запланированные изменения в определенных участках, а также белки совершенно новой структуры. С помощью перетасовки фрагментов ДНК получено много ферментов, пептидов [[53]]. Например, получен гибридный интерферон человека в результате объединения частей генов двух интерферонов и введения гибридного гена в клетки E. coli (, Институт биоорганической химии АН СССР им. ).

Для успешного развития этого направления необходимо понимать, где главное звено в структуре белков (почему они функционируют так, а не иначе),выяснить причины и механизмы изменения фенотипа под влиянием генотипа.

5.5.3  Другие медицинские области применения новейшей биотехнологии

Важной областью применения биотехнологических методов стала репродуктивная медицина. Современные методы оплодотворения (оплодотворение в пробирке, перенос эмбрионов суррогатным матерям и т. д.) широко применяются с конца 1970 годов, они позволили многим бесплодным парам стать родителями.

Большое значение для медицины имеет полная расшифровка генетического кода человека, осуществляемая в рамках грандиозного международного проекта “геном человека”, в котором участвуют и российские ученые. Это - огромная по объему работа, которая проходит с постоянным ускорением. Работа по расшифровке геномов производится на автоматических ДНК-анализаторах, результаты ее (длинные последовательности оснований) давно публикуются только в электронной форме. Полная расшифровка генома живого организма (червя) была впервые осуществлена группой британских и американских исследователей в 1998 г., а уже в 2000 году американским ученым удалось полностью установить химическую структуру генома живого человека (добровольца, предоставившего свои клетки для анализа). Физическое картирование пока сталкивается со многими проблемами, даже у наиболее простых и изученных организмов - бактерий E. Coli и B. subtilis около 40% открытых рамок считывания не могут быть соотнесены с какой-либо функцией [[54]]. Однако и здесь много достижений, для многих наследственных заболеваний человека уже известно, какие генетические дефекты их вызывают. По мере накопления данных по генетическому и физическому картированию генома человека становится доступной информация о будущих, еще не реализованных структурно-функциональных особенностях индивида - как - взрослого, так и ребенка, возможна пренатальная диагностика - анализ генома еще не родившегося ребенка. Все это может помочь в своевременном выявлении и лечении болезней. Например, одна из самых распространенных болезней, вызванных дефектом гена - серповидноклеточная анемия - никак не проявляет себя на стадии эмбриона. До недавнего времени супружеским парам, в семьях которых с обеих сторон встречается эта болезнь, генетики могли только сказать, что вероятность рождения больного ребенка - 25%, оставляя их перед страшной дилеммой - вообще отказаться от рождения детей или пойти на серьезный риск того, что ребенок окажется тяжело больным. В конце 80-х годов в США, где это заболевание широко распространено среди негритянского населения, стали в этих случаях делать пренатальную диагностику эмбриона. Если ребенок здоров - можно успокоиться, если он болен - не поздно сделать аборт по медицинским показаниям. Ситуация, конечно, тоже не самая приятная, особенно для верующих семей, но применение этой методики дало возможность многим парам обзавестись здоровыми детьми. В скором времени генетики, скорее всего, научатся спасать в этом случае и больного ребенка.

Большие надежды связаны с развитием генной терапии – намеренного вмешательства в геном человека для коррекции заболеваний, которое позволяет лечить не следствия, а причину болезней [[55]], как врожденных, так и приобретенных. Пока реальные достижения скромны, но это очень перспективное и быстрорастущее направление, один из бесспорных лидеров XXI в. Один из каждых десяти людей страдает каким-либо генетическим заболеванием или заболеет им в будущем [[56]]. В принципе, практически любое инфекционное заболевание (грипп, СПИД, малярию и т. д.) можно рассматривать, как результат наследственного дефекта - существуют люди, в геноме которых есть гены, обеспечивающие невосприимчивость к данной болезни, они не заболевают ни при какой эпидемии. Генная терапия врожденных заболеваний наиболее эффективна если они связаны с дефектом одного гена (известно около 2800 таких заболеваний, в том числе - серповидноклеточная анемия).

Возможно три вида генной терапии - вмешательство в геном половых клеток, изменяющее весь геном и влияющее на будущие поколения, терапия определенных соматических клеток для изменения их функционирования (эти изменения не передадутся по наследству) и внутриматочная генная терапия еще неродившегося ребенка.

Направленное вмешательство в геном половых клеток, считается сейчас недопустимым, это отражено в “Конвенции о правах человека в биомедицине”, принятой Советом Европы в 1996 году и других документах [[57]]. Российские генетики также придерживаются этих ограничений [[58]]. Однако вряд ли эти ограничения вечны, по мере накопления знаний риск проведения подобных манипуляций снизится и начнет осуществляться коррекция наследственности в случае тяжелейших наследственных заболеваний, особенно вызванных дефектом одного гена.

Соматическая генная терапия - изменение соматических клеток, затрагивающее одного человека - также вызывает опасения: потенциально возможно изменение наследственности пациента, развитие у него злокачественных опухолей, существует риск заражения других лиц - передачи им рекомбинантного вектора, особенно ретровируса [[59]]. Тем не менее соотношение риска и пользы часто оказывается в пользу этого метода и он (при строгом контроле, как и другие сложные медицинские техники) уже начинает успешно применяться для лечения ряда тяжелейших болезней.

Попытки внесения изменений в наследственный аппарат человека осуществлялись в 70-80-е годы, но они не принесли успеха. В 1990г. была успешно осуществлена генетическая коррекция при лечении имунодефицита у 4-х летней девочки [[60]].

Крупный успех был достигнут в 1992 г. в США. Пациенткой стала канадка, которая с 16 лет страдала инфарктами, в 26 перенесла операцию на сердце. Лечение обычными методами не помогало. Выяснилось, что у женщины наследственное заболевание - был дефектен ген, ответственный за выработку в печени белка-рецептора, адсорбирующего липопротеиды низкой плотности, белок не вырабатывался и в результате у нее развился преждевременный артеросклероз. Такие тяжелые случаи, когда такие дефектные гены получены с двух сторон (от матери и отца) с встречается достаточно редко - у одного человека на миллион, такие люди были раньше обречены на смерть в раннем возрасте. Терять больной было нечего, и она стала первым в мире объектом уникальной операции. У пациентки вырезали часть печени, и в ее клетки с помощью трансфекции ввели нормальный ген. Эти трансформированные клетки вживили обратно в печень пациентки, часть из них прижилась и вырос кусочек печени, вырабатывающий недостающий белок. Жировой обмен нормализовался [[61]]. Методы генной терапии могут помочь и в значительно более частых случях (один на 500 человек) - когда дефектен один из двух парных генов, нарушение жирового обмена менее выражено и атеросклероз со всеми его грозными последствиями наступает годам к 35.

Вопреки первоначальным ожиданиям, сейчас наибольшая область для генной терапии - лечение не наследственных, а приобретенных заболеваний [25]. В генной терапии рака, вирусных заболеваний (в том числе СПИДа) можно использовать антисмысловые ДНК и РНК, которые помогут заблокировать встроившиеся в геном клеток больного гены вирусов или онкогены.

Бурные дискуссии [[62], [63]] вызывает допустимость внутриматочной генной терапии (введение генетических конструкций в развивающийся эмбрион для устранения врожденных дефектов). Риск внесения изменений в наследственность при этом выше, чем при соматической генной терапии, однако иногда это - единственная альтернатива прерыванию беременности. Сейчас этот метод отрабатывается на животных.

Важные перспективы связаны с созданием трансгенных животных в качестве доноров для ксенотранспланталогии - пересадки органов человеку. В настоящее время в экономически развитых странах лишь 5-6% нуждающихся получают органы для трансплантации традиционным путем, часто пациенты умирают, не дождавшись пересадки. Уже почти сто лет проводятся попытки пересадки органов от свиней, которые оказались наиболее близкими к человеку с этой точки зрения, однако в этом случае не была решена проблема, сложная при любых пересадках - отторжение трансплантанта. Работы по созданию трансгенных животных (свиней) - имуноприемлемых доноров для человека, которые проводятся при активном противодействии зеленых в Великобритании и США, смогут внести существенный вклад в решение проблем трансплантации[[64]], последнее важное достижение в этой области - клонирование свиней, об успехе которого средства массовой информации сообщили в начале 2000г. Предсказывают также возможность выращивания отдельных частей и органов человека как источника для пересадки органов. Первый успех в этом направлении - эмбрион лягушки без головы (лягушонок Фреди), созданный учеными Батского университета путем “отключения” соответствующих генов.

5.6  Новейшая биотехнология в сельском хозяйстве и пищевой промышленности

Вторая, после медицины, по значимости область применения новейшей биотехнологии – сельское хозяйство и пищевая промышленность. Биотехнология позволяет решать основные проблемы сельского хозяйства: повышения урожая, улучшения качества продукции, снижения цены и минимизации негативного воздействия на окружающую среду. Ученые пришли к выводу, что если мы хотим преодолеть проблему голода, но при этом жить рядом с лесами, полными птиц, и чистыми реками, изобилующими рыбой, то необходимо вводить альтернативные методы ведения сельского хозяйства, основанные на широком применении биотехнологии.

Однако доходы в этой области были ниже, чем в биофармацевтике, риск, особенно связанный с преодолением негативного общественного мнения, очень высок, что делало эту отрасль менее привлекательной для инвесторов. Так, в первой половине 90-х годов лишь 2% всего венчурного капитала, привлеченного в биотехнологию, вкладывалось в сельскохозяйственные проекты. Если лекарствами и вакцинами в 1994 году занималось 289 биотехнологических фирм, то сельским хозяйством и пищевой промышленностью – 74, из них частных фирм (без государственных дотаций) – 50. Поэтому прогресс в этой области шел медленнее, чем в медицине. Первые крупные успехи середины 90-х годов и обострение конкуренции на фармакологическом рынке изменяют ситуацию.

В различных отраслях сельского хозяйства применяются продукты, полученные с помощью рекомбинантных микроорганизмов и клеточных культур.

Одна из традиционных отраслей широкого применения биотехнологии – ветеринария, антибиотики и вакцины применяются здесь давно. Однако болезни сельскохозяйственных животных – по-прежнему серьезнейшая проблема, поэтому рынок для новейшей биотехнологии здесь велик. В ветеринарии применяются новейшие средства борьбы с болезнями животных, аналогичные применяемым в медицине. Так разработаны средства диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, заражения животных паразитами, беременности животных [[65]] , противовирусные вакцины (от вируса герпеса свиней и т. д.), создана (в 1989г.) и поступила на рынок первая рекомбинантная вакцина против паразитов - гельминтов овец [[66]], для иммунизации животных и борьбы с вирусными инфекциями применяют интерфероны, интерлейкины [31].

Первым продуктом, полученным с помощью рДНК для широкого применения в неветеринарных целях, был гормон роста (соматотропин) крупного рогатого скота (BST). Еще 50 лет назад было показано, что введение коровам этого гормона увеличивает надои молока. В начале 1980-х годов в США фирма Monsanto разработала технологию получения гормона с помощью рекомбинантных микроорганизмов. Продукт был подвергнут тщательным испытаниям, показавшим его эффективность (увеличение надоев на%), безопасность для животных и людей. Тем не менее он вызвал ожесточенные споры и только в конце 1993 фирма получила разрешение на его продажу, в феврале 1994 года он поступил на рынки (задержка на 90 дней была вызвана решением Сената США). Дискуссии вокруг этого гормона не утихли до сих пор, как и вокруг аналогичного гормона для увеличения производительности свиноводства - повышения прироста свиней и снижения жирности мяса. Мы тоже не уверены в безопасности этих продуктов.

Главное возражение против применения соматотропина - его гормональная природа. Поэтому бесспорный интерес представляет метод, предложенный ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии (Москва), основанный на использовании ТЕЛПНВЙОБОФОЩИ БОФЙУПНБФПУФБФЙОПЧЩИ ВЕМЛПЧ (був) негормональной природы. йОЯЕЛГЙС був УЕМШУЛПИПЪСКУФЧЕООЩН ЦЙЧПФОЩН (УЧЙОШЙ, ВЩЮЛЙ ОБ ПФЛПТНЕ) ЧЩЪЩЧБЕФ ПВТБЪПЧБОЙЕ БОФЙФЕМ Л УПНБФПУФБФЙОХ, СЧМСАЭЕНХУС РТЙТПДОЩН ЙОЗЙВЙФПТПН ТСДБ ЗПТНПОПЧ Й ЖЕТНЕОФПЧ, ПРТЕДЕМСАЭЙИ ТПУФПЧПК РПФЕОГЙБМ Й РТПДХЛФЙЧОПУФШ ЦЙЧПФОЩИ. ч ТЕЪХМШФБФЕ ФБЛПК ЙННХОПЛПТТЕЛГЙЙ УПНБФПУФБФЙОБ НСУОБС Й НПМПЮОБС РТПДХЛФЙЧОПУФШ ХЧЕМЙЮЙЧБМБУШ ОБ 15-20% ВЕЪ ДПРПМОЙФЕМШОПЗП ТБУИПДБ ЛПТНПЧ, как и при применении гормонов, предполагаемая стоимость - в 5 раз ниже.

Продукты биотехнологии представляют реальную альтернативу химизации сельского растениеводства. Широкое применение различных химикатов в сельском хозяйстве (удобрения, гербициды, пестициды), субсидировавшееся всеми странами после второй мировой войны, и казавшееся в середине XX века решением всех проблем, оказалась не столь эффективным и, главное, – значительно более опасным, чем ожидалось. У видов-мишеней гербицидов и пестицидов (сорняков, вредителей) быстро развивалась устойчивость, потери урожая продолжались, количество применяемых препаратов росло. Избыток химических удобрений вредил микрофлоре почвы, плохо усваивался растениями, не в лучшую сторону меняя их химический состав и питательную ценность. В 60-х годах специалистам стал очевиден огромный и глобальный вред окружающей среде и человеку, наносимый химизацией растениеводства, были опубликованы данные о страшных экологических последствиях, затронувших всю планету, о вреде для здоровья человека, воздействии на наследственность и здоровье будущих поколений [[67]].Так, в свое время ДДТ был обнаружен даже в Арктике в молоке белой медведицы. Особую озабоченность вызывало и вызывает то, что многие из химикатов почти не разлагаются в природных условиях, накапливаясь в пищевых цепочках, почве, воде и т. д. Применение пестицидов по последствия сравнивалось со взрывом атомной бомбы, незамеченным человечеством. Как писала про все новые химические вещества (не только сельскохозяйственного назначения) Ш. Ауэрбах (один из открывателей химического мутагенеза), “вполне возможно, что общий эффект этих веществ, действующих порознь или вместе, может представлять значительно большую генетичекую опасность, чем ионизирующая радиация” - следствие ядерных испытаний. [[68], с.442]. Химические компании, получавшие от продажи этих средств миллиарды долларов, вели активную и успешную защиту своих интересов. В нашей стране производством химических препаратов для сельского хозяйства занимался военно-промышленный комплекс (вместе с химическим оружием, которым многие из них и являются), и все данные о негативных последствиях засекречивались [[69]], химизация сельского хозяйства была провозглашена важнейшей задачей. С конца 1970-х годов исследования отрицательного влияния химизации сельского хозяйства привлекли внимание общественности. Постепенно наиболее опасные препараты (например ДДТ) были запрещены во всем мире, им на смену приходили новые, более совершенные продукты химической промышленности. Трагедия 1984 года в Бхопале окончательно подтвердила потенциальную опасность химических пестицидов. Достоянием общественности стало и серьезное отрицательное воздействие на здоровье людей гербицидов (дефолиантов и пр.), применявшихся в военных целях США во Вьетнаме. Сейчас намечается перелом. Принимаются международные меры по ограничению распространения химических пестицидов и гербицидов. Усилилось экономическое давление на их производителей и потребителей путем налогов и штрафов.

Традиционная биотехнология создавала эффективные средства интенсификации растениеводства. Для улучшения снабжения почвы азотом в нее с конца XIX века вносили препарат нитрагин – клубеньковые бактерии, живущие в симбиозе с бобовыми растениям, тогда же стали применять свободноживущий азотфиксатор азотобактер.

Большие надежды возлагаются на биопестициды, которые из-за избирательности своего действия и биодеградабельности значительно безопаснее химических, к тому же к ним реже развивается резистентность. Наиболее распространенный биопестицид в традиционной биотехнологии – Bacillus thuringiensis (BT). Эта почвенная бацилла производит протеин, токсичный для многих вредителей, особенно листогрызущих. Специально селекционированные штаммы этой бактерии производятся для использования в качестве пестицида. Их применяют на плантациях для борьбы с колорадским жуком и другими насекомыми (более 100 видов). Для борьбы с вредителями и инфекционными заболеваниями растений применяются также другие микроорганизмы (бактерии, грибы, вирусы и т. д.), и продукты, получаемые с их помощью (антибиотики и пр.), а также хищные насекомые. Однако до сравнительно недавнего времени сложность производства большинства биопестицидов (их надо разрабатывать для каждого вида и биоценоза отдельно) делала их неконкурентоспособными, а их главное достоинство – биодеградабельность - рассматривалось на практике как недостаток - нестойкость, ведущая к сложности применения (например BT перестает действовать через два – три дня). На биопестициды выделялось мало средств, переход на них требовал времени, так как они не применимы при условии вторжения пестицидов в биоценозы. Набор их на рынке был очень ограничен и к 1988 году они составляли всего 0,5% всего рынка пестицидов, причем более 90% из них – один штамм BT, эффективный против ограниченного количества вредителей.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10