Hoe Correcties de Fluorescentiegegevens Beïnvloeden: Een Diepere Kijk op Emissie- en Excitatiespectra

Het verkrijgen van een gecorrigeerd emissiespectrum begint met het verkrijgen van het emissiespectrum met een gepolariseerde filter, georiënteerd in de verticale richting (parallel aan de verticale as van het laboratorium), en dit filter in de lichtpad van de emissie in te voegen. Dit emissiespectrum vertoont een kleine verhoging rond de 507 nm, wat bekendstaat als de Wood-anomalie, zoals eerder besproken in Hoofdstuk 3. Deze anomalie houdt in dat bij deze golflengte een deel van de horizontaal gepolariseerde emissiecomponent verloren gaat. Voordat correctiefactoren worden toegepast, is het handig om deze Wood-anomalie te verwijderen. Zoals eerder uitgelegd, kan dit eenvoudig worden gedaan door de emissie door een gepolariseerd filter te bekijken dat uitsluitend verticaal gepolariseerd licht doorlaat.

Als reviewer van manuscripten geef ik er de voorkeur aan als auteurs een ongecorrigeerd spectrum indienen, mits ze vermelden dat het om een technisch spectrum gaat en aangeven welk instrument is gebruikt. Met de moderne fotodetectoren die gevoelig zijn voor rood licht, is het verschil tussen een ongecorrigeerd (of technisch) emissiespectrum en het gecorrigeerde (of moleculaire) emissiespectrum vaak niet groot. Als men echter het spectrum gebruikt om andere parameters te berekenen, zoals de kwantumopbrengst of de Förster-overlappingsintegralen (waarop we later terugkomen), is het noodzakelijk om gecorrigeerde spectra te gebruiken. Bij spectrumsystemen die het mogelijk maken om in real-time een gecorrigeerd spectrum te genereren, zou men kunnen vragen waarom men niet altijd in die modus zou moeten werken. Toch is het altijd beter om met de ruwe (ongecorrigeerde) gegevens te werken. Dit maakt het mogelijk de aard en de omvang van de aangebrachte correcties te begrijpen.

De spectrale massa-centrumbenadering, gedefinieerd door de formule <νg> = ∑ i Fi / ∑ Fi, biedt een meer precieze en reproduceerbare manier om spectrale verschuivingen te meten. Hierbij wordt de emissie gemeten bij verschillende golflengten (νi) en gewogen door de intensiteit van het signaal (Fi) bij elke golflengte. Dit stelt onderzoekers in staat om de verschuivingen in de spectrale distributie nauwkeurig te volgen, zoals het geval is bij het bestuderen van de dissociatie van tryptofaan-synthase dimers bij verhoogde druk, wat resulteert in een verschuiving naar lagere golflengten in de intrinsieke fluorescente eigenschappen van het eiwit. Het massacentrum van het spectrum kan een krachtig hulpmiddel zijn voor het kwantificeren van dergelijke verschuivingen en het nauwkeurig volgen van dynamische biologische processen.

Naast deze technische correcties is het belangrijk te begrijpen dat de kalibratie van het spectrofluorimeterinstrument en de keuzes in de configuratie van het systeem de uiteindelijke resultaten kunnen beïnvloeden. Dit benadrukt de noodzaak om de methodologie van spectrale metingen nauwkeurig te beschrijven bij publicaties, zodat de herhaalbaarheid van de resultaten wordt gewaarborgd. Zonder correcties kunnen de gegevens misleidend zijn, vooral wanneer kwantitatieve parameters zoals quantumopbrengst of Förster-overlap worden berekend.

Hoe Lignum nephriticum de geschiedenis van fluorescentie beïnvloedde

Het hout van Lignum nephriticum werd in de 16e en 17e eeuw in Europa zeer gewaardeerd vanwege zijn medicinale eigenschappen, vooral bij de behandeling van nierziekten. Het hout verdween echter in de daaropvolgende eeuwen uit de Europese markten en de botanische identiteit ervan raakte verloren in een verwarring van verschillende soorten. Interessant genoeg is dit hout nog steeds verkrijgbaar op straatmarkten in Mexico, waar het nog steeds medisch wordt gebruikt.

In 1915 slaagde W.E. Safford erin om de botanische puzzel op te lossen en identificeerde hij de soort die het Lignum nephriticum-hout voortbrengt als Eynsemhardtia polystachia. Hij schreef hierover een fascinerend manuscript getiteld “Lignum Nephriticum – Its History and an Account of the Remarkable Fluorescence of the Infusion” (Smithsonian Institute Annual Report—1915). In 1982 werden er verschillende sterk fluorescerende glucosyl-hydroxychalconen geïsoleerd uit deze plant. Studies van A. Ulises Acuña en zijn collega’s in Madrid in 2009 (zie aanvullende literatuur) toonden aan dat de oorspronkelijke blauwe tint die door de Azteken werd waargenomen, het resultaat was van de conversie van coatline B, onder licht alkalische omstandigheden, naar een sterk blauw-emitterende verbinding, matlaline (afgeleid van "matlali", het Azteekse woord voor blauw), met een emissiemaximum bij ongeveer 466 nm en een kwantumopbrengst dicht bij 1. Dit betekent dat vrijwel elke geabsorbeerde foton resulteert in een fluorescerende foton. De structuur van deze oorspronkelijke fluorofore verbinding is te zien in Figuur 1.2, terwijl Figuur 1.3 een illustratie biedt van de verbluffende fluorescentie ervan.

Isaac Newton experimenteerde ook met Lignum nephriticum en maakte opmerkingen over de kleuren die het in oplossingen produceerde. Robert Boyle werd geïnspireerd door het rapport van Monardes en onderzocht het systeem grondiger. In een belangrijke publicatie aan de Royal Society in 1664, getiteld Experiments and Considerations Touching Colours: First Occasionally Written to a Friend and Now Suffer’d to Come Abroad as the Beginning of an Experimental History of Colours, besprak Boyle hoe het hout na meerdere infusies zijn vermogen verloor om kleur aan het water te geven. Hij concludeerde dat er een “essentieel zout” in het hout aanwezig was dat verantwoordelijk was voor dit effect. Ook ontdekte hij dat de toevoeging van een zuur de kleur verwoestte en de toevoeging van een base de kleur weer herstelde. Op deze manier kon Boyle de sterkte van een zuur of base bepalen door te berekenen hoeveel van de oplossing nodig was om de blauwe kleur te verwijderen of te herstellen. Boyle wordt hiermee vaak gezien als de eerste die fluorescentie gebruikte als pH-indicator.

In 1833 beschreef David Brewster het zenden van een witte lichtstraal door een alcoholoplossing van bladeren en het waarnemen van een rode straal vanaf de zijkant – wat we nu weten als de fluorescentie van chlorofyl. Hoe weinig hij zich waarschijnlijk had kunnen voorstellen dat op een dag kunstmatige satellieten de aarde zouden omcirkelen om wereldwijd de chlorofylproductie te monitoren, zoals te zien is in de afbeelding van de satellietwaarnemingen van chlorofylconcentraties in zowel land als oceanen.

De titel “Vader van Fluorescentie” wordt echter met recht bewaard voor George Gabriel Stokes, een van de grootste natuurkundigen van de 19e eeuw. In 1853 publiceerde Stokes zijn werk On the Change of Refrangibility of Light, waarin hij stelde dat de "epipolische dispersie" van kinine sulfaat, zoals beschreven door Herschel, niet te maken had met de reflectie of breking van licht, maar met de absorptie van licht gevolgd door de emissie van een andere kleur. Dit leidde tot de ontdekking van de Stokes-shift, het verschuiven van de golflengte van het uitgezonden licht ten opzichte van het geabsorbeerde licht. Stokes gebruikte de term “fluorescentie” afgeleid van het mineraal fluorspar, wat de basis werd voor de wetenschappelijke naamgeving van het fenomeen.

De geschiedenis van fluorescentie is diep verweven met deze ontdekkingen, die in veel opzichten de basis legden voor talrijke moderne toepassingen, van medische technologieën tot satellietobservaties van chlorofyl. Wat belangrijk is om te begrijpen, is dat fluorescentie niet zomaar een optisch verschijnsel is; het is een krachtig hulpmiddel geworden in de wetenschap en technologie. De ontdekking van het matlaline in Lignum nephriticum is slechts een van de vele mijlpalen in de langzame evolutie van onze kennis over licht en de manier waarop we het kunnen manipuleren voor praktische doeleinden.

Hoe Fluorescentieprobes de Fysieke en Chemische Condities van Biologische Systemen Onderzoeken

In biologische systemen kunnen intrinsieke fluoroforen, dat wil zeggen moleculen die van nature fluoresceren, een belangrijke rol spelen. De meest bekende van deze zijn co-enzymen zoals NADH, FAD, en FMN, evenals sommige porfyrines zoals chlorofyl, en proteïnen. Dit soort fluorescentie is van belang, omdat het ons in staat stelt om te kijken naar specifieke moleculaire veranderingen zonder dat we een extra chemische markering hoeven toe te voegen. Bijvoorbeeld, eiwitten zoals collageen en elastine vertonen fluorescence, waarbij de tyrosineresiduen van het collageen een belangrijke bijdrage leveren aan de emissie. Het is interessant om te weten dat het fluoresceren van collageen kan veranderen door veroudering of ziekten zoals diabetes, die de cross-linking van collageen bevorderen, wat resulteert in een verhoogde fluorescentie.

Naast intrinsieke fluoroforen zijn er ook extrinsieke fluoroforen die niet van nature in biologische systemen voorkomen, maar die essentieel zijn voor het specifieke labelen en traceren van moleculen van interesse. Deze fluoroforen worden vaak gebruikt in experimenten waarbij het van belang is om een specifiek molecuul of proces te markeren. Typisch worden ze gekoppeld aan antilichamen, en het gebruik van gelabelde antilichamen biedt wetenschappers de mogelijkheid om doelwitten met hoge precisie te detecteren. De fluoroforen die hiervoor gebruikt worden, kunnen variëren van xanthene- en naftaleen-afgeleiden tot complexere structuren zoals cyaninen.

De keuze van de fluorofore is niet alleen afhankelijk van de sterkte van de emissie, maar ook van de omgeving waarin de fluorescentie moet plaatsvinden. Dit betekent dat het type fluorescentiemolecuul zorgvuldig gekozen moet worden om de fysische of chemische omstandigheden van de biologie te weerspiegelen. Een voorbeeld van dit fenomeen is de gebruik van lipidenoplosbare probes die specifiek reageren op veranderingen in de toestand van lipidemembranen. Dit soort probes kunnen inzicht geven in de dynamiek van membranen, wat cruciaal is voor het begrijpen van bijvoorbeeld celmembraansignalering en de vorming van membranen.

Fluorescentie is dus niet slechts een techniek voor visuele observatie, maar een diepgaand hulpmiddel voor het verkrijgen van inzicht in moleculaire interacties, dynamiek en fysiologische veranderingen. Dit vereist dat onderzoekers niet alleen begrijpen welke fluoroforen beschikbaar zijn, maar ook hoe ze deze op de juiste manier kunnen inzetten om specifieke biologische processen te onderzoeken. Bovendien moeten onderzoekers zich bewust zijn van de mogelijke interferentie van autofluorescentie van bepaalde cellulaire componenten, zoals lignine in plantencellen, die de interpretatie van resultaten kan beïnvloeden.

In deze context is het essentieel dat onderzoekers aandacht besteden aan de absorptie- en emissiespectra van fluoroforen, evenals hun fotostabiliteit en kwenchingsgedrag, aangezien deze factoren de kwaliteit en betrouwbaarheid van de gegevens kunnen beïnvloeden. Fluorescentie is een krachtig gereedschap, maar zoals bij elke technologie vereist het een grondige kennis van de principes en de eigenschappen van de gebruikte materialen.