Hoe wordt de levensduur van fluorescentie bepaald door fase- en modulatieanalyse?

De studie van de fluorescentielevensduur maakt gebruik van verschillende benaderingen voor het analyseren van de tijdsafhankelijke emissie van fluoroforen. Bij de analyse van de fluorescencelevensduur spelen de zogenaamde fase- en modulatieanalyse een cruciale rol. Deze methoden zijn gebaseerd op het meten van de faseverschuiving en de relatieve modulatie van de fluorescentie-emissie ten opzichte van de excitatiesignalen, die op hun beurt helpen om de levensduur van de excitatie te karakteriseren.

De faseverschuiving (Φ) tussen de excitatie en de emissie wordt uitgedrukt als een functie van de karakteristieke tijdsconstante van de fluoroforen, oftewel de levensduur (τ). De faseverschuiving kan worden bepaald door de relatie tanΦ = ωτ, waarbij ω de frequentie van de excitatie is en τ de levensduur van de fluorescerende moleculen. Dit betekent dat de levensduur van de fluoroforen direct wordt beïnvloed door de modulatiefrequentie van het excitatiesignaal, en het meten van de faseverschuiving biedt waardevolle informatie over de dynamica van het emissieproces.

Bij modulatieanalyse wordt de relatieve modulatie (M) van de emissie gemeten als de verhouding tussen de wisselstroomcomponenten (AC) en de gelijkstroomcomponenten (DC). Dit geeft inzicht in de intensiteit van de fluorescente emissie in relatie tot de frequentie van de excitatie. De verhouding van deze componenten kan verder worden gekarakteriseerd door de formules die de relatieve modulatie van de emissie (M) beschrijven. De gemeten modulatie wordt in verband gebracht met de levensduur via een enkele exponentiële vervalrelatie, die ook informatie verschaft over de complexiteit van het emissieproces van de fluoroforen.

In gevallen van multiexponentieel verval, waarbij de fluorescente moleculen verschillende emissie-eigenschappen vertonen, is de levensduur van de fase (τP) altijd korter dan de levensduur van de modulatie (τM). Dit verschil is te verklaren door het feit dat bij hogere modulatiefrequenties de levensduur van de fase en de modulatie afnemen, wat leidt tot een verzwakking van de gemeten modulatie in de emissie. Bij een enkel-exponentieel verval, echter, zijn de levensduur van fase en modulatie gelijk.

Het analyseren van de data met behulp van fase- en modulatieanalyse maakt het mogelijk om de heterogeniteit van de levensduur te onderzoeken. Dit houdt in dat verschillende componenten van de levensduur, zoals de relatieve bijdragen van verschillende fluoroforen, kunnen worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Wanneer bijvoorbeeld een mengsel van fluoroforen met verschillende levensduurwaarden wordt gemeten, is het van belang de fractionele bijdrage (f) van elke component correct te berekenen, aangezien dit helpt bij het bepalen van de relatieve concentratie van de fluoroforen met verschillende levensduren.

De uitvoering van een gedetailleerde levensduuranalyse, zoals het voorbeeld waarin twee fluoroforen met verschillende levensduurwaarden worden gemeten, biedt inzicht in hoe de totale intensiteit zich verdeelt over de verschillende componenten van het systeem. De verhouding van de pre-exponentiële factoren van de componenten (f) helpt bij het vaststellen van de relatieve concentraties van de fluoroforen. Dit is van groot belang voor toepassingen in de biologie en scheikunde, waar het kwantificeren van fluoroforverhouding cruciaal is voor het begrijpen van moleculaire interacties.

Bij gebruik van fasemethoden kan de levensduur van fluorescerende moleculen niet alleen kwantitatief worden bepaald, maar kunnen ook complexere systemen met meerdere componenten worden geanalyseerd. Dit wordt vaak bereikt door het gebruik van zowel discrete exponentiële modellen als distributiemodellen, die kunnen variëren afhankelijk van de aard van de fluorescentiedecay van de onderzochte moleculen. Het toepassen van verschillende analysemodellen vereist echter vaak meer gedetailleerde informatie over het systeem, zoals spectroscopische gegevens, chemische eigenschappen, of andere experimentele waarnemingen die de keuze voor het juiste model ondersteunen.

Het is belangrijk om te begrijpen dat de keuze tussen een discrete of distributiemodel voor de levensduuranalyse afhangt van de precisie van de meetgegevens en de aard van het systeem. Een goede aanpassing van het model aan de experimentele data wordt vaak beoordeeld door de chi-kwadraatwaarde (χ²). Bij een perfecte aanpassing zou deze waarde dicht bij 1 liggen, wat duidt op een goed model. In geval van meerdere mogelijke modellen kan het soms lastig zijn om te bepalen welk model het beste de onderliggende fotofysica van het systeem beschrijft, waarbij aanvullende gegevens uit andere bronnen cruciaal kunnen zijn om tot de juiste conclusie te komen.

Naast de klassieke methoden van levensduuranalyse, wordt de Maximum Entropy Method (MEM) steeds vaker toegepast. Dit is een benadering waarbij geen voorafgaande aannames worden gedaan over het vervalmodel, maar waarin wordt gewerkt met een probabilistische benadering van de gegevens. Deze methode is nuttig voor systemen waar de fluorescente eigenschappen complexer zijn en meer componenten bevatten dan met traditionele methoden te analyseren zijn.

Hoe Organellen-specifieke Probes en Fluorescente Antilichamen Wetenschappelijke Ontdekkingen Versnellen

In de biochemie en celbiologie worden fluoroforen steeds vaker gebruikt als hulpmiddelen om specifieke moleculen of organellen in levende cellen te markeren en visualiseren. Fluorescente probes bieden onderzoekers de mogelijkheid om dynamische biologische processen in real-time te volgen. Binnen dit domein worden verschillende types probes ontwikkeld, waarvan de organellen-specifieke probes en fluorescente antilichamen belangrijke toepassingen vinden in onderzoek naar celstructuren en -functies.

Een van de veelgebruikte technieken voor het labelen van biologisch materiaal met fluoroforen is het aanbrengen van een fluorofore groep op een antilichaam. In dit proces wordt een fluorofore groep covalent gebonden aan een van de aminozuurresiduen van het antilichaam, meestal lysine of cysteïne. Het aanbrengen van fluoroforen op antilichamen werd voor het eerst gedaan door Albert Coons en zijn team, die de techniek ontwikkelden om antilichamen te labelen met een fluorofore molecuul, wat het visueel volgen van specifieke antigenen in cellen mogelijk maakte. Tegenwoordig worden fluorescente antilichamen, vaak met fluoroforen zoals fluoresceïne of rhodamine, commercieel verkocht. Er zijn echter ook antilichamen met andere fluoroforen, zoals de Alexa, Atto, of DyLight series, die de wetenschappelijke gemeenschap in staat stellen om de veelzijdigheid van fluorescentiemethoden te vergroten.

Hoewel veel onderzoekers fluorescente antilichamen direct kopen, is het essentieel om de functionele eigenschappen van het gelabelde antilichaam te karakteriseren voordat het in experimenten wordt gebruikt. Dit geldt ook voor de toepassing van fluorescentie-antibiotica in technieken zoals fluorescentie-microscopie en flowcytometrie, die beide belangrijke methoden zijn in het bestuderen van cellulaire structuren en het identificeren van cellulaire populaties op basis van hun antigenen.

Naast fluorescentie-antilichamen worden ook diverse fluorogene substraten gebruikt, die zelf niet fluorescerend zijn, maar die na enzymatische omzetting fluorescentie vertonen. Voorbeelden van dergelijke fluorogene substraten zijn fluorescamine en phthalaldehyde, die uitmuntende toepassingen vinden in enzymatische assays. Deze fluorogene substraten kunnen worden gebruikt in een breed scala van tests, zoals het meten van fosfatase-activiteit in hoogdoorvoerscreening. Fluorescerende producten die ontstaan uit fluorogene substraten zijn bijzonder nuttig voor het detecteren van enzymatische reacties in biologische monsters.

Quantumdots (QDs), nanokristallen van halfgeleiders, vormen een andere klasse van fluoroforen die een breed scala aan toepassingen vinden in biomedisch onderzoek. Quantumdots hebben een uitzonderlijk hoge fotostabiliteit, een breed absorptiespectrum en een groot kwantumefficiëntie, wat hen uiterst geschikt maakt voor toepassingen in biologische beeldvorming. De absorptie- en emissiewaarden van quantumdots kunnen worden aangepast door de grootte van de nanokristallen te variëren, een fenomeen dat bekendstaat als kwantumgolfbeperkingen. Dit maakt het mogelijk om quantumdots te "tunen" voor specifieke experimenten, wat hun flexibiliteit en toepassingsgebied enorm vergroot. Ondanks de aanzienlijke voordelen van quantumdots, blijft de toxiciteit van sommige halfgeleidermaterialen, zoals cadmium, een zorg. In recente jaren is er dan ook een verschuiving richting meer biocompatibele materialen, zoals koolstof quantumdots (CQDs).

Een ander veelbelovend type fluorescerende probe is de nanodiamant. Hoewel nanodiamanten nog niet zo wijdverspreid gebruikt worden als quantumdots, vinden ze steeds vaker toepassing in de levenswetenschappen. De fluorescentie van nanodiamanten komt voort uit defecten in het kristallijne rooster, met name het stikstof-vacature (NV)-defect, dat verantwoordelijk is voor rode of nabij-infrarood fluorescentie. Het grote voordeel van nanodiamanten ten opzichte van quantumdots is dat nanodiamanten van nature niet-toxisch en biologisch inert zijn, wat hen tot een uitstekende keuze maakt voor in vivo toepassingen. Daarnaast zijn ze uitzonderlijk fotostabiel en kunnen ze worden gebruikt voor superresolutiebeeldvorming, een techniek die de grenzen van conventionele microscopie verlegt.

De toepassing van optische bleekmiddelen in de biomedische wetenschap is eveneens significant. Deze fluoroforen absorberen licht in het nabij-UV-gebied en emitten fluorescerend licht in de blauwe regio van het spectrum. Het gebruik van optische bleekmiddelen is vooral handig voor het markeren van biologische monsters die niet veel intrinsieke fluorescentie vertonen, zoals in de geval van bepaalde eiwitten of andere celstructuren.

Fluorescerende probes, of ze nu gebaseerd zijn op antilichamen, fluorogene substraten, quantumdots, nanodiamanten, of optische bleekmiddelen, bieden wetenschappers krachtige tools voor het visualiseren en bestuderen van biologische processen op moleculair niveau. Elke techniek heeft zijn eigen voor- en nadelen, maar de keuze van de probe is vaak afhankelijk van het specifieke onderzoeksdoel, de biologische systemen die bestudeerd worden, en de gewenste gevoeligheid en resolutie van de beelden.

Naast de technische en wetenschappelijke voordelen van deze fluorescentieprobes, is het van belang te begrijpen dat de keuze voor een probe zorgvuldig moet worden afgewogen op basis van de compatibiliteit met het biologische systeem dat wordt onderzocht. Er zijn verschillende factoren die de keuze beïnvloeden, zoals de fotostabiliteit van de probe, de mogelijkheid om deze met andere biomoleculen te conjugeren, en de toxiciteit voor levende cellen. Verder moeten onderzoekers zich bewust zijn van de mogelijke effecten van de probe op het biologische systeem zelf, aangezien sommige probes interacties kunnen aangaan met cellulaire componenten, wat de uitkomsten van het experiment kan beïnvloeden.

Hoe Absorberen Moleculen Licht?

Volgens de kwantumtheorie wordt stralingsenergie alleen in discrete hoeveelheden of quanta geabsorbeerd of uitgezonden, die in het geval van licht fotonen worden genoemd (de term "lichtquanta" werd in 1905 door Einstein geïntroduceerd). Interessant genoeg werd de term 'foton' bedacht door de Amerikaanse chemicus Gilbert N. Lewis in 1926. De energie, e, van een foton is gerelateerd aan de golffrequentie via de relatie van Planck:

$e = h \nu = \frac{h c}{\lambda}$

waarbij h de constante van Planck is, gelijk aan $6,62 \times 10^{ -27} \, \text{ergs sec}$. In fotochemische en andere toepassingen is het vaak handig om de energie te berekenen die door één mol fotonen wordt gedragen, zodat de veranderingen in energie die optreden bij absorptie en emissie kunnen worden gekoppeld aan de energie-inhoud per mol van de stof die verantwoordelijk is voor de absorptie of emissie. De 'Einstein' (E) wordt gedefinieerd als de energie in één mol fotonen:

$E = \frac{28,6 \, \text{kcal}}{\lambda}$

waarbij $N$ het getal van Avogadro is (6,023 x 10^23). Als de Einstein wordt uitgedrukt in kilocalorieën (kcal) en de golflengte van het licht in microns, dan komt voor het midden van het zichtbare spectrum $\lambda = 0,5 \mu$ (500 nm) en $E = 57,2 \, \text{kcal}$ of 2,48 eV.

Mensen kunnen een bereik van golflengtes waarnemen van ongeveer 380 nm tot 720 nm, het zogenaamde zichtbare bereik. Dit bereik is specifiek voor de menselijke waarneming, maar andere diersoorten hebben gevoeligheden die zich uitstrekken tot buiten dit bereik. De lens van het menselijk oog absorbeert licht onder ongeveer 400 nm (UV-straling onder de 295 nm wordt geblokkeerd door het hoornvlies), maar veel dieren hebben lenzen die geen licht in het nabije UV absorberen, waardoor zij lagere golflengten kunnen waarnemen dan mensen. Er is een interessant voorbeeld uit mijn eigen ervaring: ik was in het laboratorium en bekeek een verstrooiingsoplossing in een cuvet. Toen Gregorio Weber binnenkwam, vertelde hij me dat hij verder in het UV kon zien dan ik. Hij verlaagde de golflengte en meldde dat hij nog licht kon zien, terwijl ik dat niet kon bij ongeveer 360 nm. Hij legde uit dat zijn ooglenzen waren verwijderd vanwege cataracten, waardoor lagere golflengten zijn netvlies konden bereiken. Hij geloofde dat hij eigenlijk de NADH-fluorescentie zag, opgewekt door die golflengte.

De kleuren die we waarnemen, komen voort uit de golflengtes die door een object worden geabsorbeerd; specifieker gezegd, uit de golflengtes die worden gereflecteerd en niet geabsorbeerd. Wanneer een object bijvoorbeeld blauw lijkt, betekent dit dat licht richting het rode deel van het spectrum wordt geabsorbeerd. Interessant genoeg zijn sommige van de briljante kleuren die we bij vogels, vlinders en bloemen zien, niet te danken aan de absorptie van licht, maar aan de reflectie van licht van nanostructuren die lagen vormen die kunnen leiden tot constructieve en destructieve interferentie. Dit fenomeen is bijvoorbeeld zichtbaar in olieachtige schilfers op water, waar we multicolor ringen kunnen waarnemen.

In Hawaï worden we vaak getrakteerd op regenbogen – zelfs dubbele regenbogen zijn geen zeldzaamheid. De observator die goed oplet, zal merken dat de kleuren van de tweede regenboog, die boven de primaire regenboog verschijnt, in volgorde omgekeerd zijn vanwege de extra reflectie binnen de regendruppel. De oorsprong van regenbogen werd al duizenden jaren bestudeerd. De Griekse filosoof Aristoteles stelde rond de 4e eeuw v.Chr. een verklaring voor regenbogen voor, waarbij hij de regendruppels als essentieel voor de vorming van de regenboog herkende en de onderliggende geometrie begreep. Zijn werk inspireerde vele studies in de middeleeuwen, met belangrijke bijdragen van Kamal al-Din al-Farisi en Theodoricus van Freiberg. In 1637 publiceerde René Descartes zijn invloedrijke werk "Discours de la Méthode", waarin hij een theorie over regenboogvorming voorstelde die dicht bij de moderne theorieën lag.

De absorptie en emissie van licht door atomen werd in 1916 door Albert Einstein verder onderzocht, waarbij hij de processen van geïnduceerde en gestimuleerde absorptie en emissie beschreef voor atomen in een stralingsveld. Einstein introduceerde verschillende coëfficiënten, waaronder de geïnduceerde absorptiecoëfficiënt (B12), de geïnduceerde emissiecoëfficiënt (B21) en de spontane emissiecoëfficiënt (A21). De uitleg van deze theorieën is uitgebreid en te vinden in meer gespecialiseerde literatuur.

In fluorescentiestudies richten we ons vooral op de absorptie van elektromagnetische energie met golflengtes tussen ongeveer 200 nm en 1000 nm. De quanta aan de hogere energiebereiken van dit spectrum (~200 nm) dragen voldoende energie om de absorberende molecule te dissociëren in radicalen, vaak gevolgd door onomkeerbare chemische reacties. Dit komt doordat de chemische bindingen van sommige moleculen, zoals de C-C binding, een energie van ongeveer 90 kcal/mol hebben, wat overeenkomt met een golflengte van 286 nm. Deze korte golflengten kunnen leiden tot instabiliteit van de stoffen die we bestuderen, iets wat minder probleematisch is bij langere golflengten. Het hogere golflengtebereik van de meeste studies is ongeveer 1000 nm, vanwege het zeldzame optreden van elektronische overgangen bij langere golflengten, en de sterke infraroodabsorptie van water, wat vooral problematisch is bij biologische moleculen.

Naast de absorptie van licht door moleculen, moeten we ook rekening houden met het feit dat het absorberen van licht niet altijd leidt tot emissie van licht. Moleculen kunnen licht absorberen en de energie vervolgens op verschillende manieren dissipereren, zoals door het genereren van warmte of via chemische reacties. Fluorescentie is maar een van de vele mogelijke manieren waarop geabsorbeerde energie kan worden afgegeven. Het begrijpen van deze processen is essentieel voor het ontwerp van experimenten en toepassingen in de spectroscopie, aangezien de emissie van licht kan worden gebruikt om gedetailleerde informatie over de moleculaire structuren en dynamieken van de onderzochte stoffen te verkrijgen.

Hoe het gebruik van fluorescence en polarisatie correct toe te passen in experimentele metingen?

Het gebruik van fluorescence-technieken biedt een ongeëvenaarde gevoeligheid voor het meten van de eigenschappen van moleculen. Dit wordt mogelijk gemaakt door de uiterst gevoelige fotonentellers die doorgaans in spectrofluorometers worden gebruikt. Echter, deze techniek is niet zonder problemen, vooral wanneer de signaalintensiteit hoog is. Een veelvoorkomend fenomeen dat hierbij kan optreden, is pulse pile-up, waarbij de elektronica de binnenkomende fotonen niet correct kan tellen als ze dicht op elkaar in de tijd aankomen. Dit gebeurt wanneer de fotonen te snel achter elkaar arriveren en de elektronica niet in staat is om alle signalen correct te registreren. Dit resulteert in een verlies van de verwachte lineariteit tussen de fotonen die binnenkomen en de meetresultaten.

Het is belangrijk om te begrijpen dat verschillende apparaten deze pulse pile-up-effecten bij verschillende tel-snelheden kunnen vertonen, afhankelijk van de technische specificaties, zoals de pulsbreedte van de meetapparatuur. Het is dan ook raadzaam om zowel informatie van de fabrikant in te winnen als eigen metingen te verrichten om te bepalen bij welke tel-snelheden deze effecten zich voordoen. Deze effecten kunnen niet alleen de spectra beïnvloeden, maar ook de metingen van polariteit en anisotropie verstoren. Een typische situatie is dat de polariteit of anisotropie van een monster lager wordt dan verwacht, omdat de pulse pile-up zich vaak voordoet in het kanaal dat de meeste tellingen ontvangt, meestal het parallelle emissiekanaal.

Een andere veelgemaakte fout bij eenvoudige fluorescentiemetingen is het rapporteren van veranderingen in de intensiteit bij een enkel golflengte tijdens experimenten zoals quenching of denaturatie van eiwitten. Dit kan problematisch zijn wanneer er verschuivingen plaatsvinden in de emissiemaxima van het monster tijdens de manipulatie. Dit verschijnsel leidt ertoe dat de gemeten intensiteiten niet representatief zijn voor de verandering in quantumopbrengst. Bovendien kan de polarisatie of anisotropie van de emissie ook worden beïnvloed door veranderingen in de levensduur van de fluoroforen of hun omgeving. Dergelijke veranderingen kunnen vervolgens een polarisatiebias introduceren in de gemeten intensiteiten. Dit gebeurt vooral wanneer slechts één van de twee perpendiculair gepolariseerde componenten van de emissie kan worden gedetecteerd.

Om dergelijke fouten te voorkomen, kunnen verschillende benaderingen worden toegepast. Een daarvan is het gebruik van verticale gepolariseerde licht voor het exciteren van het monster, waarbij de emissie zowel door verticale als horizontale polarisatoren wordt gedetecteerd. De som van de parallelle intensiteit en tweemaal de perpendiculaire intensiteiten geeft de totale emissie-intensiteit weer en verwijdert zo de polarisatiebias. Een alternatieve techniek is het gebruik van een "magisch hoek"-conditie bij het exciteren van het monster met parallel gepolariseerd licht en het waarnemen van de emissie door een polarisator ingesteld op 55°. Deze aanpak moet zowel voor als na de verstoring worden uitgevoerd.

Bij het berekenen van relatieve quantumopbrengsten moet men bovendien de fractie van de geabsorbeerde fotonen gebruiken, in plaats van de eenvoudige optische dichtheid (OD). Dit zorgt voor een accuratere bepaling van de quantumopbrengst en voorkomt vergissingen die voortkomen uit het negeren van de werkelijke fotonenabsorptie door het monster en de referentie-oplossingen.

Een ander probleem dat vaak wordt aangetroffen in de analyse van polarisatie- of anisotropiedata, is de verwarring tussen polariteit en anisotropie. Hoewel de basisinformatie van beide functies in wezen gelijk is, vereist het gebruik van de ene term in plaats van de andere bij bepaalde datamanipulaties nauwkeurigheid. Het behandelen van polariteitsgegevens als lineair optelbaar, zoals anisotropie, is een veelvoorkomende vergissing. Dit kan resulteren in verkeerde interpretaties van de meetresultaten. Om de achtergrond-polarisatie te corrigeren, moet de polarisatie van de achtergrond worden afgetrokken van de polarisatie van het monster, maar dit moet zorgvuldig gebeuren met dezelfde polarizerinstellingen.

Daarnaast wordt in FRET-berekeningen (Fluorescence Resonance Energy Transfer) vaak onterecht de waarde van 2/3 voor κ² gebruikt. Dit is niet altijd juist, hoewel het de eenvoudigste waarde is om te hanteren. In sommige gevallen, bijvoorbeeld wanneer zowel de donor als de acceptor kleine moleculen zijn, is deze waarde wellicht acceptabel. Maar bij grote moleculen, zoals fluorescentie-eiwitten zoals GFP, kan dit leiden tot onnauwkeurige resultaten.

Een ander veelvoorkomend probleem is de invloed van turbiditeit en verstrooiing op polarisatie- en anisotropiemetingen. Het meten van monsters die niet perfect helder zijn, kan twee tegenstrijdige effecten veroorzaken: enerzijds kan de polarisatie of anisotropie toenemen door parasitaire lichtstralen die het detectoroppervlak bereiken, anderzijds kan het ook afnemen door de verstrooiing van licht. Om deze problemen te detecteren, is het noodzakelijk om een passende achtergrondoplossing te gebruiken en te controleren op parasitair licht. Als er verstrooiing optreedt, kan de meting worden verfijnd door de padlengte van de cuvettes te variëren.

Ten slotte, wanneer filters worden gebruikt in vitro om fluorescentie te meten, is het van belang om te onthouden dat lange-pass filters niet altijd perfect zijn. Ze kunnen kleine hoeveelheden van het Rayleigh-verstrooide licht doorlaten, wat de metingen kan verstoren. Dit probleem kan deels worden opgelost door het gebruik van geschikte interferentie-filters die het verstrooide licht effectief blokkeren.