Wat is de rol van post-translationele modificaties in de eiwitfunctie en -structuur?

Post-translationele modificaties (PTMs) zijn chemische veranderingen die plaatsvinden op eiwitten nadat ze zijn gesynthetiseerd. Deze modificaties kunnen een breed scala aan effecten hebben op de structuur, activiteit, stabiliteit en lokalisatie van eiwitten. Ze zijn essentieel voor de juiste werking van eiwitten binnen de cel en beïnvloeden verschillende biologische processen, zoals signaaltransductie, celcyclusregulatie, metabolisme en apoptose. Hoewel het aantal bekende PTMs enorm is, zullen we hier enkele van de meest voorkomende en belangrijke modificaties bespreken, evenals hun functies en mechanismen.

Fosforylering is een andere belangrijke PTM die plaatsvindt op de hydroxylgroepen van serine (Ser), threonine (Thr) en tyrosine (Tyr) in eukaryoten, en op asparaginezuur (Asp), histidine (His) en lysine (Lys) in prokaryoten. Deze modificatie wordt uitgevoerd door kinasen die een fosfaatgroep van ATP aan het eiwit overdragen. Fosforylering heeft een grote invloed op de eiwitfunctie: het kan eiwitten activeren of inactiveren, wat resulteert in een moleculaire schakel die essentieel is voor de regulatie van tal van cellulaire processen. Fosforylering speelt een cruciale rol in signalering binnen de cel, bijvoorbeeld in de regulatie van de celcyclus en het metabolisme, en is betrokken bij de communicatie tussen cellen via signaleringspaden. Fosforylering kan ook de enzymatische activiteit van eiwitten beïnvloeden. Een bekend voorbeeld is glycogeenfosforylase, dat geactiveerd wordt door fosforylering en glucose uit glycogeen vrijmaakt.

Daarnaast speelt formylglycine (FGly), een gewijzigde serineresidu, een belangrijke rol in de enzymatische werking van sulfatases, die essentieel zijn voor de hydrolyse van sulfaatesters. Het ontbreken van FGly in deze enzymen leidt tot inactiviteit en veroorzaakt ernstige ziekten. Het proces van FGly-vorming illustreert hoe belangrijke modificaties de structuur en functie van enzymen beïnvloeden, wat van belang is voor zowel biologische als biotechnologische toepassingen.

De complexiteit van deze post-translationele modificaties toont aan hoe eiwitten kunnen worden gereguleerd en gepersonaliseerd in hun functie binnen de cel. In prokaryoten, zoals bacteriën, komen veel van deze modificaties niet voor, maar het is bekend dat bij recombinant geproduceerde eiwitten in bacteriën, zoals in E. coli, de afwezigheid van bepaalde post-translationele modificaties kan leiden tot instabiele of onoplosbare eiwitten. Dit maakt het moeilijk om eukaryotische eiwitten die post-translationeel gemodificeerd moeten worden, efficiënt in bacteriën te produceren.

Post-translationele modificaties hebben dus niet alleen invloed op de individuele functie van een eiwit, maar beïnvloeden ook de interacties tussen eiwitten en de cellulaire processen waarin ze betrokken zijn. Voor een volledig begrip van de moleculaire biologie is het van essentieel belang te begrijpen hoe PTMs werken, vooral gezien hun rol in ziekten en therapeutische toepassingen.

Hoe Fotoselectie en Fluorescentie Anisotropie de Veranderingen in Moleculaire Bindingen Kan Monitoren

Hoewel grote moleculen tijdens deze levensduur slechts weinig draaien, blijven hun overgangsdipolen vaak in dezelfde richting georiënteerd, en blijft de polarisatie van het uitgezonden licht gelijk aan die van het incidentele licht. Daarentegen roteren kleinere moleculen veel sneller, waardoor de oriëntatie van hun overgangsdipolen tijdens de fluorescentietijd wordt gerandomiseerd, wat resulteert in ongepolariseerd uitgezonden licht. Wanneer de rotatiesnelheid van een molecuul te laag is voor een volledige randomisatie van de oriëntatie van het fluorofor, zal het uitgezonden licht niet volledig gedepolariseerd zijn. In plaats daarvan zal het een component bevatten die parallel gepolariseerd is ten opzichte van de excitatiepolarisatie, en een andere die perpendiculair is. Dit fenomeen wordt anisotropie genoemd, en kan worden gemeten door middel van de polarisatie van het licht.

De veranderingen in anisotropie kunnen worden gebruikt om de dissociatieconstante van de binding tussen moleculen te bepalen. Dit gebeurt vaak door een fluorofoor te labelen met een klein molecuul en de binding van dit molecuul met een groter molecuul te titreren. Naarmate het complex zich vormt, neemt de anisotropie toe, wat kan worden geanalyseerd in een titratiecurve om de equilibrumssituatie en dissociatieconstante van de binding te berekenen. Dit proces wordt vaak gebruikt in experimenten die de bindingssterkte van interacties tussen biomoleculen bestuderen.

Wat betreft de instrumentatie, om fluorescence anisotropie te meten, is een standaard fluorimeter nodig die zowel excitatie- als emissie-polarisatoren bevat. De excitatiespolarisator selecteert de richting van de gepolariseerde lichtinval, terwijl de emissiepolarisator helpt bij het meten van de componenten van het uitgezonden licht die parallel en perpendiculair gepolariseerd zijn ten opzichte van het incidentele licht. Door de intensiteiten van deze componenten te meten, kan de anisotropie worden berekend, wat vervolgens nuttige informatie oplevert over de dynamica van moleculaire interacties en de mate van binding in een systeem.

Naast de meting van anisotropie in bindingsexperimenten, zijn er verschillende andere toepassingen van deze techniek. Anisotropie kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de mobiliteit van moleculen in vloeistoffen te bestuderen, wat essentieel is voor het begrijpen van diffusie- en viscositeitseigenschappen in biologische en chemische systemen. Bovendien biedt de techniek inzicht in de moleculaire dynamica van complexe systemen, zoals eiwit-proteïne-interacties of de beweging van moleculen binnen membranen.

Hoe de interne energie en enthalpie zich gedragen tijdens thermodynamische processen

Wanneer we een ideaal gas overwegen en uitsluitend expansiewerk toestaan, wordt de verandering in interne energie $dU$ beschreven door de vergelijking:

Voor isochore processen, waarbij het volume constant blijft (dV = 0), vereenvoudigt deze vergelijking zich tot:

waarbij de index $V$ de isochore omstandigheden aanduidt. Door onze beschouwingen te beperken tot veranderingen bij constant volume, hebben we de niet-toestandfunctie, de warmte $q$, omgezet in een toestandfunctie, de interne energie $U$ (onder specifieke omstandigheden, zoals voor isochore processen). Voor processen bij constant volume is de verandering in interne energie dus gelijk aan de hoeveelheid uitgewisselde warmte. Deze warmte beïnvloedt de temperatuur van het systeem.

De interne energie $U$ is een nuttige toestandfunctie voor processen bij constant volume, waarbij het gelijk is aan de uitgewisselde warmte. Biologische processen vinden typisch plaats bij constant druk, niet bij constant volume, maar we zullen in de volgende sectie zien dat we de principes die we hebben geleerd uit beschouwingen over de interne energie rechtstreeks kunnen toepassen op isobare processen.

Nu kunnen we de verandering in de interne energie van een systeem berekenen tijdens een proces bij constant volume, rekening houdend met de verandering in temperatuur en warmtecapaciteit.

De Enthalpie $H$

Nu definiëren we een nieuwe toestandfunctie, de enthalpie $H$, die als volgt is gedefinieerd:

De volledige differentiële van $H$ geeft ons:

Als we nu vergelijking 1.57 vergelijken met deze vergelijking, zien we dat de rechterhanden gelijk zijn, wat betekent dat de verandering in enthalpie gelijk is aan de warmte die wordt uitgewisseld bij constante druk:

De enthalpie $H$ bij constante druk is dus een equivalente toestandfunctie voor de interne energie $U$ bij constant volume. We kunnen de analogie van $dH$ (voor isobare processen) en $dU$ (voor isochore processen) uitbreiden en de warmtecapaciteit $C_p$ bij constante druk definiëren als:

Door de variabelen te scheiden en de vergelijking van $T_0$ tot $T$ te integreren, verkrijgen we de enthalpie $H$ van een systeem bij een temperatuur $T$:

Omdat $H$ een toestandfunctie is, kunnen we de veranderingen in enthalpie eenvoudig berekenen door de enthalpieën van de begin- en eindtoestand van een proces af te trekken:

Belangrijke overwegingen

Naast de hierboven genoemde berekeningen is het essentieel om te begrijpen dat de verandering in enthalpie bij een chemische reactie afhankelijk is van de temperatuur. Dit komt doordat de enthalpie van de reagentia en producten niet alleen van de stof zelf afhankelijk is, maar ook van hun specifieke warmtecapaciteit $C_p$, die kan variëren. Dit betekent dat $\Delta H_r$, de verandering in enthalpie van de reactie, sterk wordt beïnvloed door de temperatuur, aangezien reactanten en producten verschillende temperatuurafhankelijkheden van hun enthalpieën hebben.

Hoe wordt de afstand tussen spins bepaald in DEER/PELDOR-experimenten?

DEER/PELDOR-experimenten bieden krachtige technieken om de afstand tussen spinlabels in biomoleculen te meten, door gebruik te maken van gepulseerde EPR (electron paramagnetic resonance). Deze methoden zijn cruciaal voor het bestuderen van moleculaire structuren en dynamiek, vooral wanneer conventionele technieken zoals röntgendiffractie of NMR moeilijk of onmogelijk zijn.

In een typisch drie-puls PELDOR-experiment wordt een 90°-puls toegepast op de resonantiefrequentie van spin A, gevolgd door een 180°-puls op een ander moment, wat de magnetisatie veroorzaakt door spins B om te keren. Het resulterende Hahn-echo signaal wordt gemeten als functie van de tijd. De oscillatie van de spin-echo-intensiteit bevat waardevolle informatie over de dipolaire koppeling tussen spins A en B, wat op zijn beurt afhangt van de afstand tussen deze spins. Het is mogelijk om deze afstand te berekenen op basis van de gemeten frequentie van de oscillaties in het spin-echo-signaal.

Het vier-puls PELDOR-experiment voegt een extra complexiteit toe door de toepassing van een tweede 180°-puls, die een gerichte refocussing van het spin-echo-signaal mogelijk maakt. Door de tijdsafhankelijkheid van het gemeten signaal te analyseren, kunnen de afstanden tussen de spins A en B nauwkeuriger worden bepaald. Het signaal dat voortkomt uit deze experimenten bevat zowel bijdragen van intramoleculaire spin-spininteracties (tussen spins op hetzelfde molecuul) als intermoleculaire interacties (tussen spins op verschillende moleculen).

Bovendien kunnen Tikhonov-regularisatie-algoritmen worden gebruikt voor de directe analyse van de gemeten signalen. Dit biedt een meer gedetailleerd inzicht in de afstandsverdeling en kan helpen om de specifieke afstanden tussen spins in moleculen met verschillende oriëntaties te berekenen.

Een belangrijke beperking van PELDOR-experimenten is dat ze worden uitgevoerd op bevroren monsters, meestal bij temperaturen van ~50–80 K. Dit betekent dat ze geen dynamische metingen mogelijk maken, maar wel de afstandsverdeling op het moment van bevriezen reflecteren. Hoewel de temperatuurbereiken de metingen beperken, kunnen ze nog steeds nuttige informatie leveren over moleculaire structuren in een bevroren toestand. Ook is de meetbare afstand beperkt tot 1-8 nm vanwege de noodzaak om volledige oscillaties van het spin-echo-signaal vast te leggen.

Naast de fundamentele afstandsmetingen heeft PELDOR zijn nut bewezen in het onderzoeken van conformationele veranderingen in eiwitten. Door meerdere afstanden te meten van moleculen gelabeld op verschillende posities, kunnen wetenschappers structuren ab initio bepalen en globale conformaties modelleren via triangulatie. Dit heeft geleid tot belangrijke doorbraken in de structurele biologie, zoals het modelleren van ribonucleoproteïnecomplexen in oplossing.

Wat belangrijk is om te begrijpen is dat DEER/PELDOR-experimenten niet alleen toepasbaar zijn op moleculen in oplossing, maar ook in cellulaire omgevingen. Dit maakt het mogelijk om de conformatie van eiwitten in levende cellen te onderzoeken. Het gebruik van snel-vriesmethoden in combinatie met microfluïdische mengtechnieken heeft het mogelijk gemaakt om reacties op milliseconde tijdschaal vast te leggen, wat de mogelijkheden van EPR verder uitbreidt.

De betrouwbaarheid van PELDOR-resultaten wordt vaak verhoogd door de toepassing van verschillende experimenten en technieken, zoals gecombineerde EPR- en NMR-metingen, waarmee zowel korte- als lange-afstandsbeperkingen kunnen worden verkregen. Dit heeft geleid tot succesvolle structurele modellering van complexe biomoleculen en hun interacties.

Hoe kan kracht-spectroscopie ons begrip van biomoleculen verdiepen?

In AFM-gebaseerde kracht-spectroscopie wordt de kracht gemeten door een cantilever in de verticale richting te verplaatsen, waarbij een biomolecuul wordt uitgerekt tussen de AFM-tip en een oppervlak. De mate van verlenging van het molecuul wordt gemeten door de afbuiging van de cantilever, die kan worden omgezet in krachtwaarden. Dit proces maakt het mogelijk om de eigenschappen van biomoleculen te bestuderen door de kracht-uitrekking curves te analyseren die zich vormen bij het rekken of ontvouwen van moleculen. De krachten die hierbij betrokken zijn, liggen meestal in de piconewton-bereik, terwijl de uitrekkingen zich op nanometer-schaal bevinden.

De respons van elastische polymeren op toegepaste krachten kan worden beschreven door verschillende moleculaire modellen, zoals het Gaussiaanse ketenmodel, het vrij gewrichten ketenmodel (FJC), en het wormachtige ketenmodel (WLC). Deze modellen helpen bij het begrijpen van de mechanische eigenschappen van biomoleculen door de relatie tussen kracht en uitrekking te beschrijven. De toepassing van deze modellen biedt een theoretisch kader voor het interpreteren van de gemeten kracht-uitrekking curves, die informatie kunnen verschaffen over de stijfheid, de lengte, en de flexibiliteit van de biomoleculen die worden onderzocht.

Het Gaussiaanse ketenmodel beschrijft een polymeer als een ideaal veer, waarbij de kracht die nodig is om het polymeer uit te rekken een lineaire functie is van de uitrekking. Dit model is het meest geschikt voor kleine uitrekkingen, wanneer de krachten relatief laag zijn en het polymeer zich gedraagt als een elastische veer. Bij grotere krachten, wanneer het polymeer steeds verder uitrekt en aligneert, moet het model worden aangepast.

Het wormachtige ketenmodel is het meest veelzijdige van de drie, omdat het rekening houdt met de flexibiliteit van het polymeer langs de keten. Dit model beschrijft het polymeer als een reeks van buigingen, waarbij de kromming afhankelijk is van de positie in de keten. Het is bijzonder geschikt voor het modelleren van biologische moleculen zoals DNA en RNA, die bij het uitrekken een niet-lineaire respons vertonen. Het model maakt het mogelijk om de persistentielengte te bepalen, die aangeeft over welke afstand de moleculaire oriëntatie behouden blijft.

De toepassing van kracht-spectroscopie in combinatie met deze modellen biedt wetenschappers een diepgaand inzicht in de mechanische eigenschappen van biomoleculen. Het stelt hen in staat om belangrijke parameters zoals de stijfheid, de elasticiteit en de afmetingen van moleculen nauwkeurig te meten. Dit heeft niet alleen implicaties voor fundamenteel onderzoek, maar ook voor toepassingen in de geneeskunde, zoals het ontwerpen van nieuwe biomaterialen, het begrijpen van eiwitvouwen en -interacties, en het ontwikkelen van therapieën tegen ziekten die verband houden met moleculaire misvouwen of -verstoringen.

Het is belangrijk te begrijpen dat de kracht-spectroscopie experimenten vaak zeer gevoelig zijn voor de omgeving waarin ze worden uitgevoerd. Temperatuur, ionsterkte, en andere omgevingsfactoren kunnen de mechanische eigenschappen van biomoleculen beïnvloeden. Daarom moeten wetenschappers zich bewust zijn van deze variabelen bij het uitvoeren van experimenten en het interpreteren van de resultaten.

De complexiteit van moleculaire structuren en hun respons op krachten vereist een zorgvuldige en gedetailleerde benadering. Fouten in de interpretatie van kracht-uitrekking curves kunnen leiden tot misverstanden over de mechanische eigenschappen van de biomoleculen, wat de nauwkeurigheid van het onderzoek kan beïnvloeden. Het combineren van kracht-spectroscopie met andere technieken, zoals röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie, kan daarom nuttig zijn om een vollediger beeld te krijgen van de moleculaire structuur en dynamiek.