Hoe wordt de efficiëntie van energieoverdracht gemeten in een FRET-systeem?

In een systeem van Förster Resonantie Energieoverdracht (FRET) is de efficiëntie van de energieoverdracht, E, afhankelijk van de afstand tussen de donor- en acceptormoleculen. De overdracht wordt berekend door de gemiddelde vervaltijd van de donor in de aanwezigheid en afwezigheid van de acceptor te vergelijken. Deze waarde wordt bepaald met behulp van de formule:

waarbij $\tau$ de amplitude-gemiddelde vervaltijd is, die wordt berekend als:

$\langle \tau \rangle = \sum \alpha_i \tau_i$

In de praktijk kunnen afstanden meestal worden gemeten tussen ongeveer $0.5 R_0$ en $1.5 R_0$. Buiten deze grenzen kunnen we alleen aangeven of de afstand kleiner is dan $0.5 R_0$ of groter dan $1.5 R_0$. Bij afstanden van ongeveer 10 Å kan een ander quenchingmechanisme optreden, namelijk de Dexter-energietransfer, die plaatsvindt via een dubbel elektronuitwisselingsproces tussen overgangsmetalen en fotogeïrriteerde fluoroforen. Dit type energietransfer heeft echter meestal geen invloed in de systemen die we doorgaans bestuderen, dus wordt het niet verder besproken in dit verband.

De oriëntatiefactor $\kappa^2$ wordt bepaald door de hoeken tussen de donor- en acceptordipolen en hun onderlinge afstand. De waarde van $\kappa^2$ varieert tussen 0 en 4, waarbij de waarde 4 wordt behaald wanneer de dipolen perfect zijn uitgelijnd met de scheidingsvector $R$. Bij snelle isotrope bewegingen (dynamisch gemiddeld) wordt $\kappa^2$ vaak aangenomen als 2/3. Dit is de meest gebruikelijke aanname voor FRET-berekeningen, en het is aan te raden om dit te verifiëren door middel van experimenten.

Daarnaast kan men technieken zoals polarisatiespectroscopie gebruiken om de limieten van $\kappa^2$ te bepalen. Door de ratio van geobserveerde anisotropieën van donor en acceptor te meten, kunnen wetenschappers bepalen of de veronderstelling van $\kappa^2 = 2/3$ gerechtvaardigd is. Dit is vooral nuttig bij systemen waarbij zowel de donor- als de acceptormoleculen korte levensduur hebben, relatief gezien in vergelijking met hun roterende bewegingen.

Hoe kies je het juiste fluorofore voor je experiment?

Fluoroforen vormen een onmisbaar onderdeel van moderne fluorescentieonderzoeken. Zonder deze moleculen zou de toepassing van fluorescente microscopie, spectroscopie en gerelateerde technieken zoals FRET of FCS niet mogelijk zijn. Fluoroforen komen zowel van nature voor als worden synthetisch geproduceerd, waarbij de meeste moderne toepassingen steunen op kunstmatig ontworpen moleculen die specifiek zijn afgestemd op onderzoeksbehoeften. Het is niet verrassend dat dit hoofdstuk over fluoroforen de langste is in veel boeken over dit onderwerp, aangezien fluoroforen de kern vormen van veel biochemische en biologische toepassingen.

Natuurlijk voorkomende fluoroforen, zoals quinine, hebben een belangrijke rol gespeeld in de vroege ontwikkeling van het fluorescentieveld. Andere van nature voorkomende fluoroforen, waaronder aromatische aminozuren zoals tryptofaan, spelen nog steeds een cruciale rol in veel moderne experimenten. Deze moleculen worden vaak aangeduid als ‘intrinsieke fluoroforen’ en worden veelvuldig gebruikt in experimenten waarin biologische structuren of processen gemonitord worden zonder dat een extern fluorofoor hoeft te worden toegevoegd. In sommige gevallen kunnen intrinsieke fluoroforen zelfs de voorkeur hebben omdat ze de noodzaak voor een externe labelen of markeren van biomoleculen verminderen.

Het verschil tussen fluoroforen en niet-fluorescente moleculen is vaak kwantitatief en wordt gedefinieerd door de fluorescentie-quantumopbrengst van een molecuul. De meeste moleculen die licht absorberen in het ultraviolet en zichtbaar licht, geven geen opvallende fluorescentie. Nucleotiden en nucleosiden fluoresceren bijvoorbeeld wanneer ze worden aangestraald met diep UV-licht (~260 nm), maar hun fluorescentieopbrengst is extreem laag (~10^−4). Dit maakt ze niet praktisch bruikbaar als fluoroforen in veel experimentele instellingen. Om deze reden zijn fluoroforen die goed fluoresceren bij specifieke golflengten van groot belang voor de experimenten die met behulp van fluorescentieanalyse worden uitgevoerd.

In sommige gevallen is het mogelijk om de intrinsieke fluorescentie van het eiwit zelf te gebruiken, bijvoorbeeld als het eiwit een tryptofaanresidu bevat. De intrinsieke fluorescentie kan helpen bij het volgen van eiwitveranderingen zoals het ontvouwen van het eiwit, wat belangrijk is voor de studie van eiwitstructuren en -functies.

De keuze van het fluorofore hangt dus niet alleen af van de beschikbare technologie, maar ook van het type systeem dat men onderzoekt, het doel van het onderzoek en de specifieke vraag die beantwoord moet worden. Het is essentieel om te begrijpen welke eigenschappen van het fluorofore (zoals absorptiegolflengte, emissiegolflengte en quantumopbrengst) van invloed kunnen zijn op de interpretatie van de resultaten en de benodigde meetmethoden. Alleen dan kan men het meest geschikte fluorofore kiezen voor het beoogde experiment.

Daarnaast kan de stabiliteit van het fluorofore onder verschillende experimentele omstandigheden ook van invloed zijn op de kwaliteit van de gegevens. Fluoroforen kunnen variëren in hun gevoeligheid voor fotobleaching (waarbij het fluorofore zijn fluorescerende vermogen verliest door blootstelling aan licht) en kunnen ook beïnvloed worden door de chemische en biologische omgeving waarin ze zich bevinden. Het is daarom van belang om niet alleen de eigenschappen van het fluorofore zelf te begrijpen, maar ook de aard van de experimenten en de reactieve omgevingen waarin de fluoroforen worden gebruikt.

Wat is het effect van tryptofaan en zijn analogons op eiwitfluorescentie?

De studie van intrinsieke eiwitfluorescentie is een belangrijk onderzoeksgebied in de biochemie en moleculaire biologie, dat ons in staat stelt de structuren en interacties van eiwitten in detail te begrijpen. Een van de meest gebruikte technieken in dit veld is de meting van de fluorescentie van tryptofaanresiduen in eiwitten. Tryptofaan, een essentieel aminozuur, speelt een cruciale rol in de fluorescentie-eigenschappen van eiwitten, en het bestuderen van deze eigenschappen kan inzicht geven in de omgeving van tryptofaanresiduen en de structurele veranderingen van eiwitten.

Transferrine, een ijzerbindend eiwit, vertoont ook quenching van de tryptofaanemissie, hoewel er geen heemgroep aanwezig is. In transferrine, dat uit een enkel ketenpolypeptide van 629 aminozuren bestaat, worden twee ijzers gebonden door specifieke tyrosine-, histidine- en asparaginezuurresiduen. Wanneer ijzer gebonden is, verschijnt een ligand-naar-metaal ladingsoverdracht (LMCT)-band, die veroorzaakt wordt door de overlap van de π-orbitalen van de ligande tyrosineresiduen met de d-orbitalen van het ijzeratoom. Deze LMCT-band absorbeert zowel in het zichtbare als UV-gebied en resulteert in quenching van de intrinsieke eiwitfluorescentie via FRET.

Het gebruik van tryptofaananalogons in fluorescerende studies heeft de afgelopen decennia belangrijke vorderingen geboekt. Tryptofaananalogons zoals 7-azatryptofaan en 5-hydroxytryptofaan zijn populair geworden in de studie van eiwitten. Deze analogons hebben absorptiespectra die verder reiken naar het rode gebied in vergelijking met tryptofaan. Hierdoor kunnen ze worden aangeslagen bij golflengten die reguliere tryptofaan niet significant absorbeert, bijvoorbeeld tussen 310-315 nm. Dit selectieve gedrag maakt het mogelijk de fluorescerende eigenschappen van deze analogons te bestuderen, zelfs in de aanwezigheid van andere tryptofaan-bevattende eiwitten.

Bovendien is de emissie van 7-azatryptofaan zeer gevoelig voor de omgeving. De quantumopbrengst van dit analoog is laag in water, maar kan dramatisch toenemen in minder polaire omgevingen, zoals van ~0,01 in water tot 0,25 in acetonitril. Dit maakt 7-azatryptofaan een nuttig hulpmiddel in de studie van eiwitstructuren en dynamica, omdat het in staat is subtiele veranderingen in de omgeving van het tryptofaanresidu te detecteren.

Naast tryptofaananalogons heeft de fotochemische conversie van tyrosine- en tryptofaanresiduen in eiwitten de afgelopen jaren ook belangstelling getrokken. Dit kan leiden tot gewijzigde residuen, zoals ß-alkylatie of perfluoroalkylatie van tryptofaan, wat verdere mogelijkheden biedt voor het bestuderen van eiwitten en hun interacties. Deze technieken zijn bijzonder nuttig voor het onderzoeken van eiwit-dna interacties en andere biologische processen.