Comment éviter les réflexions parasitaires et optimiser les mesures en fluorescence?

Lorsque l’on effectue des mesures de fluorescence, la gestion des réflexions parasitaires joue un rôle crucial dans l’obtention de résultats fiables. Un des défis les plus fréquemment rencontrés dans les systèmes d'excitation est la gestion des « fantômes de Rayleigh », qui sont des réflexions non désirées de la lumière d’excitation. Ces réflexions peuvent interférer avec la lumière émise par l'échantillon, faussant ainsi les résultats obtenus.

Dans ce contexte, l’utilisation d’un porte-échantillon à angle variable, comme celui montré dans la Figure 3.34, permet un contrôle plus précis de l'orientation de l’échantillon par rapport à la direction de l'excitation. Ce type de support est particulièrement utile pour les échantillons solides, comme ceux rencontrés dans des études de fluorescence sur des types variés de papier, où l'orientation précise peut influencer significativement la qualité des données recueillies.

Par ailleurs, la diversité des cuvettes disponibles sur le marché ne doit pas être sous-estimée. Des cuvettes spécialisées, comme celles à volumes microscopiques, adaptées à de très petites quantités de liquide, ou encore celles conçues pour des mesures anaérobies, permettent de répondre à une multitude de besoins expérimentaux. Il existe également des cuvettes spéciales pour les cellules de flux, qui sont particulièrement utiles dans des applications telles que la chromatographie ou l’étude de réactions en temps réel.

Un autre aspect important dans le domaine de la fluorescence concerne les plaques à microplaques, introduites dans les années 1950, et aujourd'hui largement utilisées dans des domaines tels que le criblage à haut débit, en particulier dans le développement de médicaments. Bien que les premières plaques aient été conçues pour les cultures cellulaires, elles ont évolué pour mesurer la fluorescence, l’absorption, mais aussi des paramètres comme la polarisation et la durée de vie des fluorescences. L’optimisation de ces systèmes de mesure passe par l’utilisation de plaques de formats variés, tels que 96 puits, 384 puits ou même jusqu’à 3456 puits, permettant de travailler avec des volumes de plus en plus petits, parfois de l'ordre de 5 µl par puits.

L’importance de comprendre comment l’orientation de l’échantillon et la gestion des réflexions parasitaires influencent les mesures ne peut être sous-estimée, car cela peut significativement affecter la précision et la fiabilité des données collectées. Les chercheurs doivent être conscients que les choix techniques – tels que l'angle de réflexion et le type de cuvette utilisé – doivent être adaptés aux besoins spécifiques de chaque expérience. La capacité à ajuster finement ces paramètres est un atout pour garantir la qualité des résultats, en particulier lorsqu’il s’agit d'étudier des échantillons complexes ou d’appliquer des méthodes à haut débit.

L'approche des Phasors Multidimensionnels dans la Microscopie à Fluorescence

Une autre application prometteuse des phasors spectrals réside dans l'analyse de données FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). L'intégration des informations de durée de vie et de spectre dans une seule analyse, connue sous le nom de FLIM résolu spectralement (sFLIM), est devenue un outil essentiel pour des applications variées, comme la détection du transfert d'énergie de résonance par fluorescence (FRET) ou la décomposition des signatures spectrales de colorants multiples. Des travaux pionniers, comme ceux de Pelet et al. (2004), ont montré comment ces approches permettent d'analyser avec précision des phénomènes biochimiques au niveau moléculaire. Ce concept a été approfondi par des études récentes, qui ont permis de séparer efficacement des mélanges complexes de fluorophores en utilisant des transformations phasor dans l'espace spectral.

Un exemple frappant de cette technique est l'approche dite S-FLIM, qui permet de dissocier des signatures spectrales et de durée de vie de plusieurs espèces inconnues dans une seule analyse. La méthode repose sur la capacité des phasors à décoder simultanément les informations temporelles et spectrales, ce qui permet une décomposition plus rapide et plus précise des échantillons biologiques complexes. Des travaux récents de Scipioni et al. (2021) ont démontré la puissance de cette approche en extrayant des informations spécifiques sur les interactions moléculaires dans des échantillons cellulaires vivants.

Une innovation importante dans l'analyse hyperspectrale à l'aide des phasors a été introduite par Hedde et al. (2021), qui ont utilisé un filtre sinusoïdal pour convertir directement les données d'émission de fluorescence en coordonnées phasor sans nécessiter un traitement de données post-acquisition. Ce procédé a permis une amélioration substantielle de la vitesse d'acquisition d'images et du traitement des données, rendant possibles des expériences en 4D, où les dimensions spatiales et spectrales sont acquises simultanément, avec des résultats obtenus en quelques secondes seulement.

Les applications cliniques et biomédicales de ces techniques sont également notables. L’utilisation des phasors dans la cytométrie de flux à durée de vie de fluorescence (FLFC) a été explorée pour analyser les rapports entre NAD(P)H libre et lié dans le cadre de l’apoptose cellulaire, comme l'ont montré Alturkistany et al. (2019). L’analyse des dynamiques de l'absorption de rhodamine B par des cellules cancéreuses humaines MCF-7 ou l’imagerie de la durée de vie de NAD(P)H dans des reins de rat ex vivo sont des exemples de l’application de ces technologies pour étudier des processus biologiques en temps réel.

L’une des avancées marquantes des systèmes FLIM à phasor a été la mise en place de dispositifs capables d’effectuer une analyse de la durée de vie de fluorescence à une vitesse de vidéo, permettant ainsi des études dynamiques et en temps réel sur des cellules vivantes. Ces systèmes ont été utilisés pour observer des phénomènes aussi divers que l’incorporation de médicaments topiques dans la peau humaine, ou l’étude des changements spatio-temporels dans l'architecture de la chromatine au cours de la réponse aux dommages de l'ADN, comme décrit par Lou et al. (2019).

Les résultats de ces recherches illustrent la capacité des phasors à offrir des solutions rapides et précises pour l’analyse simultanée de plusieurs paramètres fluorescents, et soulignent l’importance de cette approche dans la biophotonique moderne. La possibilité d'utiliser simultanément des données spectrales et de durée de vie ouvre des perspectives prometteuses pour des études biomédicales détaillées et des applications cliniques de haut niveau.

En complément de ces applications, il est essentiel de noter que la précision des analyses phasor repose sur la qualité des instruments et la capacité de traitement des données. L’utilisation de cartes d'acquisition de données comme celles du FastFLIM, développées avec la technique numérique du domaine de fréquence, permet d’optimiser l’acquisition de données sans le retard souvent observé dans les méthodes traditionnelles basées sur la technique TCSPC. Ces améliorations technologiques rendent les approches phasor plus accessibles et efficaces pour une large gamme d'applications scientifiques et cliniques.

Comment la fluorescence a-t-elle révolutionné l’étude des systèmes biologiques et chimiques ?

L’emploi de la fluorescence in vivo remonte aussi au XIXe siècle, lorsque Paul Ehrlich utilisa la fluorescéine pour étudier la sécrétion de l’humeur aqueuse dans l’œil. Ce pigment, surnommé uranine en raison de sa couleur verte intense similaire à celle du verre à l’uranium, est encore employé aujourd’hui en ophtalmologie, notamment lors d’examens sous lumière bleue. Parallèlement, la synthèse des rhodamines, dérivés azotés de la fluorescéine, a enrichi la palette des fluorophores disponibles, offrant des teintes rougeoyantes particulièrement lumineuses. Ces colorants basiques furent nommés rhodamines en référence au grec « rhodon » signifiant rose, illustrant leur éclat spécifique.

La compréhension et la maîtrise de la fluorescence ont également bénéficié de progrès techniques majeurs au début du XXe siècle avec l’invention des microscopes à fluorescence. Ces instruments, développés grâce aux efforts conjoints de pionniers comme August Köhler et Carl Zeiss, ont permis d’observer l’autofluorescence intrinsèque des tissus biologiques, ainsi que l’interaction des colorants fluorescents avec les cellules vivantes. Ces avancées ont ouvert la voie à des analyses détaillées de la structure cellulaire et à la visualisation précise de phénomènes biologiques jusqu’alors invisibles.

Sur le plan théorique, les fondations modernes de la spectroscopie fluorescente furent posées par des scientifiques tels qu’Otto Stern, Jean Perrin, Theodor Förster et Gregorio Weber. Ils ont introduit des concepts fondamentaux comme la durée de vie de l’état excité, la polarisation de la fluorescence, et le rendement quantique. Ces notions sont essentielles pour interpréter correctement les données fluorescentes, comprendre les mécanismes moléculaires impliqués, et optimiser les applications analytiques.

Les paramètres fondamentaux mesurés en fluorescence peuvent être regroupés en cinq catégories principales. Le spectre d’émission, qui correspond à l’intensité lumineuse émise en fonction de la longueur d’onde, constitue souvent la première donnée recueillie. Il permet d’observer des modifications structurelles ou environnementales du fluorophore, telles que des changements de fluidité membranaire ou la liaison à un ligand. Le spectre d’excitation, quant à lui, révèle comment la fluorescence varie selon la longueur d’onde d’excitation, donnant souvent des indices sur les mécanismes d’absorption et les transferts d’énergie.

Le rendement quantique est une mesure cruciale, exprimant le rapport entre le nombre de photons émis et le nombre de photons absorbés. Cette valeur, variant typiquement de quelques pourcents à presque 100 %, renseigne sur l’efficacité du fluorophore et conditionne son utilité pratique. La polarisation et l’anisotropie décrivent l’orientation du fluorophore au moment de l’émission, renseignant sur la mobilité moléculaire pendant l’état excité, ce qui est particulièrement pertinent pour étudier des interactions biomoléculaires dans leur environnement natif.

Il est important de comprendre que la fluorescence ne se limite pas à la simple observation d’une lumière colorée : elle repose sur des principes physiques et chimiques complexes, dont la maîtrise permet d’extraire une multitude d’informations à différentes échelles. Le lecteur doit saisir que chaque paramètre mesuré – émission, excitation, rendement, polarisation, durée de vie – est une pièce d’un puzzle complexe, dont l’interprétation correcte exige une connaissance approfondie des conditions expérimentales et des caractéristiques spécifiques du fluorophore utilisé. Par ailleurs, les applications contemporaines de la fluorescence, de la biologie cellulaire à l’analyse environnementale, reposent sur une combinaison sophistiquée de ces concepts, où la précision et la rigueur méthodologique sont indispensables.