На правах рукописи

БАБАЕВА Наталия Александровна

Гормональный и инфекционный факторы канцерогенеза

органов женской репродуктивной системы

14.01.12. – онкология

14.01.01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва – 2013

Автореферат разослан «___» марта 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Последние десятилетия, несмотря на неоспоримые достижения современной медицины, отмечается неуклонный рост числа онкологических, в том числе и онкогинекологических заболеваний. С начала 2000-х годов в России ежегодно регистрируются более новых случаев злокачественных новообразований. Рак молочной железы является ведущей онкологической патологией у женского населения России, составляя 20,5% всех злокачественных процессов у женщин, опухоли тела матки в 2010г. в России составили 7,1%, шейки матки - 5,3%, яичников - 4,7% (, М, 2011г.).

В конце XX века рак органов женской репродуктивной системы (РОЖРС), включая рак молочной железы (РМЖ), яичников (РЯ) и эндометрия (РЭ), во всем мире стал одним из наиболее значимых факторов отрицательных демографических тенденций. Заболе­ваемость и смертность от этих новообразований стремительно растет. Так, с 1990 по 2000 год число заболевших РОЖРС увеличилось на 19,2%, а умерших - на 24,1%. Ежегодная заболеваемость РОЖРС в России составляет 100 на 100 тыс. женского насе­ления, а смертность от него - 70 на 100 тыс. женского населения (, М, 2011г.).

Следующий факт, требующий своего осмысления – это то, что у преимущественного числа женщин злокачественный процесс развивается на фоне менопаузы. По данным статистических исследований более чем у 78% больных злокачественный процесс диагностируется после 50 лет (, 2007г.).

Бурное развитие теоретических и прикладных аспектов клинической онкогенетики и молекулярной медицины позволяет пересмотреть с новых позиций ряд уже установившихся понятий в отношении этиологии, патогенеза и принципов профи­лактики РОЖРС.

В этиологии патологических процессов в течение долгого времени доминировал принцип монокаузальности. Этому способствовали открытия в микробиологии и вирусологии, которые наложили свой отпечаток в трактовке причин неинфекционных заболеваний. Вот уже более века в онкологии предпринимаются попытки сформировать четко обозначенную причину развития опухолевого процесса. В настоящее время не вызывает сомнений, тот факт, что при различных локализациях опухолей, причины, вызывающие развитие злокачественного процесса, различны и многообразны. На основе анализа современного состояния проблемы, можно выделить пять основных факторов инициации канцерогенеза в органах репродуктивной системы (, , 2009г.):

1)  герминальные мутации генов BRCA1 и BRCA2 (Breast Cancer Associated), обуславливающие наследственную предрасположенность к развитию ряда опухолевых заболеваний репродуктивных органов;

2)  пониженное (меньше 2:1) соотношение “физиологического” и “канцерогенного” метаболитов эстрогенов: 2-гидроксиэстрона (2-ОНЕ1) и 16α-гидроксиэстрона (16α-ОНЕ1), характеризующее состояние гормонального (эстрогенного) баланса в женском организме и определяющее риск развития опухолей в эстроген - зависимых органах и тканях;

3)  эпигенетические нарушения (аномальное метилирование) в опухоль - супрессорных генах, возникающие на ранних стадиях процесса опухолеобразования и способствующие повышению малигнизирующей активности клеток - мишеней;

4)  хронические воспалительные заболевания в органе - мишени как одно из наиболее ранних событий в канцерогенезе;

5)  инфекционный фактор.

С нашей точки зрения, учитывая варианты гомеостаза женской репродуктивной системы и особенности микробиоценоза в разные периоды жизни, наиболее значимые направления, требующие сегодня пристального внимания это эндокринологическое и инфекционное.

Говоря об эндокринологической части проблемы, следует указать на отсутствие до настоящего времени обоснованной концепции роли гормонального фактора в механизмах канцерогенеза у пациенток постменопаузального возраста. Очевидно, что понимание роли гормональной составляющей в постменопаузе, является ключом к формированию и развитию патогенетической профилактики спорадического рака.

Инфекционная составляющая канцерогенеза хорошо представлена на модели рака шейки матки (РШМ), где доказана причастность вируса папилломы человека (ВПЧ) к развитию злокачественного процесса (H. Zur-Hauzen, 1978, 1999, 1984). Появился ряд сообщений о значимости ВПЧ в развитии рака вульвы (Sutton G. P. et al, 1988; с соавт. 2002, 2003, 2005). Наряду с этими данными, при, казалось бы, очевидности проблемы остается открытым вопрос, какие факторы, кроме вируса задействованы или являются необходимой составляющей вирусного канцерогенеза. Известно, что вирусоносительство в женской популяции широко распространено (от 35 до 55%) (Schiffman M. E. et al, 1993; Parkin D. M., 2002), злокачественный же процесс развивается лишь в единичных случаях. В этом плане, мы считаем, чрезвычайно интересным и важным сопоставить данные об инфекционной составляющей при различных локализациях опухолей и их гормональном гомеостазе. Под термином «гормональный гомеостаз» в постменопаузе мы, прежде всего, понимаем два важных компонента:

- уровень рецепторов в органах-мишенях в постменопаузальном периоде;

- уровень экспрессии эстрогенных метаболитов (16α-ОНЕ1 и 2-ОНЕ1).

Многочисленные исследования свидетельствуют, что основным фактором, стимулирующим клетки эстроген - зависимых органов (молочные железы, эндометрий, шейка матки, вульва) к патологическому росту в постменопаузе, является не сам уровень эстрадиола, а нарушение баланса его метаболитов, имеющих разную способность к активации клеточной пролиферации (, , 2009г., Clemons M., Goss P., 2001, Auborn KJ. et al, 2003). К настоящему времени многочисленными исследованиями установлено, что в случае повышенного содержания 16α-гидроксиэстрона, патологические пролиферативные процессы в гормон - зависимых органах и тканях многократно усиливаются. Нарушение гормонального баланса в организме, а именно нарушение соотношения 2- и 16α – гидроксипроизводных, становится актуальной эндокринологической составляющей канцерогенеза в женской популяции (, , 2009г.; Clemons M., 2001г.; Muti P., Bradlow HL., 2000г.).

Представляется важным на основе современных методологий, на одном клиническом материале обозначить эти два направления и убедиться в их реальной значимости и, исходя из полученных данных, сформировать концепцию облигатного предрака для органов репродуктивной системы и обозначить пути патогенетической профилактики.

Цель исследования: формирование этиопатогенетической концепции рака женской репродуктивной системы, исходя из наличия инфекционной и/или гормональной составляющей канцерогенеза и обоснование принципов патогенетической профилактики.

Задачи исследования

1. Изучить роль инфекционного и гормонального факторов в развитии склеротического лишая и рака вульвы (спектр инфекционных агентов, уровень метаболитов, уровень стероидных рецепторов, экспрессия белка Е 7).

2. Изучить экспрессию белка Е 7, как основного и раннего маркера канцерогенеза, при различных патологических процессах шейки матки.

3. Изучить роль инфекционного и гормонального факторов при атипической гиперплазии и раке эндометрия (спектр инфекционных агентов, уровень метаболитов, уровень стероидных рецепторов).

4. Изучить роль инфекционного и гормонального факторов при цистаденомах, пограничных опухолях и раке яичников (спектр инфекционных агентов, уровень метаболитов, экспрессия белка Е 7).

5. Изучить роль инфекционного и гормонального факторов при мастопатиях и раке молочной железы (спектр инфекционных агентов, уровень метаболитов, уровень стероидных рецепторов, экспрессия белка Е 7)

6. Обосновать концепцию облигатного предрака органов репродуктивной системы (вульва, шейка матки, эндометрий, яичники, молочная железа)

7. Обосновать принципы ранней диагностики и патогенетической профилактики рака репродуктивных органов.

Научная новизна

·  в работе установлена роль инфекционной и гормональной составляющей при различных локализациях опухолей женской репродуктивной системы;

·  определена значимость различных факторов канцерогенеза при различных нозологиях рака репродуктивных органов;

·  сформулирована концепция облигатного предрака органов женской репродуктивной системы, исходя из сочетаний различных патогенетических факторов;

·  разработаны пути патогенетической профилактики рака репродуктивных органов

Практическая значимость

Сформированная концепция облигатного предрака органов репродуктивной системы позволяет целенаправленно формировать группы повышенного риска развития злокачественных опухолей у женщин в постменопаузе. У данного контингента пациенток с высокой эффективностью могут быть реализованы принципы мониторинга, методы ранней диагностики и обоснованы принципы патогенетической профилактики.

Основные положения, выносимые на защиту

1.  Гормональная составляющая постменопаузального канцерогенеза в органах репродуктивной системы у женщин зависит от рецепторного статуса органов-мишеней и особенностей метаболизма эстрогенов:

·  высокий уровень эстроген - рецепторов в сочетании с высоким уровнем экспрессии 16α-ОНЕ1 формируют канцерогенез через этап гиперпластического процесса;

·  низкий уровень эстроген – рецепторов или нормальные значения эстрогенных метаболитов формируют канцерогенез в условиях хронического воспаления на фоне атрофического процесса;

2.  При спорадическом раке вульвы, шейки матки и яичников инфекционная составляющая канцерогенеза представлена различными генотипами вируса папилломы человека.

3.  Ко-факторами, определяющими канцерогенез спорадического постменопаузального рака репродуктивных органов являются:

·  при раке вульвы - уровень эстроген - рецепторов, низкий коэффициент соотношения метаболитов (2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1), наличие вируса папилломы человека, хроническое воспаление на фоне длительной дистрофии вульвы (склеротический лишай);

·  при раке шейки матки - наличие вируса папилломы человека и высокий уровень метаболита 16α-ОНЕ1;

·  - при раке эндометрия - уровень эстроген - рецепторов, низкий коэффициент соотношения метаболитов (2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1), хроническое воспаление на фоне длительной атрофии эндометрия;

·  - при раке яичников – большое число овуляторных циклов, низкий коэффициент соотношения метаболитов (2-ОН/16α-ОНЕ1), хронический воспалительный процесс, сочетающийся с наличием папилломавирусной инфекции;

·  - при раке молочной железы - уровень эстроген - рецепторов, низкий коэффициент соотношения метаболитов (2-ОН/16α-ОНЕ1);

4. Патогенетическая профилактика спорадического рака репродуктивных органов должна формироваться задолго до наступления постменопаузы и включать профилактику папилломавирусной инфекции, снижение числа овуляторных циклов, контроль индекса массы тела, а также предупреждение хронических воспалительных процессов на фоне длительной атрофии.

Апробация работы

Результаты исследований изложены на 4-ом Российском форуме «Радиология 2003» (Москва, 2003); на научно-практической конференции «Современные подходы к диагностике и лечению гинекологического рака» (Псков, 2004); на II Российском конгрессе по остеопорозу (Ярославль, 2005); на IX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2005); на VII российском научном форуме «Радиология 2006» (Москва, 2006); на Всероссийской научно-практической конференции «Высокие медицинские технологии» (Москва, 2006); на 8-м Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва 3-6 октября, 2006); на 10 конференции «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2007); 15-th International meeting of the European Society of Gynecological Oncology (Berlin, 2007); на XVI Всероссийском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); Республиканской конференции с международным участием «Роль новых радиологических технологий в диагностике и лечении заболеваний молочных желез и органов малого таза у женщин» (Астана, 2012).

Апробация диссертации состоялась на научно-практической конференции ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России 10 декабря 2012 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 33 работы, из них 16 статей в ведущих рецензируемых периодических изданиях, 4 - в зарубежной печати, результаты работы отражены в монографии.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материал и методы исследования, 7 глав, в которых изложены результаты собственных исследований и наблюдений, заключение, выводы, практические рекомендации и указатель литературы. Работа иллюстрирована 50 рисунками, 46 таблицами. Библиография включает в себя 408 источников из них 152 отечественной и 256 - зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В данное исследование включены результаты комплексного обследования 1476 пациенток, проходивших обследование и лечение в ФГБУ РНЦРР МЗ России в период с мая 1997г. по май 2012г.: 100 женщин, находящихся в периоде постменопаузы, без анамнестических данных о наличии рака любой локализации, составили группу контроля.

Сформированы следующие группы больных, с наличием предопухолевых заболеваний и опухолей женской репродуктивной системы различной локализации в постменопаузальном периоде:

- 80 больных раком вульвы;

- 110 пациенток со склеротическим лишаем вульвы;

- 125 больных раком шейки матки;

- 491 пациентка с наличием цервикальной интраэпителиальной неоплазии различной степени тяжести (легкая, средняя, тяжелая) (CIN I-III);

- 100 больных раком эндометрия;

- 50 пациенток с атипической гиперплазией эндометрия;

- 100 больных со злокачественными эпителиальными опухолями яичников;

- 50 пациенток с доброкачественными эпителиальными опухолями яичников;

- 50 пациенток с пограничными эпителиальными опухолями яичников;

- 120 больных спорадическим раком молочной железы;

- 100 пациенток с наличием узловых форм мастопатии.

Было проведено комплексное обследование с подробным изучением анамнеза жизни и заболевания, регистрацией морфометрических данных, осмотром, инструментальными и лабораторными обследованиями.

Распределение больных по стадиям при различных локализациях рака органов женской репродуктивной системы было следующим: рак вульвы: I стадия - 21,3%, II стадия - 23,7%, III - 23,7%, IV стадия - 31,3%; рак шейки матки – I стадия – 34,8%, II стадия – 32,8% , III - 28, 0%, IV – 4,8%; рак эндометрия - I стадия - 71,0%, II стадия - 12,0%, III - 17,0%; рак яичников - I стадия - 28,0%, II стадия - 17,0%, III - 46,0%, IV стадия – 9,0%; и при раке молочной железы : I стадия – 25,0%, II стадия - 56,7%, III - 15,0%, IV стадия - 3,3%.

Методы исследования

1.Определение индекса массы тела (ИМТ) (индекс Quetelet) проводилось по формуле - соотношение веса в килограммах к квадрату роста в метрах (кг/м²). ИМТ подразделялся на следующие категории: нормальный уровень - ИМТ 18,50-24,99, повышенный уровень - ИМТ 25,00-29,99 и ожирение - ИМТ >30,00.

2. Морфологическое исследование материала биопсий и послеоперационных препаратов осуществлялось в патоморфологической лаборатории ФГБУ РНЦРР МЗ России. При гистологической проводке по стандартной методике операционный материал фиксировали в 10% растворе формалина, заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Для детализации стромального компонента опухоли срезы окрашивали по Ван - Гизону. Для определения степени злокачественности опухоли оценивали структурную и клеточную атипию, а также митотический индекс.

3. Определение уровня эстроген - рецепторов иммуногистохимическим методом. Для морфологического исследования эстроген - рецепторов материал сразу после удаления фиксировали строго 24 часа в 10% нейтральном формалине, затем заливали в парафин. Иммуногистохимические реакции для выявления РЭ проводили на парафиновых срезах с моноклональными антителами Anti-human estrogen receptor, клон 1 Д 5, фирмы «Dakopatts». Реакцию считали отрицательной, если она регистрировалась в клетках от 0% до 5-10%, слабоположительной – 10-20%(+) (менее чем 1/3 клеток), умеренно выраженной – 20-40%(++) (более чем 1/3, но менее чем 2/3 клеток), резко выраженной – 50-100%(+++) (более чем 2/3 клеток).

4. Исследование уровня метаболитов эстрогенов и их соотношения. Для количественного определения соотношения метаболитов эстрогенов в моче (2 - гидроксиэстрон/16α - гидроксиэстрон) в настоящей работе был использован иммуноферментный набор ESTRAMET 2/16 ELISA. Тест основан на конкурентном методе твердофазного иммуноферментного анализа. С помощью набора ESTRAMET 2/16 определялась индивидуальная концентрация 2-гидроксиэстрона (2ОНЕ1) и 16α-гидроксиэстрон (16αОНЕ1) в моче. Принцип исследования основан на конкурентном методе твердофазного иммуноферментного анализа. Значения уровня метаболитов эстрогенов в моче у «здоровых» женщин: 16α-ОН : 0,6-10 нг/мл; 2-ОН: 20 нг/мл; 2-ОН/16α-ОН: 0,6-6; Среднее значение соотношения 2-ОН/16α-ОН для здоровых женщин соответствует 2.

5.ПЦР – диагностика. Для обнаружения вирусов и бактерий в образцах опухолевой и нормальной тканей нами использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Основные этапы исследования: выделение ДНК из исследуемого материала с использованием стандартных наборов GenePak DNA PCR test «Лаборатория Изоген», Россия. Детекция продуктов ПЦР проводили с использованием трансиллюминатора «ТСР-20-М» (Франция) с длиной волны 312 нм.

6.Тест Murex-Digene Hybrid Capture II, способный дифференцировать две группы ДНК ВПЧ, явился еще одним методом изучения папилломавирусной инфекции в нашем исследовании. Первая группа - это типы ВПЧ 6, 11, 42, 43, 44 – т. н. низкой степени риска. Вторая группа – это типы ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 – т. н. высокой степени риска. Технология Digene Hybrid Capture II основана на обнаружении специфической последовательности ДНК (РНК), гибридизирующейся с РНК (ДНК) зондом, посредством высокоспецифичных IgG и IgM. Для обнаружения гибридов используется метод амплификации сигнала, позволяющий достичь высокой чувствительности, точности и гибкости, необходимых для рутинного скрининга и диагностики. Основные этапы теста: денатурация ДНК образца; гибридизация с РНК-зондом; захват гибридов; обнаружение гибридов; усиление сигнала.

7. Определение онкопротеина Е 7 ВПЧ высокого канцерогенного риска (16 и 18 генотипов). Онкобелок Е 7 определялся методом двухстадийного иммуноферментного анализа. Диагностическая иммуноферментная система представляет собой набор реагентов для количественного определения белка ВПЧ 16 и 18 типа. Материал получали путем «соскоба» клеточного материала с поверхности опухоли. Результаты анализа учитывали спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Для определения концентрации Е 7 в исследуемых пробах строился калибровочный график по стандартным калибровочным образцам.

8. Определение экспрессии эстрогеновых рецепторов (ER) методом проведения полимеразной цепной реакции в «режиме реального времени» с предварительной реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР). Реакция включала три этапа: 1. Пробоподготовка (выделение РНК). 2. Проведение обратной транскрипции (ОТ). 3. Проведение ПЦР. В работе использовали стандартные коммерческие реактивы ДНК-Технология”. Определение уровня экспрессии мРНК ESR1 относительно мРНК HPRT1 считали методом дельта - дельта Си-ти (ΔΔ Сt). [ESR1]/[HPRT1] = E – (Ct1-Ct2), где [ESR1]/[HPRT1] – нормированное по HPRT1 значение экспрессии ESR1, измеряется в относительных единицах, показывает, сколько копий мРНК ESR1 приходится на 1 копию HPRT1; Е – эффективность амплификации, показывает прирост матрицы на каждом цикле амплификации.

9. Дополнительные методы обследования:

- Сонография органов малого таза и брюшной полости осуществлялась на ультразвуковом сканере «Voluson - 530D MT» «Kretz Technic» (Германия). Для трансабдоминального исследования использовался датчик S – VAWA – 7, с частотой 3,5 - 5 МГц. Трансвагинальное исследование проводилось с применением внутриполостного датчика S – VDV5 – 8 B, с частотой 5 – 8,5 МГц.

- Исследование молочных желез включало: осмотр и пальпацию; сонографию молочных желез (Sonodiagnost Philips 360, Biomedica AE 530); маммографию (Mammodiagnost UC, Philips). Рентгенологическое исследование молочных желез проводили на аппаратах Мammo Diagnost, Philips (ЕС) и Senograph DMR+, General Electric (США). Традиционная маммография при необходимости дополнялась прицельной рентгенографией, а также рентгенографией с прямым увеличением изображения. При пальпируемых образованиях проводилась аспирационная тонкоигольная пункционная биопсия. При непальпируемых образованиях применяли прицельную пункцию под контролем рентгенографии с использованием системы «пистолет-игла» BARD MAGNUM. При выделениях из соска молочной железы применяли метод дуктографии с использованием одноразовых систем MD TECH с последующим цитологическим исследованием мазков-отпечатков.

10. Статистическая обработка данных. Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью известных статистических методов при использовании блока статистических программ “SPSS 13.0 for Windows”. При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.

Результаты исследования

Рак вульвы

Проведено изучение уровня эстроген - рецепторов в ткани вульвы у 182 пациенток постменопаузального возраста, из них 64 пациентки с наличием рака вульвы (РВ), 54 пациентки со склеротическим лишаем вульвы (СЛВ) и 64 пациентки без признаков патологии вульвы.

Необходимо отметить существенные различия уровня рецепторов в нормальной и дистрофически измененной ткани вульвы. У трети пациенток к моменту формирования стойкой постменопаузы и на протяжении всего постменопаузального периода ткань вульвы сохраняет высокий уровень рецепторов вне зависимости от продолжительности постменопаузы. То есть состояние рецепторного аппарата в этом случае, вероятно, генетически детерминировано и в большей степени является отражением программы старения клетки. У пациенток со СЛВ складывается иная ситуация. Количество образцов с высоким уровнем рецепторов составляет всего 3,8%, в неизмененной ткани вульвы этот процент достоверно выше – 32,8% (р<0,01). По мере увеличения продолжительности постменопаузы растет количество эстроген - негативных образцов при склеротическом лишае, составляя в общей сложности 53,8% от всех исследований (Табл. 1).

Табл. 1 Уровень эстроген - рецепторов (ER) в ткани вульвы (%) в зависимости от продолжительности постменопаузы у пациенток группы контроля, при склеротическом лишае и раке вульвы

*р<0,05 **р<0,01 в сравнении с группой контроля

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4