A propagação da luz é um fenômeno que envolve tanto os componentes elétricos quanto magnéticos, mas aqui nos concentraremos apenas no componente elétrico. Na luz natural, o vetor do campo elétrico pode oscilar em qualquer direção perpendicular à direção de propagação da luz, como ilustrado na Figura 5.1 (parte superior). Os polarizadores são dispositivos ópticos ativos capazes de isolar uma direção específica do vetor elétrico, conforme mostrado na Figura 5.1 (parte inferior). Os polarizadores mais comuns atualmente são: (1) dispositivos dicróicos, que funcionam absorvendo efetivamente um plano de polarização (como as lâminas de Polaroid H, baseadas em poli(vinil álcool) esticado e impregnado com iodo) e (2) polarizadores de calcita duplamente refratária (CaCO3), que dispersam diferencialmente os dois planos de polarização. Exemplos dessa classe de polarizadores incluem os polarizadores de Nicol, prismas de Wollaston e polarizadores do tipo Glan, como o Glan-Foucault, Glan-Thompson e Glan-Taylor.

Considere um sistema de coordenadas XYZ, com uma solução fluorescente colocada na origem, como mostrado na Figura 5.2, onde o plano XZ está no plano da página. Nesse sistema, a luz de excitação viaja ao longo da direção X. Se um polarizador for inserido no feixe, será possível isolar uma direção única do vetor elétrico e obter luz polarizada paralela ao eixo Z, correspondente ao eixo vertical do laboratório. Essa luz de excitação será absorvida pelo fluoróforo na origem, o que gera fluorescência, tipicamente observada a 90º da direção de excitação, ou seja, ao longo do eixo Y. A direção real do vetor elétrico da emissão pode ser determinada observando-se a emissão através de um polarizador, que pode ser orientado alternativamente nas direções paralela ou perpendicular em relação ao eixo Z ou direção vertical do laboratório.

A polarização é definida como uma função das intensidades paralela (I‖) e perpendicular (I⊥) observadas, conforme mostrado pela equação 5.1:

P=I∥−I⊥I∥+I⊥P = \frac{I_{\parallel} - I_{\perp}}{I_{\parallel} + I_{\perp}}

Se a emissão for totalmente polarizada na direção paralela, ou seja, o vetor elétrico da luz de excitação for totalmente mantido, então o valor de PP será igual a +1, conforme dado pela equação 5.2:

P=1−01+0=1P = \frac{1 - 0}{1 + 0} = 1

Se a luz emitida for totalmente polarizada na direção perpendicular, o valor de PP será igual a -1, conforme dado pela equação 5.3:

P=1−01+0=−1P = \frac{1 - 0}{1 + 0} = -1

Portanto, os limites da polarização são de +1 a -1.

Outro termo frequentemente utilizado no contexto da emissão polarizada é a anisotropia, usualmente designada como rr ou AA, que é definida pela equação 5.4:

r=I∥−I⊥I∥+2I⊥r = \frac{I_{\parallel} - I_{\perp}}{I_{\parallel} + 2 I_{\perp}}

Os limites matemáticos da anisotropia são de +1 a -0,5. Dado a definição de polarização e anisotropia, pode-se mostrar que a relação entre ambos pode ser expressa pela equação 5.5:

r=23(1−P)r = \frac{2}{3} \left( 1 - P \right)

Por exemplo, os valores de PP e rr podem ser relacionados da seguinte forma:

P=0.50r=0.40P = 0.50 \quad r = 0.40

É importante notar que, em soluções, esses limites (por exemplo, +/−1 para polarização) não são totalmente alcançados devido ao princípio da fotoseleção e à distribuição de orientações para uma população de fluoróforos. Considere, como mostrado na Figura 5.3, fluoróforos na origem do sistema de coordenadas. Quando um fóton de excitação é absorvido, a nuvem eletrônica associada à molécula é alterada, criando um momento dipolar, conforme indicado na figura. A orientação desse momento dipolar em relação à estrutura nuclear e sua magnitude serão determinadas pela natureza dos substituintes da molécula. Esse momento dipolar de estado excitado também é conhecido como o dipolo de transição ou momento de transição.

De fato, se a luz de uma orientação elétrica específica (luz polarizada em plano) incide sobre uma amostra, apenas aquelas moléculas corretamente orientadas em relação a esse vetor elétrico poderão absorver luz. Especificamente, a probabilidade de absorção é proporcional ao cosseno quadrado (cos²θ) do ângulo θ entre a luz de excitação e o dipolo de transição, como mostrado na Figura 5.4. Assim, ao excitar um conjunto de fluoróforos com luz polarizada em plano, estamos realizando um processo de fotoseleção, ou seja, criando uma população de moléculas excitadas cujos dipolos excitados estão alinhados na direção da luz de excitação.

Considerando agora o caso em que o dipolo de transição correspondente à emissão de luz do fluoróforo excitado está paralelo ao dipolo de absorção (como indicado na Figura 5.6) e que o fluoróforo excitado não pode rotacionar durante a vida útil do estado excitado (por exemplo, se os fluoróforos estiverem imersos em um meio altamente viscoso), a medição da polarização da emissão será inferior a +1, uma vez que alguns dos dipolos excitados não estarão exatamente paralelos à direção da luz de excitação. De fato, o número de dipolos potenciais fazendo um ângulo θθ com o eixo vertical será proporcional ao seno θθ, como ilustrado na Figura 5.7.

Com isso, pode-se calcular que o limite superior de polarização para um conjunto aleatoriamente orientado (mas rigidamente fixado, ou seja, não rotacionando) — com dipolos de excitação e emissão colineares — seria de +1/2. Este cálculo, no entanto, está além do escopo deste texto introdutório.

Finalmente, ao considerar a absorção de luz por uma substância como o fenol, como ilustrado na Figura 5.8, observa-se que as direções dos dipolos de absorção para as transições S₀ → S₁ e S₀ → S₂ podem diferir bastante, podendo, no caso extremo, estar a 90º um do outro. Após o processo de excitação, no entanto, independentemente de qual transição tenha ocorrido, a rápida termalização deixa o fluoróforo excitado no nível S₁, fazendo com que os dipolos excitados exibam uma orientação média diferente daquela dos dipolos de absorção originalmente fotoselecionados. Como resultado, mais emissão será observada na direção perpendicular do que na direção paralela, e a polarização resultante será negativa.

Como os Probes Fluorescentes são Utilizados no Estudo de Proteínas e sua Aplicação em Estudos Biofísicos

A utilização de sondas fluorescentes para investigar proteínas tem sido um campo de interesse crescente, dada sua sensibilidade e capacidade de monitorar interações moleculares em tempo real. Dentre os métodos mais eficazes, o uso de fluoróforos extrínsecos, que podem se ligar a proteínas e modificar suas propriedades fluorescentes, tem se destacado. O processo de agregação e desnaturação de proteínas, por exemplo, é comumente estudado por meio da fluorescência, utilizando diferentes fluoróforos que variam sua intensidade dependendo das mudanças estruturais da proteína.

Um exemplo clássico é o uso do corante ThT (Thioflavin T) para estudar a agregação de proteínas como a lisozima de ovo de galinha. A intensificação da fluorescência de ThT está intimamente ligada à formação de estruturas de agregação, revelando detalhes cruciais sobre a natureza e a dinâmica dessas interações. Os experimentos podem ser realizados em diferentes condições de pH e temperatura, onde a fluorescência registrada por microscopia confocal proporciona imagens detalhadas das alterações moleculares ocorrendo com o tempo. A quantificação da fluorescência é uma ferramenta chave para avaliar a cinética dessas mudanças, como demonstrado pelos gráficos de intensidade de fluorescência em função do tempo de incubação, fornecendo dados precisos sobre o comportamento da proteína durante o processo de desnaturação.

O fenômeno de transferência intramolecular de carga (TICT), particularmente em moléculas que atuam como rotores moleculares, é outro aspecto interessante nas investigações fluorescentes. A movimentação e rotação das moléculas, que são necessárias para a transferência de elétrons entre grupos doadores e aceitadores, afeta diretamente a fluorescência observada. As sondas que demonstram esse efeito são usadas para sensoriar a viscosidade de solventes, revelando propriedades adicionais das substâncias com as quais interagem.

Além de sondas extrínsecas, existem proteínas que possuem ligações naturais a ligantes fluorescentes, como as desidrogenases que se ligam a NADH ou FAD. Esses ligantes, ao se ligarem a proteínas específicas, alteram suas propriedades de emissão, sendo muito utilizados para monitorar processos bioquímicos complexos. Esses tipos de ligantes podem ser tanto fluoróforos naturais como análogos fluorescentes que são introduzidos para facilitar a detecção.

A quantificação de proteínas é frequentemente realizada com métodos espectroscópicos tradicionais, como os ensaios de Lowry ou Bradford. No entanto, as técnicas fluorescentes têm ganhado popularidade devido à sua alta sensibilidade. O ensaio NanoOrange, por exemplo, utiliza um fluoróforo baseado em merocianina, que, embora pouco fluorescente em solução aquosa, aumenta significativamente sua intensidade ao se ligar a proteínas desnaturadas por calor. Existem também corantes fluorescentes que interagem fortemente com proteínas desnaturadas por SDS, como a série SYPRO, amplamente utilizada para visualização de proteínas em géis.

O uso de sondas fluorescentes covalentemente ligadas às proteínas tem se consolidado como uma abordagem fundamental para estudar as propriedades biofísicas das proteínas. O conceito de ligar covalentemente um fluoróforo a uma proteína remonta aos primeiros estudos de Gregorio Weber com o cloreto de dansila. Quando um fluoróforo é covalentemente ligado a uma proteína, ele permite que os pesquisadores acompanhem modificações estruturais e interações que são essenciais para entender como as proteínas funcionam em nível molecular. O cloreto de dansila é um exemplo clássico de uma sonda fluorescente que reage com aminas primárias, formando complexos estáveis com as proteínas. Um detalhe importante nesse processo é a escolha do derivado correto do fluoróforo. Por exemplo, o derivado 2,5 do cloreto de dansila tem uma vida útil de fluorescência consideravelmente mais longa do que o derivado 1,5, o que o torna mais adequado para medições de polarização, especialmente em proteínas maiores.

A reação para rotular proteínas com fluoróforos reativos, como o cloreto de sulfonila, isotiocianatos ou ésteres succinimídicos, envolve a ligação covalente do fluoróforo a um grupo amina primária na proteína. A escolha do grupo reativo é crucial, pois ele determinará a eficiência e a estabilidade da ligação. Além disso, a reação depende do pH, já que a amina primária precisa estar em sua forma não protonada para reagir adequadamente. O pH ideal para a maioria das proteínas é ligeiramente básico, na faixa de pH 8 a 9, pois a maioria das aminas de proteínas, como a lisina, tem um pKa em torno de 10 a 11.

Ao realizar experimentos de marcação fluorescente, é essencial testar as condições experimentais, como a concentração do fluoróforo, a concentração da proteína e o tempo de reação. Em muitos casos, os primeiros testes podem não produzir o nível desejado de marcação, e ajustes nas condições experimentais são necessários para otimizar a incorporação do fluoróforo. A reação de marcação pode ser influenciada por fatores como a estabilidade do fluoróforo em diferentes solventes e a solubilidade da proteína, o que exige cuidados adicionais para garantir que as condições não afetem adversamente a integridade da proteína.

Outro aspecto relevante é que o processo de marcação deve ser monitorado para garantir a pureza do conjugado final. Isso pode ser feito utilizando técnicas como cromatografia em camada fina ou espectrometria de massa, que permitem verificar a presença de impurezas ou reagentes não ligados.

Como as Proteínas Fluorescentes Transformaram a Biologia Molecular e a Ciência

A ideia enganosa de que tecidos ou papéis envelhecidos ou amarelados podem ser tornados brancos novamente ao adicionar luz azul é um conceito que se popularizou ao longo do tempo. Esse efeito de "branqueamento óptico" ganhou notoriedade na indústria de detergentes e papel, e mais recentemente, tem sido aplicado para clarear dentes. Muitos desses clareadores são baseados em stilbenos, como o ácido 4,4′-diamin-2,2′-stilbenedisulfônico, ilustrado na Figura 11.81.

Porém, a verdadeira revolução na área de fluorescência veio com a descoberta das proteínas fluorescentes, um campo que se expandiu exponencialmente nas últimas décadas. Tentando revisitar esse vasto domínio, recordo-me da história de um homem que dirige um carro muito velho até um posto de gasolina e pede para encher o tanque. O atendente, ao tentar abastecer o carro, pede para que o motorista desligue o motor, pois ele estava "indo mais rápido do que ele". Assim, ao discutir as proteínas fluorescentes recombinantes mais recentes, percebo que as descobertas avançam em um ritmo tão acelerado que, mesmo tentando estar atualizado, já estou "indo atrás" de novos desenvolvimentos.

Quando falamos em "proteínas fluorescentes", nos referimos a uma classe de proteínas inicialmente encontradas em águas-vivas e corais, com destaque para a famosa proteína fluorescente verde (GFP) de Aequorea victoria. Proteínas com fluorescência visível, no entanto, já eram conhecidas há bastante tempo. Gregorio Weber, por exemplo, em sua tese de doutorado, estudava a fluorescência de flavinas e proteínas ligadas à flavina, como a riboflavina. Muitas desidrogenases, que se ligam ao NADH, também apresentam fluorescência na região do meio-400 nm, como foi o foco de minha própria pesquisa sobre a desidrogenase malato mitocondrial.

Além disso, proteínas como as ficobiliproteínas, provenientes de cianobactérias e algas eucariotas, são incrivelmente fotostáveis, apresentando coeficientes de extinção extremamente altos — alguns superiores a 2.000.000 M−1 cm−1. O mecanismo de fluorescência dessas proteínas está relacionado aos sistemas de anéis tetrapirrolados covalentemente ligados, um exemplo claro da complexidade da fluorescência natural que pode ser encontrada no reino biológico. E, claro, as proteínas associadas à clorofila, com sua fluorescência característica, são um ponto de partida importante no entendimento das reações fotossintéticas.

A história das proteínas fluorescentes conheceu um grande avanço nos anos 1960, quando Shimomura e colaboradores descobriram a GFP, que confere à água-viva Aequorea victoria sua bioluminescência verde natural. No entanto, foi apenas nas últimas décadas que o potencial completo da GFP foi reconhecido na biologia celular, com o desenvolvimento de métodos recombinantes e a capacidade de criar inúmeras mutações na construção original da GFP. Esse processo permitiu que a GFP se tornasse uma ferramenta fundamental para a visualização e o estudo de processos celulares em tempo real.

A fluorescência da GFP, como foi notado por Kneen et al. (1998), é altamente sensível ao pH, tanto in vitro quanto in vivo. A modificação dessa sensibilidade por mutações pontuais tem sido um passo importante no aperfeiçoamento dessa ferramenta, o que possibilitou sua utilização em células transfectadas com cDNAs para marcar organelas como mitocôndrias, Golgi ou retículo endoplasmático.

O mecanismo de fluorescência da GFP é um exemplo fascinante de auto-catalisismo e reações de ciclagem envolvendo três resíduos de aminoácidos essenciais: Ser65, Tyr66 e Gly67. A fluorescência observada não resulta de uma reação externa, mas de um processo interno e auto-sustentado, onde a interação desses aminoácidos em uma estrutura de barril ß cria o cromóforo necessário para a emissão de luz verde. Esse processo único só ocorre devido ao ambiente estruturado da GFP.

A função biológica da GFP é presumivelmente absorver um fóton emitido pela aequorina, uma proteína isolada de Aequorea victoria que catalisa a quimioluminescência na presença de cálcio. Ao absorver o fóton azul (~470 nm) do complexo com aequorina e reemitir um fóton verde (~520 nm), a GFP realiza um deslocamento da emissão para comprimentos de onda mais longos, uma adaptação que provavelmente traz vantagens biológicas. O fóton verde, em comparação com o azul, é menos suscetível aos processos de espalhamento, o que permite que ele percorra distâncias maiores no ambiente marinho, transmitindo informações sobre possíveis perigos.

Durante os anos 1990, biólogos moleculares começaram a preparar proteínas quiméricas contendo GFP, o que permitiu a observação dessas proteínas em microscopia fluorescente. Mais recentemente, novas classes de proteínas fluorescentes intrínsecas foram descobertas em corais, como as de Discosoma, além de outros organismos. Um exemplo bem caracterizado é a proteína fluorescente vermelha drFP593, mais comumente conhecida como DsRed. Essas proteínas, como a GFP, geram o moiety fluorescente a partir dos aminoácidos presentes na sequência primária e emitem luz em comprimentos de onda mais longos (deslocamento para o vermelho) em relação à GFP. Alterações na sequência primária da GFP resultaram em variantes com propriedades espectrais diversas, como emissões azul ou vermelho deslocadas, maiores rendimentos quânticos e, mais recentemente, uma melhoria significativa na fotostabilidade.

Esses avanços foram fundamentais para o desenvolvimento de novas ferramentas biotecnológicas, como as proteínas fluorescentes amarelas (YFP), cianas (CFP) ou verdes aprimoradas (EGFP), que permitem o rastreamento de múltiplas proteínas quiméricas em células vivas. As mutações em DsRed também resultaram em mudanças semelhantes nas propriedades espectrais. A criação de proteínas fluorescentes derivadas de frutas, como mCherry e mPlum, também se tornou extremamente popular, com muitos de seus espectros caracterizados por laboratórios especializados, como o de Roger Tsien.

Uma preocupação importante com a GFP é sua tendência a formar dímeros, o que pode interferir na interação dessas proteínas com outras moléculas conjugadas. No entanto, diversas mutações foram introduzidas para reduzir essa dimerização, como a mutação A206K, que é comum em muitos constructos de GFP, e mais recentemente a mutação F223D, que tem mostrado ser eficaz nesse sentido.

A aplicação de proteínas fluorescentes na biologia molecular e celular tem proporcionado uma compreensão sem precedentes da dinâmica celular. O uso dessas proteínas para rastrear interações entre proteínas, identificar localizações celulares e estudar processos biológicos em tempo real tem aberto novas fronteiras para a ciência. As mutações nas proteínas fluorescentes continuam a ser um campo de intenso estudo, com novas variantes sendo desenvolvidas para melhorar a sensibilidade, a fotostabilidade e as propriedades espectrais dessas ferramentas essenciais.

Como a Contagem de Fótons Afeta a Precisão nas Medidas de Espectrofluorimetria

Ao trabalhar com espectrofluorímetros que utilizam métodos de contagem de fótons, é essencial compreender a influência do número de fótons coletados na precisão dos resultados. Muitos usuários subestimam a importância das estatísticas de contagem, especialmente em experimentos que envolvem medições de polarização. A precisão de uma medida baseada em contagem de fótons é diretamente dependente da raiz quadrada do número total de fótons detectados.

Por exemplo, em um instrumento dedicado para medições de polarização, foi demonstrado que ao coletar cerca de 10.000 fótons, a precisão da determinação de polarização se situava em torno de 0,008. Quando esse número aumentou para um milhão de fótons, a precisão melhorou significativamente, chegando a 0,0008. Isso evidencia que a busca por maior precisão requer um incremento substancial no número de fótons contados. Portanto, que realiza medições por contagem de fótons deve sempre considerar que a obtenção de resultados confiáveis passa inevitavelmente pela ampliação do tempo de coleta ou pela otimização dos sistemas para maximizar o fluxo de fótons.

Outro ponto crucial para garantir a qualidade dos dados é a seleção adequada dos filtros ópticos, especialmente na configuração dos caminhos de excitação e emissão. Um teste prático para avaliar a eficiência do filtro de emissão consiste em colocá-lo no caminho de excitação e verificar se a luz de excitação não ultrapassa o filtro. Caso o filtro seja eficaz, o sinal detectado neste arranjo deve estar próximo ao nível do ruído de fundo (dark count). Esse cuidado evita a contaminação do sinal por luz não desejada, assegurando a fidelidade da medida de fluorescência.

Além disso, a sensibilidade dos detectores empregados, como fotodiodos avalanche ou contadores de fótons, depende da correta otimização dos parâmetros instrumentais. A compreensão da resposta espectral dos filtros, a eficiência quântica dos detectores e o manejo de ruídos de fundo são fundamentais para assegurar que o sinal registrado seja representativo da amostra analisada.

O rigor na coleta e análise dos dados ganha ainda mais importância diante das variações naturais nos processos fluorescentes, como quenching dinâmico, variações na intensidade de excitação e emissões provenientes de diferentes estados eletrônicos. A consideração cuidadosa dessas variáveis aliada à coleta de um número adequado de fótons permite construir perfis espectrais confiáveis, essenciais para interpretações quantitativas e qualitativas precisas.

A compreensão profunda da relação entre o número de fótons e a precisão do experimento transcende a simples operação técnica do equipamento. Ela fundamenta a interpretação crítica dos resultados, possibilitando distinguir variações reais do ruído estatístico inerente à técnica. Essa distinção é vital em aplicações que exigem alta sensibilidade e acurácia, como estudos de interações moleculares, conformações proteicas e dinâmica de membranas celulares.

Para além da mera coleta de dados, é indispensável que o usuário tenha consciência da importância do planejamento experimental, visando maximizar a eficiência da captação de fótons. Isso inclui a escolha criteriosa de sondas fluorescentes com alta eficiência quântica, a otimização do alinhamento óptico e a minimização das perdas por dispersão ou absorção. Somente assim é possível alcançar níveis elevados de precisão e reprodutibilidade, fundamentais para avanços confiáveis nas pesquisas que utilizam espectrofluorimetria.

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