Hvordan gjennomføres digital dråpe-PCR for påvisning av mutasjoner i ctDNA?

Digital dråpe-PCR (ddPCR) representerer en presis og sensitiv metode for kvantitativ påvisning av spesifikke mutasjoner i sirkulerende tumor-DNA (ctDNA) isolert fra pasientens blodprøver. Den molekylære prosessen starter med identifisering og prioritering av relevante mutasjoner i tumorvev eller tidligere flytende biopsier, basert på klonalitet og antatt drivermutasjonspotensial. For hver identifisert mutasjon utvikles det en spesifikk ddPCR-probe og primer-sett – enten kommersielt tilgjengelig eller skreddersydd – med utgangspunkt i sekvensen til den muterte allelen.

Etter konstruksjon av dråpene ved hjelp av Bio-Rad AutoDG QX200-systemet, gjennomføres PCR-reaksjonene med TaqMan hydrolyse-kjemi. Dråpefordelte reaksjoner amplifiseres ved bruk av en C1000 Touch™ termisk sykler og analyseres fluorometrisk i QX200 dråpeleser. Ved hjelp av QuantaSoft Pro-programvaren tilpasses antallet positive dråper til en Poisson-fordeling for å estimere antall kopier av både mutert og villtype-DNA. Dette gir en ekstremt nøyaktig og kvantitativ vurdering av tumorbyrde i blodprøven.

Materialene som benyttes i prosessen er optimalisert for høy reproduserbarhet og minimal kontaminasjonsrisiko. Blodprøver samles i spesialiserte Streck Cell-Free DNA BCT-rør, som stabiliserer DNA i opptil syv dager ved romtemperatur. Plasma separeres fra blodet gjennom en totrinns sentrifugering – først ved 1200 xg og deretter ved 3200 xg – med særlig forsiktighet for å unngå kontaminasjon fra buffy coat eller cellepellet. Typisk kan ett fullt blodrør generere omtrent 4 ml plasma, som brukes videre i ekstraksjonen.

DNA-ekstraksjonen skjer ved hjelp av magnetisk kulebasert teknologi med Thermo MagMax-kits, integrert i en automatisert Hamilton Nimbus plattform. Denne automatiseringen gir et standardisert og håndfritt ekstraksjonsforløp, som reduserer operatøravhengige variasjoner og øker sporbarheten. I forkant av selve ekstraksjonen behandles plasmaet med proteinase K og SDS ved 60 °C for effektiv lysering, etterfulgt av kjøling. Det ferdige DNA-et elueres i 50 µl og er klart for videre analyse i ddPCR.

Laboratoriets utforming spiller en avgjørende rolle i kvalitetssikringen. Et ensrettet arbeidsflyt er implementert med fysisk separerte soner for prøveforberedelse, PCR-oppsett og amplifikasjon. Dette bidrar til å eliminere krysskontaminering og opprettholde integriteten til resultatene. Separate rom med positivt trykk og HEPA-filtrert luft benyttes for PCR-oppsett, og dedikert utstyr og forbruksartikler anvendes i hver sone. Rommet for håndtering av positive kontroller er fysisk adskilt fra resten av laboratoriet, og bruk av plasmid-DNA er eksplisitt forbudt.

Strenge laboratorieprosedyrer er implementert for å støtte denne teknisk krevende metoden. Engangs frakker, hyppig hanskebytte, bruk av PCR-kvalitetstips med lav binding, og rengjøring med 70 % etanol etterfulgt av DNA-nedbrytende reagenser er standard praksis. Arbeidsstasjoner utstyres med UV-desinfeksjon og alt avfall håndteres i forseglede beholdere for å unngå aerosolisering eller overføring av kontaminanter.

For leseren er det vesentlig å forstå at digital dråpe-PCR ikke bare er en teknikk, men et samspill mellom molekylær presisjon, streng logistikk, og ekstremt god laboratoriepraksis. Sensitiviteten til metoden tillater påvisning av mutasjoner i svært lave konsentrasjoner, men dette setter også krav til fullstendig kontroll over prøvehåndtering, reagenskvalitet og omgivelseshygiene. Det finnes ingen plass for tilfeldigheter i denne typen diagnostikk. Alt må planlegges og valideres med utgangspunkt i både biologisk variasjon og teknologisk robusthet. Det er dette som skiller forskning fra klinisk anvendelse.

Hvordan RT-digital PCR kan forbedre diagnostisering og behandling av kreft

Metodene for diagnostisering og overvåking av kreft har gjennomgått betydelige forbedringer i løpet av de siste årene, spesielt med fremveksten av avanserte teknologier som RT-digital PCR. Denne teknikken er spesielt nyttig i analysen av små biologiske enheter som ekstracellulære vesikler (EV-er), som bærer biologisk informasjon som kan brukes til å oppdage krefttidlig og overvåke behandlingseffekter. Bruken av digital PCR (dPCR) gir enestående følsomhet og presisjon, noe som gjør det mulig å oppdage genetiske endringer i blodprøver, og dermed eliminere behovet for invasive biopsier.

For å gjennomføre en vellykket RT-digital PCR, benyttes en QIAcuity-enhet fra Qiagen, som gir nøyaktige målinger av spesifikke genetiske rearrangementer i plasma fra pasienter med ulike typer kreft. I studier som involverer Ewing sarkom, brukes for eksempel RT-digital PCR til å kvantifisere EWS/FLI-1 rearrangementer, som er et kjennetegn ved denne typen sarkom. Tilsvarende brukes teknologien i diagnostisering av KRAS-mutasjoner i plasma fra pasienter med pancreas ductal adenocarcinoma (PDAC), som er et annet svært aggressivt kreftsykdom.

En viktig fordel med RT-digital PCR er dens evne til å bruke svært små mengder cDNA som input, som deretter kan amplifiseres og kvantifiseres for å identifisere og analysere spesifikke genetiske markører. Dette gir ikke bare et verdifullt verktøy for tidlig deteksjon, men også for å overvåke sykdomsforløp og respons på behandling. Ved å analysere de ekstracellulære vesiklene som finnes i plasma, kan man få innsikt i kreftcellens genuttrykk uten behov for invasiv vevsprøvetaking.

I tilfellet med hepatocellulært karcinom (HCC) kan flere spesifikke mRNA-markører kvantifiseres samtidig ved hjelp av RT-droplet digital PCR. Dette gir en svært detaljert analyse av biomarkører som alfa-fetoprotein (AFP) og glypican-3 (GPC3), som har vist seg å være nyttige i diagnostisering og overvåking av HCC. På samme måte kan prostata kreft (PCa) markører som ACP3, KLK3 og FOLH1 også analyseres, og gir informasjon om sykdomsprogresjon, både for lokal og metastatisk sykdom.

I tillegg til de tekniske aspektene, er det viktig å merke seg at analysen av plasmaekstrakter fra pasienter kan brukes til å sammenligne og validere biomarkørprofiler. For eksempel, i studien som undersøker PDAC, ble plasmaekstrakter sammenlignet med vevsprøver fra samme pasienter for å se på sammenhengen mellom plasma- og vevsbaserte biomarkører. Dette gir ytterligere validering av metoden og forbedrer påliteligheten av digitale PCR-resultater.

Studier som involverer HCC og levercirrhose-pasienter, for eksempel, har vist hvordan tidlig diagnose kan forbedres gjennom en slik metodikk. For HCC-pasientene er det en klar forskjell mellom pasientene med tidlig sykdom og de med avansert levercirrhose, og digital PCR kan bidra til å identifisere tidlige biomarkører før mer invasiv behandling blir nødvendig.

Endelig er det også viktig å vurdere de etiske og praktiske aspektene ved bruken av slike teknologier. Deltakerne i disse studiene har gitt informert samtykke, noe som er avgjørende for både etiske og juridiske hensyn. Håndtering av pasientdata og personvern må alltid tas i betraktning for å sikre at teknologien brukes på en ansvarlig måte.