Hoe Fluorescentie wordt Gebruikt in de Wetenschappen en Geneeskunde

Fluorescentie is een fysisch en chemisch verschijnsel dat tegenwoordig op grote schaal wordt toegepast in de chemie, natuurkunde en levenswetenschappen. Dankzij de voortdurende vooruitgangen in de chemie van fluorescerende stoffen en de ontwikkeling van nieuwe technologieën voor fluorescentie-microscopie, zijn de toepassingen van fluorescentie in uiteenlopende wetenschappelijke domeinen sterk toegenomen. Dit heeft geleid tot een hernieuwde belangstelling voor het begrijpen van de fundamenten van het fenomeen fluorescentie en de mechanismen die ten grondslag liggen aan het gebruik ervan in de wetenschap en geneeskunde.

Fluorescentie ontstaat wanneer een molecuul wordt aangeslagen door licht van een specifieke golflengte en vervolgens energie afgeeft in de vorm van licht met een langere golflengte. Dit proces is afhankelijk van de eigenschappen van het molecuul, zoals de elektronische structuur en de omgeving waarin het zich bevindt. Fluorescentie kan dus een krachtig hulpmiddel zijn voor het bestuderen van moleculaire interacties en structuren, en wordt veel gebruikt in de moleculaire biologie, biochemie, biophysica en klinische diagnostiek.

De werking van fluorescentie is sterk afhankelijk van verschillende factoren zoals de excitatie- en emissiegolflengten, de kwantumopbrengst van het molecuul en de dynamiek van de elektronovergangen. Fluorescentie kan bijvoorbeeld in een levendige vorm worden gemeten door de spectrale gegevens van een molecuul, waarbij zowel de emissie- als de excitatie spectrums van belang zijn. Het begrijpen van deze spectrale eigenschappen is essentieel voor het correct toepassen van fluorescentie in wetenschappelijke experimenten.

Een bijzonder interessante vooruitgang in de fluorescence-technologie is het gebruik van super-resolutie microscopie en technieken voor single-molecule detectie. Deze innovaties maken het mogelijk om moleculaire interacties te bestuderen met een resolutie die veel verder gaat dan de limieten van conventionele optische microscopen. Dit heeft de deur geopend voor nieuwe ontdekkingen in de biochemie en cellulaire biologie, zoals het bestuderen van eiwitcomplexen in hun natuurlijke context.

Naast de vooruitgangen in de technologie en methoden, is het cruciaal om de beperkingen van fluorescentie te begrijpen. Fluorescentie kan bijvoorbeeld worden beïnvloed door de moleculaire omgeving, zoals de polariteit of viscositeit van het medium waarin het molecuul zich bevindt. Evenzo kunnen factoren zoals fotobleaching en achtergrondfluorescentie de interpretatie van experimenten bemoeilijken. Dit benadrukt de noodzaak voor nauwkeurige controle over experimentele omstandigheden en de juiste keuze van fluorescentieprobes.

Het begrijpen van de fysische basisprincipes achter fluorescentie is dus essentieel voor een effectief gebruik ervan in wetenschappelijke toepassingen. Voor onderzoekers is het belangrijk om niet alleen de basisprincipes van fluorescentie te begrijpen, maar ook de praktische overwegingen bij het ontwerp van experimenten, zoals het kiezen van de juiste fluoroforen en het beheersen van experimentele variabelen die de kwaliteit van de gegevens kunnen beïnvloeden. Bovendien moeten onderzoekers rekening houden met de mogelijke interferentie van andere factoren, zoals autofluorescentie van biologische monsters, die de resultaten van fluorescentiemetingen kunnen verstoren.

Een ander belangrijk aspect is de toepassing van fluorescentie in de diagnostiek. Fluorescente probes worden steeds vaker gebruikt in diagnostische technieken zoals immunofluorescentie en fluorescentiemicroscopie. In de medische wetenschap worden ze gebruikt om specifieke biomoleculen te detecteren die geassocieerd zijn met ziekten, zoals kankercellen of virale infecties. Het gebruik van fluorescentie maakt het mogelijk om diagnostische procedures nauwkeuriger en gevoeliger te maken, en biedt bovendien de mogelijkheid voor vroegtijdige detectie van ziekten.

Om optimaal gebruik te maken van fluorescentie in de wetenschap en geneeskunde, is het van cruciaal belang dat onderzoekers de juiste fluorescentie-technieken beheersen en begrijpen hoe ze de eigenschappen van fluorescerende stoffen kunnen aanpassen aan hun specifieke onderzoeksbehoeften. Dit vraagt om gedetailleerde kennis van zowel de chemische als fysische aspecten van fluorescentie, evenals de nieuwste technologische innovaties die de toepassing ervan mogelijk maken.

Hoe Lichtabsorptie en Lichtverstrooiing de Meting van Eiwitconcentraties Beïnvloeden

Mie-verstrooiing, genoemd naar Gustav Mie, ontstaat door verstrooiing door aerosolen, d.w.z. sferische deeltjes waarvan de afmetingen gelijk zijn aan of groter dan de golflengte van licht (hoewel Mie-verstrooiing in theorie geen strikte bovengrens heeft). Diverse methoden zijn voorgesteld om de lichtverstoring door eiwitaggregaten of andere deeltjes te corrigeren, zodat nauwkeurigere concentratiemeting via ultraviolet (UV) spectroscopie en de Beer–Lambert-wet mogelijk wordt. Lichtverstoring (troebelheid) wordt vaak gebruikt om celgroei te monitoren. Meestal worden deze metingen uitgevoerd met zichtbaar licht nabij 600 nm, omdat men niet de complicatie van celchromoforen wil die bijdragen aan de optische dichtheid.

Wanneer men de aggregatie van een puur eiwit wil volgen, is het het beste om een golflengte rond de 330 nm te gebruiken, aangezien dit niet wordt geabsorbeerd door het eiwit (ervan uitgaande dat het eiwit geen endogene chromoforen zoals porfyrine, FAD of NADH bevat) en omdat lichtverstoring toeneemt naarmate de golflengte afneemt. Een voorbeeld van het gebruik van troebelheid om een eiwitaggregatieproces te volgen, wordt getoond in Figuur 2.11.

De verschuivingen in absorptiespectra die door deze aggregaten worden veroorzaakt, kunnen zowel voor- als nadelen hebben, afhankelijk van het specifieke experiment en de doelen van de onderzoeker. Aggregaten kunnen leiden tot een verschijnsel dat bekendstaat als Aggregation-Caused Quenching (ACQ), wat de fluorescentie van de moleculen vermindert. Echter, recent onderzoek heeft ook geleid tot de ontdekking van een tegengesteld fenomeen: Aggregation-Induced Emission (AIE). Dit heeft de weg vrijgemaakt voor nieuwe toepassingen in de fotonische en opto-elektronische industrieën, met name voor materialen die gebruikt worden in fotodetectoren en kleurstoflasers.

Hoe Fluorescentie-Lifetime Metingen te Begrijpen: Tijd- en Frequentiedomein Methodes in Fluorescentie Spectroscopie

In de studie van fluorescentie, worden er vaak twee hoofdmethoden gebruikt om de "lifetime" van de fluorescerende deeltjes te meten: de tijd-domein methode en de frequentie-domein methode. De tijd-domein methode, die oorspronkelijk door Seymour Steven Brody in 1957 werd geïntroduceerd, maakt gebruik van korte lichtpulsen om de emissie-intensiteit van een fluorescerend monster na een excitatie te registreren. De belangrijkste motivatie achter Brody's werk was het meten van de levensduur van chlorofylfluorescentie, een onderwerp dat hij later uitgebreid bespreekt in zijn review (Brody, 2002). Aanvankelijk werden deze pulsen gegenereerd door flitslampen, die afhankelijk van het type gas dat ze bevatten, een specifieke spectraaldistributie vertoonden. In de huidige technologie worden pulsen met een duur van enkele picoseconden of minder gegenereerd door moderne laserbronnen, en synchrotronstraling wordt ook vaak gebruikt vanwege de breedte van het lichtspectrum dat het levert, van het verre-infrarood tot de röntgenstralen.

De fluorescentie-lifetime, aangeduid als τ, is de tijd die verstrijkt voordat de intensiteit van de fluorescente emissie afneemt tot 1/e van de oorspronkelijke waarde. Deze afname van de intensiteit met de tijd kan worden beschreven door de relatie:

waarbij $I(t)$ de intensiteit is op tijd $t$, $\alpha$ een normalisatieterm is, en $\tau$ de levensduur. Een veelgebruikte methode om de fluorescentie-afname weer te geven is de logaritmische schaal, die duidelijk maakt hoe de intensiteit in de loop van de tijd afneemt. Indien de afname een enkel-exponentiële curve volgt, kan de levensduur eenvoudig worden berekend uit de helling van de curve. Wanneer de duur van de excitatiepuls vergelijkbaar is met de levensduur van de fluorescentie, moeten echter deconvolutiemethoden worden toegepast om de levensduur nauwkeurig te bepalen. Met de vooruitgang in snelle laserpulsen is het gebruik van deze deconvolutiemethoden tegenwoordig minder essentieel, behalve wanneer de levensduur vergelijkbaar is met de pulslengte.

Tijd-correlatie van enkel-foton telling (TCSPC) is een techniek die de intenseris van fluorescentie-emissie in de tijd nauwkeurig kan meten. Dit wordt geïllustreerd in de gegevens voor anthracene in cyclohexaan, waarbij de levensduur kan worden bepaald uit het aantal tijdkanalen tussen de excitatie en het 1/e punt van de afname van de intensiteit. De techniek maakt gebruik van foton-tellers om de fluorescente signalen te registreren, die op verschillende tijdsintervallen worden verzameld, wat het mogelijk maakt om zeer gedetailleerde informatie over de levensduur te verkrijgen.

Helaas kunnen de meeste fluorescentie-lifetimes van biologische systemen, zoals eiwitten of membranen, niet worden gekarakteriseerd door een enkel-exponentiële afname. Dit komt vaak doordat de fluoroforen zich in verschillende omgevingen bevinden of door subtiele interacties met hun omgeving, wat resulteert in complexe (meerdere) afnames van de intensiteit. In het geval van eiwitten met meerdere tryptofanen bijvoorbeeld, kunnen de fluoroforen zich in verschillende omgevingen bevinden, waardoor een heterogeniteit van de levensduur ontstaat. Bij complexe afnames is de relatie tussen intensiteit en tijd na excitatie als volgt:

waarbij elk $\tau_i$ een verschillende levensduurcomponent vertegenwoordigt. Deze complexiteit is typisch voor biologische monsters, waar meerdere fluorescentiecomponenten tegelijkertijd aanwezig kunnen zijn.

Naast de tijd-domein benadering, wordt in de frequentie-domein methode de lichtintensiteit gemoduleerd met een sinusgolf op een hoge frequentie. Deze techniek werd voor het eerst ontwikkeld door Gregorio Weber en verder verfijnd door Enrico Gratton. In plaats van pulsen te gebruiken, wordt het excitatielicht continu gemoduleerd, wat resulteert in een fasetransfer van de emissie ten opzichte van de excitatie. Het meten van deze fasetraagheid kan de levensduur van de fluoroforen opleveren. De relatie die de gefaseerde emissie beschrijft is:

waarbij $\Phi$ de faseverschuiving is tussen de excitatie en de emissie. Het meten van deze faseverschuiving is een directe manier om de levensduur te bepalen. De frequentie-domein methode biedt voordelen, zoals de mogelijkheid om snel meerdere componenten van de levensduur te analyseren door de modulatie van lichtbronnen zoals LED's of laserdioden.

Hoe de Phasor Methode de Fluorescentie Spectroscopie Transformeert

De phasortransformatie heeft zijn oorsprong in de elektrotechniek, waar het werd uitgevonden door Charles Proteus Steinmetz in 1865. Dit concept, dat oorspronkelijk werd gebruikt om de analyse van RLC-circuits te vereenvoudigen, heeft zich inmiddels ook bewezen in de fluorometrie, vooral in de analyse van fluorescente eigenschappen van biologische systemen. Het gebruik van phasors in de fluorescentspectroscopie biedt een visuele en modelonafhankelijke benadering voor het verwerken van gegevens, wat het mogelijk maakt om complexe systemen eenvoudiger te analyseren.

Het fundament van de phasorbenadering in de fluorometrie is het principe van reciprociteit, wat inhoudt dat complexe fluorescente vervalgegevens kunnen worden omgezet in een geometrische weergave die niet afhankelijk is van aanpassingsmodellen. Dit maakt het een krachtig hulpmiddel voor het analyseren van fluïditeit en moleculaire interacties in biologische systemen, zoals cellen of weefsels. Wat deze benadering zo aantrekkelijk maakt, is de eenvoud en de robuustheid ervan: de phasorplot is uniek voor elk systeem en wordt goed gereproduceerd, wat het ideaal maakt voor het beoordelen van moleculaire interacties zonder dat er uitgebreide modellering nodig is.

De eerste twee soorten phasors die we zullen bespreken zijn de levensduur-phasors en de spectrale phasors. Levensduur-phasors worden voornamelijk gebruikt voor de verwerking van tijd-resolved data, terwijl spectrale phasors zich richten op de analyse van spectrale gegevens. Deze benaderingen zijn van cruciaal belang bij het bestuderen van biologische systemen omdat ze het mogelijk maken om belangrijke biologische toestanden, zoals metabolisme en oxidatieve stress, te visualiseren en te interpreteren op basis van de fluorescente eigenschappen van de weefsels.

De phasorplot zelf is een grafische representatie van deze gegevens, waarbij de S- en G-waarden worden weergegeven op een eenheidscirkel, ook wel de "universele cirkel" genoemd. Alle enkel-exponentiële levensduren zullen ergens op deze cirkel liggen. Kortere levensduren bevinden zich bij hogere G-waarden, terwijl langere levensduren dichter bij de oorsprong liggen. In het geval van mengsels van fluoroforen die elk een enkele exponentiële levensduur vertonen, kunnen de gecombineerde phasorpunten op een rechte lijn liggen die de individuele componenten verbindt, wat helpt bij het scheiden van de verschillende componenten in het mengsel.

De kracht van de phasormethode ligt in zijn vermogen om zeer gedetailleerde informatie te verkrijgen zonder gebruik te maken van complexe modellering of aannames over de onderliggende kinetiek van fluorescente systemen. Dit maakt het een uitstekende keuze voor het analyseren van heterogene systemen die typisch worden aangetroffen in biologische samples, waar meerdere fluorescerende componenten vaak samenkomen.

Een andere cruciale stap in de vooruitgang van phasor-analyse is de beschikbaarheid van open-source software, zoals PhasorPy, een Python-bibliotheek die specifiek is ontwikkeld voor de analyse van fluorescente levensduur- en hyperspectrale beelden. Dit stelt onderzoekers in staat om de phasorbenadering snel en effectief toe te passen op grote datasets die voortkomen uit complexe biologische experimenten. Tools zoals FLUTE, een grafische gebruikersinterface voor interactieve phasoranalyse, versterken deze mogelijkheden verder, waardoor een breder scala aan toepassingen in biologische en biomedische wetenschappen mogelijk wordt.

Wanneer men kijkt naar de praktische toepassingen van deze technologie, wordt duidelijk dat het gebruik van phasors in de fluorescence spectroscopie niet alleen de kwantitatieve metingen verbetert, maar ook diepgaande inzichten biedt in de moleculaire dynamiek van biologische systemen. Het stelt onderzoekers in staat om fundamentele biologische processen visueel en kwantitatief te interpreteren, wat vooral belangrijk is voor het begrijpen van complexe biologische fenomenen zoals eiwit-interacties, celmetabolisme, en ziekteprocessen.