Nel contesto delle tecniche moderne di imaging biomedico, la generazione di immagini virtuali attraverso l'uso di reti neurali generative ha aperto nuove possibilità nell'analisi e visualizzazione dei campioni tissutali. Tecnologie come Pix2pix e CycleGAN sono alla base di approcci innovativi per la colorazione virtuale, un processo che consente di trasformare immagini acquisite senza coloranti, come quelle ottenute tramite l'Ultraviolet Photoacoustic Microscopy (UV-PAM), in immagini simili a quelle ottenute con la colorazione H&E tradizionale (ematossilina ed eosina). Questo approccio è particolarmente utile quando non è possibile o pratico ottenere immagini colorate direttamente, permettendo così di analizzare campioni tissutali senza il bisogno di trattamenti invasivi o complessi.

Pix2pix è un modello di rete neurale generativa avversaria condizionata (cGAN) che impiega due componenti principali: un generatore (G) e un discriminatore (D). Il generatore ha il compito di tradurre l'immagine di dominio X (in questo caso, immagini UV-PAM non colorate) in un'altra immagine di dominio Y (le immagini colorate H&E). Quando l'immagine UV-PAM x viene fornita al generatore, esso produce un'immagine virtuale H&E. Il discriminatore, invece, ha la funzione di distinguere tra immagini reali H&E e quelle generate, cercando di classificare correttamente ogni immagine come "reale" o "finta". L'obiettivo del generatore è quello di minimizzare la probabilità che il discriminatore riesca a classificare correttamente le immagini generate, mentre il discriminatore cerca di massimizzare la propria capacità di distinguere correttamente le immagini reali da quelle sintetiche. Questo processo di apprendimento avviene tramite la minimizzazione di una funzione di perdita, che comprende la penalizzazione di errori di classificazione e la minimizzazione della differenza tra l'immagine generata e l'immagine di riferimento reale tramite un termine di errore L1.

Tuttavia, l'implementazione di Pix2pix per la colorazione virtuale può incontrare delle difficoltà pratiche. Una delle sfide principali è la necessità di allineare perfettamente le immagini UV-PAM non colorate con le immagini H&E reali, una condizione necessaria affinché il modello di rete possa apprendere correttamente. La preparazione di coppie di immagini etichettate richiede che le immagini siano perfettamente allineate a livello di pixel, il che può risultare particolarmente complicato quando si lavora con campioni più spessi o quando i campioni subiscono deformazioni durante la colorazione o altre fasi di preparazione.

Per risolvere questo problema, è stato introdotto il modello CycleGAN, una rete generativa avversaria che non richiede coppie di immagini perfettamente allineate. CycleGAN si basa su due generatori e due discriminatori, e introduce una perdita di coerenza ciclica che consente al modello di mappare un dominio di immagini (ad esempio, le immagini UV-PAM) in un altro dominio (come le immagini H&E) e viceversa. Questo processo avviene senza la necessità di immagini corrispondenti etichettate. Il primo generatore trasforma le immagini UV-PAM in immagini H&E, mentre il secondo trasforma le immagini H&E in immagini UV-PAM. I discriminatori hanno il compito di classificare correttamente le immagini come reali o false, sia nel dominio UV-PAM che in quello H&E. La coerenza ciclica assicura che l'immagine trasformata ritorni al suo stato originale dopo due passaggi, migliorando così la qualità della trasformazione. CycleGAN si avvantaggia di una perdita di tipo least square, che penalizza gli errori maggiori in modo più incisivo rispetto alla perdita logaritmica tradizionale, evitando così i problemi di gradienti scomparsi che potrebbero verificarsi quando le immagini generate sono molto lontane dalle immagini reali.

La capacità di CycleGAN di lavorare con dati non allineati lo rende particolarmente adatto per l'elaborazione di campioni tissutali spessi, come nel caso dei cervelli di topo o di tessuti ossei umani. Ad esempio, è stato dimostrato che CycleGAN è in grado di generare immagini H&E virtuali da immagini UV-PAM di tessuti cerebrali di topo freschi e spessi, superando le difficoltà di preparazione e allineamento delle immagini tradizionali.

La metodologia di CycleGAN non solo facilita la generazione di immagini virtuali da tessuti spessi, ma apre anche la strada a nuovi approcci nella histologia digitale. Nonostante queste tecnologie siano ancora in fase di sviluppo, esse promettono di rivoluzionare la medicina diagnostica, permettendo una visualizzazione precisa e rapida delle caratteristiche tissutali senza la necessità di processi laboriosi e invasivi.

L'approccio della colorazione virtuale attraverso Pix2pix e CycleGAN si pone, dunque, come una tecnica promettente per il futuro, specialmente nei contesti dove la manipolazione fisica dei campioni è limitata. Tuttavia, affinché tali tecniche possano essere adottate con successo in ambienti clinici, è fondamentale che venga ulteriormente affinata la capacità di generare immagini accurate anche in condizioni di varianza elevata tra i campioni, e che l'affidabilità dei modelli di machine learning venga validata su set di dati più ampi e diversificati. Inoltre, è importante considerare che questi approcci, pur essendo avanzati, richiedono ancora una solida comprensione dei principi di base della rete neurale e delle tecniche di image processing per essere implementati in modo efficace.

Come l'eccitazione in confinamento di stress influisce sulla generazione di segnali fotoacustici

La condizione di eccitazione in confinamento di stress riveste un ruolo fondamentale per la generazione efficace dei segnali fotoacustici. In particolare, il valore di dc, che rappresenta la dimensione dell'area riscaldata, è determinato dalla zona in cui la luce viene assorbita e il calore viene generato, non confondendola con l'area in cui la luce viene illuminata. Qualora la struttura di interesse che assorbe la luce (come vasi sanguigni o nanoparticelle d'oro) sia identificabile, si può utilizzare la dimensione di tale oggetto come parametro per determinare il valore di dc. In casi in cui l'assorbitore sia omogeneo o la sua struttura non identificabile, come nel caso di una soluzione di inchiostro, il valore di dc può essere approssimato dalla costante di decadimento dell'energia ottica depositata. In situazioni in cui entrambe queste condizioni si applicano, il valore di dc corrisponde alla quantità minore tra la dimensione della struttura di interesse e la costante di decadimento dell'energia ottica depositata.

Una volta che il laser ha eccitato il materiale e la luce è stata assorbita, la regione riscaldata subisce un'espansione volumetrica. L'espansione volumetrica frazionaria della regione riscaldata può essere espressa attraverso l'equazione (2.3), dove V è il volume della regione riscaldata, dV è il cambiamento di volume, κ è la compressibilità isoterma (Pa−1), p è il cambiamento di pressione (Pa), β è il coefficiente termico di espansione del volume (K−1) e ∆T è la variazione di temperatura (K). Nel caso in cui la durata dell'impulso laser sia inferiore sia al tempo di rilassamento termico che al tempo di rilassamento dello stress, l'eccitazione del laser si trova in un contesto di confinamento termico e dello stress (tp ≪ τth e tp ≪ τs). In tale scenario, l'espansione volumetrica frazionaria può essere trascurata e l'aumento iniziale della pressione (p0) può essere ottenuto attraverso l'equazione (2.4).

L'aumento della temperatura locale può essere descritto come segue: (2.5), dove ηth rappresenta la percentuale di luce convertita in calore, Ae è l'energia ottica specifica assorbita (J/m3), CV è la capacità termica specifica a volume costante, ρ è la densità di massa. Dopo aver sostituito l'equazione (2.6) nell'equazione (2.5), si ottiene l'equazione (2.6). Definendo un parametro dimensionale di Grueneisen come (2.7), l'equazione (2.6) diventa (2.8). Ae è proporzionale alla fluence ottica locale F, quindi l'equazione (2.8) diventa (2.9), dove μa è il coefficiente di assorbimento ottico. Γ ed ηth dipendono dal tipo di tessuto, ma sono generalmente considerati costanti. Pertanto, l'aumento iniziale della pressione p0 è proporzionale a μa e F. Se possiamo misurare p0 e F è noto, possiamo determinare μa. Tuttavia, in molte situazioni, la fluence all'interno del tessuto è sconosciuta, il che rende difficile ottenere valori precisi di μa.

Anche se trattiamo il parametro di Grueneisen Γ come costante, in realtà questo dipende dalla compressibilità isoterma, dal coefficiente termico di espansione del volume, dalla densità di massa e dalla capacità termica specifica a volume costante del tessuto. Di conseguenza, Γ cambia significativamente con la temperatura e può essere scritto come segue: (2.10), dove υs è la velocità del suono, CP è la capacità termica specifica a pressione costante e T è la temperatura del tessuto. Con questa relazione, sostituendo CV con CP, l'equazione (2.9) può essere riscritta come (2.11). Va notato che, in questa relazione, T si riferisce alla temperatura base dell'oggetto e non al cambiamento di temperatura dovuto al riscaldamento laser (che è indicato come ∆T). ∆T è dell'ordine dei milliKelvin e il suo effetto sul parametro di Grueneisen è trascurabile. La temperatura base (T) del tessuto è un parametro che varia lentamente rispetto all'aumento transitorio di temperatura indotto dall'impulso laser.

Come visto in precedenza, all'eccitazione del laser si genera l'aumento iniziale della pressione p0 (equazione 2.8). Questo aumento iniziale della pressione si propagherà nel tessuto alla velocità del suono (vs) come un'onda acustica. La propagazione di quest'onda acustica in un mezzo inviscido è descritta dalla generale equazione fotoacustica nel dominio del tempo. In qualsiasi posizione e tempo t, la pressione acustica è governata dalla seguente equazione d'onda (2.12) o (2.13). Il lato sinistro dell'equazione rappresenta la propagazione dell'onda, mentre il lato destro rappresenta il termine sorgente. Sotto la condizione di confinamento termico, la conduzione del calore può essere ignorata, in quanto trascurabile, e l'equazione di diffusione del calore diventa (2.14), dove rappresenta la funzione di riscaldamento, definita come l'energia termica depositata per unità di volume e per unità di tempo. H è legato alla specifica potenza ottica depositata Ap, alla specifica energia ottica depositata (Ae), e alla fluence ottica Φ. Utilizzando le equazioni (2.13) e (2.14), otteniamo l'equazione (2.15).

Il lato destro dell'equazione (2.15) ha la prima derivata della funzione di riscaldamento H. Pertanto, un riscaldamento costante (ad esempio, un'illuminazione costante della luce) non produrrà onde fotoacustiche, in quanto la derivata prima di una costante è zero. Il termine sorgente sul lato destro dell'equazione (2.15) sarà nullo. Solo con un riscaldamento variabile nel tempo, la funzione di riscaldamento produrrà onde di pressione (o onde fotoacustiche) che si propagano nel mezzo. Per una generazione efficiente del segnale PA, tipicamente si utilizza un laser con una durata di impulso di nanosecondi. Un impulso laser di nanosecondi può essere approssimato come un'illuminazione a delta pulse [δ(t)]. In tale situazione, l'aumento iniziale della pressione dovuto all'illuminazione delta pulse può essere scritto come . Poiché per l'eccitazione delta pulse la funzione di riscaldamento può essere decomposta come e Ht(t) = δ(t), l'equazione (2.15) può essere ridotta all'equazione delle onde fotoacustiche (2.16).

Questa equazione può essere utilizzata per determinare la pressione in qualsiasi posizione e tempo t dovuto alla propagazione della pressione iniziale . Se una eccitazione delta riscalda una sfera di raggio R, un aumento della pressione p0 sarà generato all'interno della sfera. Questa pressione si propagherà sia verso l'interno che verso l'esterno come un'onda sferica. La pressione viene registrata da un trasduttore a ultrasuoni sul bordo del tessuto. Esistono vari sistemi fotoacustici progettati in base alla sorgente e al modello di illuminazione della luce, alla distribuzione e al posizionamento dei rilevatori a ultrasuoni, e alla fabbricazione del trasduttore. La lunghezza d'onda dell'illuminazione luminosa è determinata dallo spettro di assorbimento del cromoforo che viene immaginato. Lo spettro di assorbimento dei cromofori del tessuto è mostrato nella Fig. 2.1b.

Esistono vari modi di costruire un sistema di imaging fotoacustico. Fondamentalmente, questi vengono suddivisi in tre categorie: microscopia fotoacustica (PAM), endoscopia fotoacustica (PAE), e tomografia fotoacustica (PAT)/tomografia computerizzata fotoacustica (PACT). La PAM può essere ulteriormente suddivisa in microscopia fotoacustica a risoluzione ottica (ORPAM) e microscopia fotoacustica a risoluzione acustica (ARPAM). In ORPAM, il fascio laser è messo a fuoco in modo molto stretto, quindi la risoluzione spaziale è definita dalla dimensione del fascio messo a fuoco. La risoluzione di ORPAM è di 2–5 μm a una profondità di imaging di 1 mm. In ARPAM, viene utilizzato un trasd

Come migliorare la focalizzazione ottica attraverso media di diffusione: nuove tecnologie e metodi

Nel campo dell'ottica e della biofisica, la sfida di focalizzare la luce attraverso materiali otticamente diffusi, come i tessuti biologici, ha avuto un impatto significativo nelle applicazioni scientifiche e mediche. La difficoltà risiede nel fatto che questi media diffusi tendono a deviare la luce in modo caotico, rendendo quasi impossibile ottenere immagini chiare o focalizzare la luce in profondità. Tuttavia, diverse tecniche innovative, sviluppate negli ultimi decenni, hanno permesso di superare queste difficoltà, aprendo nuove frontiere nella diagnostica e nella ricerca biomedica.

Una delle tecniche più promettenti è la coniugazione digitale della fase ottica (DOPC). Questa metodica utilizza un processo iterativo per manipolare l'onda luminosa e invertire la diffusione che essa subisce attraverso il materiale. L'idea alla base di questa tecnologia è quella di "ripristinare" la fase originale della luce, correggendo la distorsione causata dalle particelle diffuse. Studi recenti, come quello di Liu et al. (2017), hanno dimostrato che è possibile focalizzare la luce in profondità all'interno di media dinamici con la coniugazione della fase ottica digitale, riuscendo a concentrarsi su target mobili e dinamici all'interno di tessuti opachi.

Un altro approccio rivoluzionario è l'uso della matrice di trasmissione basata sulla fluorescenza, come descritto da Boniface et al. (2020). Questo metodo, che sfrutta l'emissione di fluorescenza per tracciare il percorso della luce attraverso il materiale diffuso, permette di ottenere immagini non invasive con una precisione superiore rispetto alle tecniche precedenti. In combinazione con tecniche come la concentrazione ottimale della luce in materiali torbidi, è possibile ottenere immagini ad alta risoluzione anche in presenza di forti distorsioni ottiche.

Un altro progresso significativo è stato raggiunto con l'introduzione della modulazione acustica ottica per la focalizzazione della luce attraverso media otticamente diffusi. Tecniche come quella descritta da Xu et al. (2011), che utilizzano l'ultrasuono per "guidare" la luce, consentono una focalizzazione estremamente precisa anche in profondità nei tessuti. L'uso di impulsi ultrasonici per il controllo della luce permette di raggiungere livelli di penetrazione ottica mai raggiunti prima, riducendo significativamente l'effetto della diffusione.

La fotoacustica, combinata con la modellazione della forma d'onda, ha aperto un'altra strada per la visualizzazione in tempo reale di strutture biologiche attraverso media diffusi. Tecniche come quelle sviluppate da Ruan et al. (2017) e Yang et al. (2020), che utilizzano la modulazione fotoacustica per migliorare la focalizzazione, offrono immagini ad alta risoluzione con una penetrazione maggiore nei tessuti rispetto ai metodi ottici tradizionali. La combinazione di diverse modalità di imaging, come la fotoacustica e l'ultrasuono, ha il potenziale di migliorare notevolmente la qualità delle immagini in vivo, rendendo possibile l'osservazione in tempo reale di strutture biologiche complesse.

Inoltre, l'uso di fibre multimodali per l'imaging fotoacustico rappresenta un passo avanti nell'evoluzione della tecnologia di imaging. Questi strumenti sono capaci di acquisire immagini ad alta risoluzione con un basso grado di invasività, come dimostrato nelle ricerche di Zhao et al. (2022). Le fibre multimodali, infatti, sono particolarmente adatte per applicazioni endoscopiche, dove la miniaturizzazione è fondamentale.

Le tecniche di focalizzazione attraverso media diffusi sono essenziali non solo per ottenere immagini ad alta risoluzione, ma anche per migliorare l'efficacia dei trattamenti terapeutici. Ad esempio, l'uso della focalizzazione ottica per la modulazione ottogenetica nelle neuroscienze ha consentito di agire su singole cellule o gruppi di cellule in modo non invasivo, aprendo nuove possibilità per la ricerca sul cervello e sui tessuti viventi.

È importante sottolineare che, pur con i progressi tecnici, le sfide non sono completamente superate. La velocità di acquisizione delle immagini, la risoluzione a profondità crescenti e l'accuratezza dei metodi di focalizzazione rimangono problemi aperti. Inoltre, la distorsione causata dalla variabilità dei tessuti biologici e la difficoltà nel mantenere l'accuratezza della focalizzazione durante i movimenti dei tessuti sono aspetti che richiedono ulteriori sviluppi. Tuttavia, le nuove tecniche stanno indubbiamente portando a risultati straordinari, e con il continuo progresso della tecnologia, sarà possibile affrontare queste sfide in modo sempre più efficace.

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