Влияние холинотропных веществ на функцию фагоцитарно-моноцитарной системы и содержание провоспалительных цитокинов в крови при сепсисе

Влияние холинотропных веществ на функцию фагоцитарно-моноцитарной системы и содержание провоспалительных цитокинов в крови при сепсисе

Холинергическая стимуляция существенно снижает летальность белых мышей от сепсиса, вызванного внутрибрюшинным или внутрилегочным введением соответственно E. coli [1, 2,3,4] и Proteus vulgaris [5]. В 1995 году была доказана целесообразность использования холиномиметиков, в том числе, ацетилхолина (АХ) и ингибиторов холинэстеразы, для экстренной активации неспецифической антимикробной резистентности организма при различных инфекционных процессах [2]. В последующем в многочисленных исследованиях [7,10,11,12] была подтверждена, выявленная нами роль активации холинергической системы в снижении летальности животных при сепсисе, вызванном различными инфекционными процессами.

Увеличение выживаемости животных после холинергической стимуляции, в частности, АХ [1,2,3], в настоящее время называют в литературе «холинергическим противовоспалительным механизмом» («cholinergic anti-inflammatory pathway») [9,11,13]. Полученные в результате экспериментальных работ данные позволяют полагать, что возбуждение α7-никотинового холинорецептора (α7nAChR) АХ, в частности, продуцирующим нервными окончаниями n. vagus [7,9,11,12], приводит к подавлению продукции провоспалительных цитокинов фагоцитарно-моноцитарной системой (ФМС), вызывающей снижение летальности животных при различных инфекционных процессах, приводящих к сепсису [8,9,14,15].

Существуют основания для предположения, что блокада м-холинорецепторов элементов ФМС (моноцитов, макрофагов, нейтрофилов) при действии АХ может привести к увеличению выживаемости животных в ранней фазе сепсиса по сравнению с эффектом только АХ вследствие снижения продукции клетками ФМС [6,10,11] провоспалительных цитокинов - фактора некроза опухоли-α (ФНОα), ИЛ-1β и ИЛ-6 [9,10,11,9,14,15].

Целью исследования являлась оценка влияния АХ и комбинированного действия АХ и атропина на функцию ФМС по летальности мышей от сепсиса, вызванного экспериментальным перитонитом, и содержанию в плазме крови провоспалительных цитокинов ФНОα, ИЛ-1β и ИЛ-6.

Опыты проводили на неинбредных белых мышах обоего пола массой 18-22 г. АХ хлорид вводили подкожно (общепринятый способ применения АХ [5]) однократно в дозе 20 мг/кг, вызывающей выраженную холинергическую стимуляцию [2] и увеличение выживаемости мышей при экспериментальной инфекции [2]. Через 2 ч (моделирование сепсиса) после введения АХ в дозе 20 мг/кг все клинические проявления холинергической стимуляции у мышей практически исчезают. Доза АХ, составляющая 20 мг/кг, позволяет обеспечить реализацию его эффекта при блокаде м-холинорецепторов атропином сульфатом (АС). При исследовании комбинированного действия АХ и м-холиноблокатора АС для обеспечения преимущественной активации α7nAChR АС применяли подкожно в дозе 10 мг/кг одновременно с АХ. Через 2 ч у мышей вызывали сепсис внутриперитонеальным введением 2,5·109 суточной культуры микробных тел E. coli [1,14]. Регистрацию летальности мышей проводили с применением и без применения холинергических средств (АХ, АХ в комбинации с АС) через 10 и 25 ч после моделирования септического процесса. Концентрацию цитокинов ФНОα, ИЛ-1β и ИЛ-6 исследовали в плазме крови выживших мышей через 10 и 25 ч в контроле и после внутриперитонеального введения E.coli (с применением и без применения холинергических средств) методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. Кровь для исследований забирали из хвостовой вены. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия достоверности Стьюдента.

При исследовании летальности белых мышей после моделирования сепсиса с применением и без применения холинергических средств установлено (табл. 1), что АХ, АХ в комбинации с АС через 10 ч после внутриперитонеального введения E. coli приводили к снижению (p<0,05) исследованного показателя по сравнению с контролем (сепсис) соответственно на 36,7 и 46,6%, а через 25 ч – на 46,7 и 63,4% (p<0,05).

Таблица 1

Влияние ацетилхолина и ацетилхолина в комбинации с атропином на летальность мышей после моделирования сепсиса (М+m, n = 30)

Примечание: * -p<0,05 по сравнению с контролем.

Полученные результаты свидетельствуют о снижении летальности мышей при моделировании сепсиса после применения АХ. Введение АХ в комбинации с АС уменьшают летальность от сепсиса в большей степени, чем при использовании только АХ. Вероятно, это обусловлено преимущественной активацией ацетилхолином α7nAChR ММС в условиях блокады м-холинорецепторов [7].

Концентрация провоспалительных цитокинов в плазме крови мышей при сепсисе существенно увеличивается (табл. 2) по сравнению с контролем (интактные животные). Так, содержание ФНОα, ИЛ1β и ИЛ-6 через 10 ч при сепсисе по сравнению с контролем повышалась соответственно в 5,2; 14,5 и 22,4 раза (p<0,05).

Содержание ФНОα, ИЛ1β и ИЛ-6 в крови мышей после применения АХ с последующим моделированием сепсиса через 10 ч уменьшалось по сравнению с показателями при сепсисе без применения АХ соответственно в 2,0; 2,3 и 2,4 раза (p<0,05). При этом концентрации провоспалительных цитокинов достоверно (p<0,05) превышали контрольные показатели.

Таблица 2

Влияние ацетилхолина и ацетилхолина в комбинации с атропином на концентрацию провоспалительных цитокинов в плазме крови мышей при сепсисе, пг/мл (М+m)

Примечание: 10 и 25 – срок после моделирования сепсиса, ч; в скобках – число животных в опыте; a - p<0,05 по сравнению с контролем; b - p<0,05 по сравнению с показателем при сепсисе; с - p<0,05 по сравнению с показателем через 10 ч; d - p<0,05 по сравнению с показателем при введении АХ перед моделированием сепсиса.

Комбинированное применение АХ с АС до моделирования сепсиса приводило через 10 ч после внутрибрюшинного введения E.coli мышам к снижению концентрации в плазме крови ФНОα, ИЛ1β и ИЛ-6 по сравнению показателями при сепсисе без применения холинергических препаратов соответственно в 2,8; 3,3 и 3,8 раза (p<0,05), а по сравнению с параметрами при сепсисе с использованием АХ – в 1,4; 1,5 и 1,6 раза (p<0,05). При этом содержание цитокинов достоверно (p<0,05) превышало контрольные уровни.

Аналогичные, но менее выраженные изменения концентрации в крови провоспалительных цитокинов, зарегистрированы при сепсисе без применения холинергических препаратов, а также при внутрибрюшинном введении E. coli через 25 ч после их использования. Содержание в крови цитокинов ФНОα, ИЛ1β и ИЛ-6 через 25 ч после моделирования сепсиса во всех сериях опытов существенно снижалось (p<0,05) по сравнению с концентрацией, зарегистрированной через 10 ч после введении E. coli. Содержание провоспалительных цитокинов в крови через 25 ч оставалось выше контрольных значений (p<0,05), за исключением уровня ФНОα, который отличался от контрольного значения незначимо (p>0,05), при воздействии АХ и АХ в комбинации с АС с последующим моделированием сепсиса.

Установленные изменения содержания провоспалительных цитокинов в крови у мышей свидетельствуют о том, что АХ, а также АХ в комбинации с АС, воздействуя на α7nAChR моноцитов, макрофагов и нейтрофилов [8, 9] (возможно, и естественных клеток-киллеров [2]), реализует «холинергический противовоспалительный механизм» [1,2,3,4,5,15], снижая в крови и органах ФМС, включая селезенку, печень и желудочно-кишечный тракт, содержание провоспалительных цитокинов ФНОα, ИЛ1β и ИЛ-6, вызывающих различные патологические реакции, приводящие к летальному исходу при сепсисе (и других инфекционных патологических состояниях) [11,12]. Усиление эффекта АХ при введении его в комбинации с АС свидетельствует о том, что действие АХ на клетки ФМС усиливается в связи с преимущественным возбуждением их α7-никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (α7nAChR) в условиях блокады м-холинорецепторов моноцитов, макрофагов и нейтрофилов.

Следует отметить, что проведенные исследования в ранней фазе сепсиса характеризуют влияние холинергических препаратов при моделировании сепсиса не на иммунные реакции, а на антиинфекционную неспецифическую резистентность организма [1,2,3,4]. Продукция ИЛ-6 Th2-лимфоцитами (и клетками Th0-типа) в ответ на введение E. coli начинается в период формирования иммунного ответа только через 5-7 сут после попадания в организм данного антигена [6].

ВЫВОДЫ

1. Ацетилхолин хлорид (20 мг/кг) при его введении за 2 ч до моделирования сепсиса вызывает существенное снижение летальности мышей от экспериментального инфекционного процесса вследствие снижения в крови концентрации провоспалительных цитокинов ФНОα, ИЛ-1β и ИЛ-6 .

2. Применение ацетилхолина хлорида (20 мг/кг) в комбинации с атропином сульфатом (10 мг/кг) вызывает усиление выявленных противовоспалительных эффектов ацетилхолина при сепсисе.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.  Забродский, армина на факторы неспецифической резистентности организма и первичный гуморальный ответ //Фармакол. и токсикол. – 1987. – Т 49. – №2. – С. 57 – 60.

2.  Забродский, антиинфекционной неспецифической резистентности организма под влиянием холинергической стимуляции // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 1995. – Т. 119. – № 8. – С. 164 – 167.

3.  Забродский холинергической стимуляции на неспецифическую резистентность организма и систему иммунитета // Иммунология. 1995. Т.53, № 5. С. 62-64.

4.  Забродский эффекты при обратимом ингибировании холинэстеразы // Иммунология.1996. № 4. С. 26-28.

5.  Забродский, П. Ф., Мандыч, ксенобиотиков: Монография. Саратов: СВИБХБ, 2007. –420 с.

6.  Бростофф Дж., Иммунология. М.: Мир, 20с.

7.  Giebeleh, I. A., Leendertse, M., Florquin, S. Stimulation of acetylcholine receptors impairs host defence during pneumococcal pneumonia // Eur. Respir. J. – 2009.- Vol. 33. – №2. –P. 375–381.

8.  Hauber H. P., Zabel P. Pathophysiology and pathogens of sepsis // J. Immunol. 2009. Vol. 50, №7. P. 779-780.

9.  Kessler W., Traeqer T., Westerholt A. The vagal nerve as a link between the nervous and immune system in the instance of polymicrobial sepsis // Langenbecks Arch. Surg. 2006. Vol. 391, №2. P. 83-87.

10.  Liu C., Shen F. M., Le Y. Y. Antishock effect of anisodamine involves a novel pathway for activating alpha7 nicotinic acetylcholine receptor // Crit. Care Ned. 2009. Vol. 37, №2. P. 778-779.

11.  Oke S. L., Tracey K. J. From CNI-1493 to the immunological homunculus: physiology of the inflammatory reflex // J. Leukoc. Biol. 2008. Vol. 83, №3.P. 512-517.

12.  Pavlov V. A. Cholinergic modulation of inflammation // Int. J. Clin. Med. 2008. Vol. 1, №3.-P. 203-212.

13.  Rosas-Ballina M., Tracey K. J. Cholinergic control of inflammation // J. Intern. Med. 2009. Vol. 265, №6. P. 663-679.

14.  Song D. J., Huanq X. Y., Ren L. C. Effect of lentiviral vector encoding on triggering receptor expressed on myeloid cells 1 on expression of inflammatory cytokine in septic mice infected by Bacteroides fragilis // Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2009. Vol. 25, №1. P. 36-41.

15.  Vos A. F., Pater J. M., Pangaart P. S. In vivo lipopolysaccharide exposure of human blood leukocytes induces cross-tolerance to multiple TLR ligands. // J. Immunol. 2009. Vol. 183, №1. P. 533-542.