На правах рукописи

молочнокислыЕ бактерии: индивидуальные особенности действия на патогенные микроорганизмы, макроорганизм и его микробиоту

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

03.00.07 – микробиология

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Научный консультатнт:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки «Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «…»………………….2009 г. в « » часов на заседании

диссертационного совета ДМ 001.022.01 при НИИЭМ СЗО РАМН

Санкт-Петербург,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН

Автореферат разослан «…..»………………….2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук

ХаРАКТЕРИСТИКА работы

Актуальность исследования. Еще в начале XX века российский ученый впервые начал активно пропагандировать использование молочнокислых бактерий (lactic acid bacteria, LAB) в лечебно-профилактических целях. Он создал предпосылки для формирования нового научного направления, включающего изучение межмикробного антагонизма и оценку влияния LAB на организм хозяина, сформулировал основные постулаты для зарождающейся в наши дни научной дисциплины «пробиотической микробиологии» [и , 2008]. Несмотря на длительное и достаточно успешное использование пробиотических пищевых продуктов и препаратов, их активное, но часто бесконтрольное применение в последние десятилетия привело к возникновению ряда серьезных проблем. Среди них можно указать: низкую эффективность действия некоторых препаратов, угнетение собственной микрофлоры хозяина, развитие инфекционной патологии при введении пробиотиков ослабленным больным [Lebenthal E., Lebenthal Y., 2003; Land M. H. et al., 2005]. Становится очевидным, что для увеличения эффективности лечебно-профилактического использования и предотвращения развития побочных эффектов LAB должны вводиться с учетом индивидуальных характеристик пациента и по назначению врача. Именно поэтому в настоящий момент как никогда остро встал вопрос о необходимости серьезных комплексных научных исследований особенностей действия молочнокислых бактерий на макроорганизм и его микробиоту.

К числу LAB относят два рода бактерий, явившихся предметом настоящего исследования,- Lactobacillus spp. и Enterococcus spp.. [Axelsson L., 2004; Salminen S. et al., 2004]. Эти микроорганизмы представляют особый научный и практический интерес, так как являются представителями нормальной микрофлоры человека и животных, широко распространены во внешней среде, входят в состав многих пробиотических препаратов и продуктов. Известно, что энтерококки и лактобациллы могут оказывать разностороннее влияние на биохимические, физиологические, нейрогуморальные и иммунные процессы в организмах человека и животных [, 2005; Goldin B. R. and Gorbach S. L., 1984; Maldonado G. et al., 2007; Preter V. et al., 2007]. Эти бактерии участвуют в поддержании колонизационной резистентности и гомеостаза, нормализуют содержание в организме углеводов, желчных кислот, холестерина, осуществляют синтез витаминов и других биологически активных соединений [Gibson G. R. et al., 1995; и , 2002]. Некоторые штаммы энтерококков и лактобацилл способны продуцировать в окружающую среду такие продукты, как перекись водорода, лизоцим, бактериоцины и бактериоциноподобные субстанции, конкурировать с патогенными микроорганизмами за пищевые субстраты и сайты прикрепления к клеткам [Reid G., 2004; Salminen S. et al., 2004]. Основным требованием, предъявляемым к пробиотическим штаммам LAB, является наличие выраженной антагонистической активности по отношению к патогенным микроорганизмам [Reid G., 2008]. Это позволяет использовать пробиотики для усиления или коррекции эффектов антибиотиков, а в ряде случаев - как их альтернативу. На основании большого числа клинических наблюдений можно полагать, что пробиотики практически незаменимы при терапии дисбиотических состояний, болезни Крона, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [ и , 2006]. Кроме того, LAB активно используются при терапии сахарного диабета, аллергических заболеваний [Prescott S. and Björkstén B., 2009], ишемической болезни сердца, коррекции нарушений липидного и минерального обменов [ и др., 2004]. Наряду с пероральным введением молочнокислых бактерий целесообразно их местное использование при вагинитах, тонзиллитах и стоматитах [Reid G. et al., 2004; Elmer G. W., 2001; Maldonado G. et al., 2007].

Несмотря на несомненные успехи, достигнутые при изучении LAB, многое до сих пор остается неясным. Неизвестно, как молочнокислые бактерии, входя в состав микробиоты человека и животных, влияют на патогенные микроорганизмы и представителей нормальной микрофлоры, какое действие они оказывают на отдельные ткани состояние отдельных систем и макроорганизм в целом. Обнаружены существенные различия в спектрах антибактериального действия различных штаммов молочнокислых бактерий, а также в их способности влиять на систему иммунитета и метаболические процессы, происходящие в организме человека и животных. Возможность соматической патологии пациента и особенности собственной микрофлоры хозяина делают необходимым индивидуальный подбор пробиотиков. Отсутствие стандартных методов исследования пробиотиков затрудняет сравнительный анализ различных штаммов молочнокислых бактерий и их паспортизацию. В связи с этим разработка методологии сравнительного исследования пробиотических культур, а также изучение особенностей их действия в системах in vitro и in vivo, являются актуальной проблемой современной микробиологии.

Целью настоящей работы является изучение особенностей влияния молочнокислых бактерий на микробиоту и макроорганизм, а также разработка стратегии максимально эффективного использования пробиотических штаммов LAB для профилактики и лечения заболеваний человека и животных, вызванных стрептококками и другими патогенными микроорганизмами.

Задачи исследования

1. Разработать комплекс методических подходов для исследования влияния LAB на

патогенные микроорганизмы, нормальную микрофлору и макроорганизм.

2. Провести сравнительное исследование антагонистической активности культур LAB в отношении различных грамотрицательных и грамположительных бактерий, микоплазм, грибов родов Candida и Cryptococcus, а также вирусов простого герпеса.

3. Исследовать геномы LAB, обладающих антагонистической активностью в отношении патогенных бактерий и грибов, на наличие известных генов бактериоциногенности.

4. Изучить влияние антимикробных пептидов, продуцируемых LAB, а также искусственно синтезированных аналогов бактериоцинов на рост и морфофизиологические особенности патогенных микроорганизмов.

5. Провести анализ экспрессии генов бактериоциногенности LAB и исследовать влияние специфических пептидных индукторов на антибактериальную активность молочнокислых бактерий.

6. Исследовать в модельных условиях воздействие штаммов LAB и аутопробиотических энтерококков на клинические симптомы, метаболические процессы, иммунитет и микробиоту кишечника лабораторных животных при дисбиозе, вызванном приемом антибиотиков, а также при терапии урогенитальных инфекций.

Научная новизна

Предложен комплекс методов (микробиологических, биохимических, генетических, иммунологических, гистологических, электронно-микроскопических) для разностороннего изучения воздействия LAB на макроорганизм и заселяющую его микрофлору.

Проведено сравнительное исследование лактобацилл и энтерококков, выделенных из различных источников. Благодаря введению нового количественного показателя удалось охарактеризовать степень антагонистической активности различных штаммов энтерококков и лактобацилл в отношении широкого круга индикаторных микроорганизмов (грамотрицательных и грамположительных бактерий, микоплазм, а также грибов рода Candida и Cryptococcus). Впервые выявлена способность метаболитов лактобацилл и энтерококков угнетать рост микоплазм и репродукцию вирусов простого герпеса в системе in vitro.

Разработаны новые модели экспериментального дисбиоза и бактериального вагинита. При их использовании впервые установлены особенности влияния различных культур LAB на клинические симптомы, микробиоту, показатели иммунитета, тонкие морфологические изменения в тканях животных.

Впервые исследована степень влияния пробиотических штаммов, в частности, молочнокислых бактерий, на метаболические процессы, происходящие в разных отделах желудочно-кишечного тракта.

Впервые на биологической модели доказана эффективность использования индигенных (аутопробиотических) энтерококков для коррекции дисбиозов у животных.

Впервые выявлено действие искусственно синтезированного энтероцина В и его аналога на грамотрицательные бактерии, проявляющееся в ингибировании роста E. coli и повреждении их цитоплазматических мембран.

Выявлены штаммовые особенности действия метаболитов энтерококков и лактобацилл на морфологию S. pyogenes.

Теоретическая значимость работы

Теоретическое значение работы заключается в том, что диссертантом предложен новый подход для исследования влияния LAB на организм млекопитающих и их микрофлору. В результате удалось значительно дополнить имеющиеся представления об особенностях распространения молочнокислых бактерий в организме и возможности колонизации ими слизистых оболочек урогенитального и желудочно-кишечного трактов.

Установлено, что воздействие пробиотиков на организм сопровождается существенными сдвигами, как в сторону стимуляции, так и в сторону ингибирования реакций иммунной системы, а также пристеночного и просветного пищеварения на разных уровнях желудочно-кишечного тракта. Характер влияния вводимых пробиотических культур зависит от их индивидуальных особенностей, а также от наличия или отсутствия инфекционной патологии. Эти данные имеют большое значение для понимания сложного комплекса взаимодействий макроорганизма и его микробиоты, а также выбора пробиотика в зависимости от клинического диагноза и этиологии заболевания.

Полученные результаты важны для развития медицинской, а также ветеринарной микробиологии, открывают перспективы широкого практического использования и дальнейшего изучения LAB.

Практическая значимость работы

Прикладными аспектами исследования являются разработанные на основе экспериментальных данных: 1) метод двухслойного агара с количественной и качественной оценкой антимикробной активности молочнокислых бактерий in vitro; 2) комплексный подход в исследования прямого и опосредованного антимикробного действия in vivo, с учетом влияния LAB на патогенные микроорганизмы, микробиоту хозяина, метаболизм и иммунную систему макроорганизма.

В ходе сравнительного исследования клинических изолятов из урогенитального тракта выбран и идентифицирован новый штамм LAB, L. fermentum Z, предложенный для использования в составе пробиотических препаратов или пищевых продуктов [Заявка на изобретение № от 15.08.08]. Его отличительной особенностью является избирательное действие в отношении патогенных микроорганизмов, отсутствие влияния на другие LAB, в частности E. faecium L3. При исследовании антимикробного эффекта эти молочнокислые бактерии выступают, как синергисты и могут быть рассмотрены в качестве компонентов нового симбиотического препарата.

Исследование влияния аутопробиотических энтерококков на организм животных при дисбиозе кишечника может рассматриваться как предварительный экспериментальный этап перед комплексным исследованием перспектив применения в клинической практике собственной микрофлоры.

Результаты исследований могут быть использованы при клиническом назначении пробиотиков с целью защиты и профилактики заболеваний инфекционной природы. Применение пробиотических препаратов для лечения и профилактики эндометритов у коров, обусловленных условно-патогенной микрофлорой, изложено в методических рекомендациях, утвержденных методическим советом ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская Государственная академия ветеринарной медицины».

Модифицированный метод двухслойного агара применяется в лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН, на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии имени для изучения микробного антагонизма, на кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины».

Результаты диссертационного исследования используются при чтении лекций и проведения практических занятий по микробиологии на медицинском факультете Санкт-Петербургского Государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1.  При назначении пробиотиков, в состав которых входят молочнокислые бактерии, целесообразно учитывать спектр их антимикробной активности, а также особенности их влияния на иммунную систему и метаболические процессы.

2.  Предложенные модели экспериментальных дисбиозов и вагинитов, позволяют изучать особенности действия штаммов пробиотиков на макроорганизм и его микрофлору на фоне развития указанных патологических процессов.

3.  Новый подход в оценке степени влияния пробиотических бактерий на метаболические процессы в разных отделах желудочно-кишечного тракта расширяет существующие научные представления о роли микробиоты в процессе пищеварения.

4.  Модифицированный метод двухслойного агара позволяет проводить количественную оценку антагонистической активности LAB к широкому спектру микроорганизмов и выявлять возможные морфофункциональные изменения индикаторных культур.

5.  Созданию симбиотических и комбинированных микробных препаратов должны предшествовать эксперименты, направленные на выявление степени антагонистической активности компонентов консорциумов по отношению друг к другу и к патогенным микроорганизмам при совместном и раздельном культивировании.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 270 страницах и включает: введение, обзор литературы материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы и приложение. Текст диссертации иллюстрирован 77 рисунками и 50 таблицами. Список литературы включает 379 источников, из них 132 отечественных и 247 зарубежных.

Основная часть работы выполнена в отделе молекулярной микробиологии (НИИЭМ СЗО РАМН). Антимикотическая активность LAB исследована автором на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургского Университета им. акад. . Электронная микроскопия и синтез пептидов проведены в Федеральном государственном унитарном предприятии "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства. (). Ветеринарные исследования проведены в животноводческих хозяйствах Ленинградской области ( Предпортовый» и «Гражданский»).

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 66 научных работ, из них 23 статьи

(9 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ), 37 тезисов. Материалы диссертационной работы изложены также в отдельных главах трех книг и в 3 методических пособиях.

Диссертация апробирована на заседании отдела молекулярной микробиологии

НИИЭМ СЗО РАМН 8 июня 2009 года.

Результаты диссертационной работы были доложены на VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика”, Санкт-Петербург, 2000 г; Всероссийской научной конференции, посвященной 103-летию основания кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург, 2001 г; I Съезде микологов, Москва, 2002 г; научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням, Санкт-Петербург, 2002 г; конференции «Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования» Москва, 2002 г; первом всероссийском конгрессе по медицинской микологии, Москва 2003 г; VI Российском съезде врачей инфекционистов, Санкт-Петербург, 2003 г; 14th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Prague, Czech Republic, 2004; научно-практической конференции по медицинской микологии (7-е Кашкинские чтения), Санкт-Петербург, 2004 г; 1st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz, Spain, 2005; Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией», Санкт-Петербург, 2004 г; Международном научно-практическом конгрессе «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», Санкт-Петербург, 2005 г; The XVI Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Palm Cove, Australia, 2005; 7-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме Санкт-Петербург, 2005 г; Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины», Санкт-Петербург, 2006 г; заседании общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в НИИ им. Пастера, Санкт-Петербург, 2006 г; IX съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2007 г; Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты», Санкт-Петербург, 2007 г; международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты», Санкт-Петербург, 2007 г; 10-м Юбилейном Славяно-Балтийского научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2008», Санкт-Петербург, 2008 г; VI Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 50-летию открытия мембранного пищеварения, Санкт-Петербург 2008 г; II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», Кишинев, Молдова, 2008 г; The XVII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Porto Heli, Greece, 2008; II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», СПб. 2008 г; Международной конференции «Probiotics for the 3rd Millennium» High Tatras, Slovakia, 2008; втором Санкт-Петербургском международном ЭкоФоруме-«Окружающая среда и здоровье человека» Санкт-Петербург, 2008 г; 20th European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 2009; Helsinki, Finland, 2009; 8th BIO FORUM BIO EXPO JAPAN, Tokyo, 2009.

Личный вклад диссертанта

Основная часть исследований выполнена лично автором. Выделение антимикробных пептидов выполнялось при консультации, д. б.н., профессора (НИИЭМ СЗО РАМН). Пептиды по предоставленной аминокислотной последовательности синтезированы д. б.н. (). Электронная микроскопия ультратонких срезов с поверхности двухслойного агара стрептококков и эшерихий выполнена д. б.н., профессором (). Исследование биохимической активности проведены совместно с д. б.н. (НИИ Физиологии им. ). Гистологические исследования проведены д. б.н., (НИИЭМ СЗО РАМН). Культивирование ВПГ и определение выполнено совместно с к. б.н. (НИИ гриппа Северо-Западного отделения РАМН). Лечение послеродового эндометрита у коров проведено совместно с к. в.н. (Государственная академия ветеринарной медицины) в животноводческих хозяйствах Ленинградской области.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика штаммов антагонистов и индикаторных микроорганизмов

В качестве антагонистов использованы штаммы энтерококков и лактобацилл, выделенные из пробиотических препаратов, а также изолированные из урогенитального тракта и кишечника здоровых людей (Lactobacillus spp. 62, 64, 65 и E. faecium V1). Большая часть экспериментов проводилась с использованием 6 штаммов пробиотических молочнокислых бактерий: Enterococcus faecium L3 («Ламинолакт»), E. faecium L5, устойчивый к эритромицину дериват штамма L3, E. faecium SF68 («Бифиформ»), E. faecium М74 («Линекс»), Lactobacillus plantarum 8Р-А3 («Лактобактерин»), L. acidophilus Д № 75 и 76 («Витафлор»), L. aciophilus EP 317/402 («Наринэ») и L. fermentum Z (подана заявка на изобретение) в качестве антагонистов. В качестве контролей использовались пробиотические культуры E. coli M17 и Saccharomyces boulardii П№ входящие в состав препаратов «Бификол» и «Энтерол», соответственно.

В качестве индикаторных культур использовали: 30 штаммов стрептококков, по 10 штаммов из серогрупп A (СГА), В (СГВ), C (СГС) и G (СГG); Enterococcus spp. V1-V28, Staphylococcus aureus ATCC 25923, S. aureus 209, Sh1 и Sh 2 (устойчивый к метициллину), Escherichia coli АТСС 25922, E. coli 1-20, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus mirabilis E, Klebsiella pneumoniae E, Listeria monocytogenes EGD, M. hominis 31.P ATСС15488, Candida albicans ATCC 855-653 и Cryptococcus neoformans E. Также в роли индикаторных бактерий выступали 7 штаммов молочнокислых бактерии: E. faecium L3, SF68, M74, L. acidophilus EP 317/402, L. plantarum 8Р-А3 и L. fermentum Z, использованные как антагонисты.

Для определения противовирусной активности супернатантов культур LAB, полученных из них пептидных экстрактов, а также синтетического энтероцина В и его аналога использовали штамм вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) «Ленинград».

Культуральные среды, условия роста и хранение культур микроорганизмов

Для культивирования микроорганизмов применяли жидкие и плотные питательные среды: THB (Todd-Hewitt Broth, «Difco», США), BHI (Brain Heart Infusion Broth, «Gibco Diagnostics», США), MРС1, МРС4 («НИЦФ», Россия), MRS и колумбийский агар («Himedia», Индия) с добавлением (до 10% объема) нормальной лошадиной сыворотки, среду Мюллера-Хинтона («НИЦФ», Россия) триптозный агар («FERAK», Германия). Все бактериальные штаммы инкубировали в аэробных условиях при 37оС. Первичное выделение лактобацилл из проб, взятых из организма людей и животных, осуществляли при той же температуре в микроаэрофильных условиях (в микроанаэростатах с использованием газогенерирующих пакетов для анаэробов «Becton Dickinson», США).

Методы исследования

Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств микроорганизмов, изолированных из объектов исследования, проводили по общепринятым методикам [Balows A., et al., 2005]. Исследование биохимических свойств энтерококков и лактобацилл осуществляли при помощи тест систем Lachema (Чехия), bioMerieux (Франция).

Анализ геномов энтерококков и лактобацилл в целях их видовой идентификации, а также выявления генов патогенности и генов, обеспечивающих продукцию бактериоцинов, выполняли при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Экспрессию генов бактериоцинов в штамме E. faecium L3, подтверждали, используя метод обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).

Исследование антимикробной активности культур антагонистов проводили методами штриховых посевов (ГОСТ, 2004), двухслойного агара с определением предложенного нами показателя МИКА (минимального ингибирующего количества антагониста) и с оценкой характера роста индикаторных культур. Кроме того, для изучения антагонистической активности LAB определяли количества жизнеспособных индикаторных микроорганизмов при их выращивании в присутствии молочнокислых бактерий в жидкой питательной среде.

Антимикробную активность супернатантов, пептидных экстрактов, полученных из них фракций пептидов, а также искусственно синтезированных пептидов определяли с помощью метода радиальной диффузии [Lehrer R. I. et al., 1991], капельным и турбодиметрическим методами.

Противовирусную активность супернатантов LAB и пептидов исследовали, заражая вирусом простого герпеса первого типа (ВПГ-1) культуру клеток Vero, с последующей количественной оценкой цитопатического действия (ЦПД). Наличие репродукции вирусов устанавливали при помощи иммуно-флюоресцентного метода (с поликлональной сывороткой против ВПГ-1).

Концентрацию молочной кислоты в супернатантах LAB определяли энзиматическим калориметрическим методом с использованием тест системы «Лактат-Витал» («Витал Диагностикс», Санкт-Петербург, Россия).

Пептидный экстракт из супернатанта культуры E. faecium L3 получали путем преципитации 70% сульфатом аммония, с последующей фильтрацией через мембрану Amicon PM (10000 MW, США). Выделение и очистку низкомолекулярных катионных пептидных фракций культуры E. faecium L3 выполняли путем гельфильтрации.

Анализ молекулярной массы пептидов, входящих в состав фракций, проводили с использованием SDS электрофореза и при помощи масспектрометрического анализа.

Синтез пептидов осуществляли с использованием автоматического синтезатора пептидов Applied Biosystems 430-A (США).

Содержание иммуноглобулинов A, M и G в сыворотке крови крыс и коров, а также слизи из урогенитального тракта и кишечника крыс определяли методом осаждения сульфатом цинка [, и др. 1988].

Функциональную активность С3 компонента комплемента сыворотки крови крыс оценивали по результатам кинетической регистрации комплементзависимого гемолиза эритроцитов кролика в присутствии реагента RC3 [Jessen T. E. et al., 1983].

Экспрессию мРНК цитокинов (IL-1β, IL-8, IL-10, IL-18) и TLR2 рецепторов в тканях слизистой кишечника и влагалища лабораторных животных определяли методом ОТ-ПЦР.

Эксперименты на крысах проводили, используя штамм E. faecium L5 (E. faecium L3, несущий ген устойчивости к эритромицину), L. fermentum Z и аутопробиотические штаммы, выделенные из фекалиев здоровых крыс.

Оценку острой и подострой токсичности проводили на беспородных белых мышах и крысах Вистар обоих полов (массой 18–20 г и 200-250 г, соответственно), полученных из питомника «Рапполово РАМН».

Экспериментальный дисбиоз кишечника у крыс вызывали внутрижелудочным введением течение 3-х дней ампициллина и метронидазола. Затем 5 дней животные получали молочнокислые закваски. На 8-ой день отбирали пробы химуса, слизи и эпителия для оценки активности фермента мальтазы. Взятие и исследование проб при изучении влияния пробиотиков на кишечное пищеварение осуществляли в соответствии с методикой, описанной ранее [Егорова и др., 1987]. Биохимические показатели сыворотки крови крыс определяли при помощи биохимического анализатора Aeroset Toshiba (США).

Модель экспериментального вагинита создавали у овариоэктомированных крыс (самки породы Вистар, масса г), которых интравагинально заражали смесью патогенных бактерий (Streptococcus agalactiae 219, Staphylococcus aureus LB и гемолитический штамм Escherichia coli IM). Для возобновления половых циклов крысам вводили 0,5 мкг эстрадиол-дипропионата.

Пробы маточного экссудата получали при помощи пластикового катетера, который также был использован для введения лечебных препаратов (молочнокислых заквасок или антибиотиков).

Электронная микроскопия тонких срезов колоний бактерий проведена по методике предложенной [, 2006]

Электронная микроскопия срезов слизистых кишечника и гистологические исследования слизистых урогенитального и желудочно-кишечного тракта крыс были осуществлены по общепринятым методикам.

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерных программ Microsoft Excel и STATISTICA for Windows. Связь между категориями переменных анализировали с помощью t-критерия Стьюдента (сравнение средних величин в группах). Различия считали статистически значимыми при доверительном интервале 95% (р <0,05).

Результаты и обсуждение

I Антимикробная активность LAB в системе in vitro

1. Антимикробная активность живых культур LAB

Исследование антимикробного действия живых бактерий родов Lactobacillus и Enterococcus проводили методами штриховых посевов и предложенным нами вариантом метода двухслойного агара. Антимикотическая активность LAB и их способность влиять на рост друг друга изучались также при совместном культивировании этих микроорганизмов в жидкой среде.

1. 1. Исследования методом штриховых посевов

Исследование антимикробного антагонизма LAB методом штриховых посевов было проведено с использованием среды (МРС4), предназначенной для культивирования молочнокислых бактерий. Поэтому в качестве индикаторных микроорганизмов был использован сравнительно узкий круг бактерий (стафилококки, эшерихии, клебсиеллы, лактобациллы и энтерококки), а также грибы рода Candida, способные расти на этой среде. В результате проведенных экспериментов показано, что максимальной антагонистической активностью к использованным индикаторным культурам обладала культура L. plantarum 8Р-А3. Несколько меньшую способность ингибировать рост индикаторных культур проявляли L. acidophilus EP 317/402 и пробиотические энтерококки (p <0,05). В то же время, большинство клинических изолятов (55 из 65 штаммов Lactobacillus spp. и E. faecium V1) не обладали антагонистической активностью к перечисленным выше индикаторным микроорганизмам (зоны задержки роста менее 3 мм). Исключение составляли 10 штаммов лактобацилл, выделенных из урогенитального тракта здоровых женщин. Эти бактерии ингибировали рост индикаторных культур, причем зоны задержки роста колебались в пределах 4-24 мм. Выраженной антагонистической активностью (с зонами задержки роста более 10 мм) обладали только бактерии, выделенные из пробиотиков: L. acidophilus EP 317/402, L. plantarum 8Р-А3, E. faecium L3, E. faecium M74, E. faecium SF68, а также клинические изоляты лактобацилл Z, 62 и 65. Обращало на себя внимание то, что большинство культур LAB проявляли максимальную антагонистическую активность по отношению к эшерихиям и стафилококкам, зоны задержки роста которых колебались в пределах 24-35 мм и 12-25 мм, соответственно. Кроме того было отмечено отсутствие антимикотической активности LAB. Исключение составляла культура L. plantarum 8P-A3, вызывающая образованию зон задержки роста грибов до 13 мм. В то же время, именно эта культура в отличие от других исследованных молочнокислых бактерий проявляла антагонистическую активность в отношении других штаммов лактобацилл и энтерококков, а также собственной культуры.

Метод штриховых посевов использовался лишь на первом этапе исследований, так как он позволяет изучать антимикробную активность лактобацилл и энтерококков только в отношении ограниченного числа индикаторных культур. При помощи этого метода было невозможно определить чувствительность стрептококков, псевдомонад и микоплазм к действию LAB, а также выявить статистически достоверные различия антагонистической активности, которые в ряде случаев при исследовании методом штриховых посевов были спорными.

1.2. Исследования методом двухслойного агара

Метод двухслойного агара был использован для изучения антимикробной активности тех культур, которые проявили выраженный анимикробный антагонизм при исследовании методом штриховых посевов. Преимущество предложенного нами варианта метода состоит, прежде всего, в возможности существенного расширения спектра индикаторных культур. Оказалось, что, изменяя состав верхнего слоя агара, можно исследовать антагонистическую активность LAB ко многим микроорганизмам, неспособным расти на средах, в основном предназначенных для роста лактобацилл. В результате, впервые в качестве индикаторных культур были использованы криптококки, микоплазмы, стрептококки различных групп. Важно, также, что для сравнительного исследования антимикробной активности был предложен количественный показатель МИКА. Это позволило провести сопоставление антагонистической активности молочнокислых бактерий по степени выраженности этого эффекта («силе»). Для сравнительного анализа были введены дополнительные количественные критерии, позволившие разделить индикаторные культуры на: 1) чувствительные (0-2,5 lg КОЕ/мл), 2) умеренно устойчивые (>2,5 ≤4,5 lg КОЕ/мл) и 3) резистентные к действию антагонистов (>4,5 lg КОЕ/мл). Результаты сравнительного исследования антагонистической активности LAB по отношению к патогенным бактериям и грибам представлены в таблице1.

1.2.1. Антагонистическая активность LAB к стрептококкам и энтерококкам

Большое внимание было уделено действию LAB на бактерии родов Streptococcus и Enterococcus. В результате исследований показано, что максимальный антистрептококковый эффект LAB проявляли по отношению к СГА и СГG, промежуточное положение по чувствительности занимали СГС и CГB. МИКА молочнокислых бактерий по отношению к стрептококкам этих групп составили 1,19 lg КОЕ/мл; 2,35 lg КОЕ/мл, 2,66 lg КОЕ/мл и 4,15 lg КОЕ/мл, соответственно. В то же время, все энтерококки росли в присутствии большего количества колоний антагонистов (5,34 lg КОЕ/мл).

Наибольшую разницу в чувствительности к действию LAB удалось установить, анализируя особенности роста 10 штаммов S. pyogenes в присутствии различных молочнокислых бактерий. Показано, что все эти чувствительные к действию молочнокислых бактерий штаммы СГА существенно отличались по степени восприимчивости к действию LAB. Так, штамм S. pyogenes 3 обладал более высокой устойчивостью к действию всех энтерококков и лактобацилл. В то же время, штаммы 1 и 9 можно отнести к более чувствительным индикаторным культурам. Остальные штаммы стрептококков не отличались по чувствительности к действию использованных в работе LAB (p < 0,1).

Существенное значение имели эксперименты, в ходе которых впервые были выявлены особенности влияния двух штаммов LAB на морфологию стрептококков группы А (рис.1). Пробиотический штамм E. faecium L3 вызывал нарушение морфогенеза фимбриеподобных структур на поверхности S. pyogenes и способствовал образованию удлиненных клеток (коккообацилярной формы).

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3