Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии (стр. 3 )

Таблица 3

Структура реассортантов на основе штамма А/Москва/21/17/65(H2N2)

Были изучены ростовые характеристики реассортантов и родительских штаммов при различных температурах инкубации в РКЭ, а также их репродуктивная активность в легких мышей линии СВА (рис. 2). Было показано, что наследование от ХА штамма шести или пяти генов внутренних и неструктурных белков (независимо от источника происхождения NS-гена) приводило к проявлению реассортантами ts и ca- фенотипа (рис. 2, А)

А. В.

Рис. 2. А – инфекционная активность в куриных эмбрионах при различных температурах инкубации, В – репродукция в дыхательных путях мышей.

Репродукция 6:2 реассортанта в РКЭ при оптимальной температуре оказалась сниженной по сравнению с реассортантом 5:3 и родительским штаммом Москва/17, однако в дыхательных путях мышей такого снижения не наблюдалось (рис. 2, В).

Таким образом, было показано, что мутации, ответственные за холодовую адаптацию штамма А/Москва/21/17/65, локализованы в гене РВ2. Указанные замены расположены в активных доменах субъединицы РВ2 вирусной полимеразы: замена M-202-I локализуется в участке 51-259 аминокислотной последовательности, активном при взаимодействии субъединиц РВ1 и РВ2 вирусной полимеразы, а уникальные близкорасположенные замены V-414-I и G-416-S могут вызывать изменение вторичной структуры белка. Мутация V-65-I в белке NS1 не оказывает влияния на ca- и att-фенотип.

Генетическая стабильность штамма А/Москва/21/17(H2N2), а также сохранение свойств холодовой адаптации и аттенуации реассортантами, полученными на его основе, позволяют его использование в качестве нового донора аттенуации для получения реассортантов, а также в качестве ХА вакцинного штамма в случае возвращения в циркуляцию вирусов А(H2N2).

Молекулярно-генетический анализ и рестриктазное картирование ХА штамма вируса гриппа В/СССР/60/69. Современная реассортантная ЖГВ применяется в виде поливалентного препарата, включающего штаммы всех трех циркулирующих в настоящее время разновидностей вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. Для подготовки реассортантных вакцинных штаммов вируса гриппа В применяется ХА донор аттенуации В/СССР/60/69. Было проведено определение нуклеотидной последовательности донора аттенуации В/СССР/60/69. На основании данных секвенирования была модифицирована схема ОТ-ПЦР-рестрикционного анализа для изучения состава генома реассортантов на его основе. Ранее метод, основанный на идентификации уникальных нуклеотидных различий между генами ХА доноров аттенуации и эпидемических вирусов, был разработан для идентификации мутаций генов внутренних и неструктурных белков донора аттенуации А/Ленинград/143/17/57(H2N2), который в течение многих лет используется для подготовки ХА реассортантных вакцинных штаммов с современными эпидемическими штаммами вирусов гриппа А подтипов Н1 и Н3 (Klimov, Cox, 1993).

Для получения ДНК-копий участков генов внутренних и неструктурных белков донора аттенуации В/СССР/60/69 применяли следующие праймеры, разработанные : PB2-1550 (5’ TGG GGA AGT CAT AAT GG), PB1- 518 (5’ TTT GCC AAG ATA TCA TTG), PA-1061 (5’ AAA TAC AAT AAG TAA TGA GG), NP-1123 (5’ TGG GTA TGA AGC CAT GG), M-8 (5’ GCA CGC ACT TTC TTA AAA TG), NS-6 (5’ AAG CAG AGG ATT TAT TTA G). Комплементарными обратными праймерами были : PB2-r2389 (5' ACA CGA GCA TTT TTC ACT C), PB1-r1399 (5’ CCA TAC ATG TCT CTT CAT C), PA-r2303 (5’ GAA ACA CGT GCA TTT TT), NP - r1838 (5’ GAA ACA ACA GCA TTT TTT AC), M-r1183 (5’ ACA ACG CAC TTT TTC CAG), NS-r 576 (5’ CCC TTT TTA TTG TCA AAC GG). Анализ полученных нуклеотидных последовательностей показал, что гены PB2, PB1, PA, NP и NS ХА донора В/СССР/60/69 имеют нуклеотидные позиции, отсутствующие в геномах современных эпидемических штаммов вируса гриппа В и приводящие к возникновению сайтов рестрикции для Hind III, BspH I, Bcl II, Avr II, Mae I. Анализ нуклеотидной последовательности М гена выявил, что все современные изоляты имеют сайт рестрикции Bgl II, тогда как такой сайт отсутствует в М гене В/СССР/60/69 (табл. 4). Показано, что нуклеотидные замены, обнаруженные в PB1, PA, NP, M и NS генах донора аттенуации В/СССР/60/69, с большой долей вероятности можно считать уникальными, поскольку они не встречались у подавляющего большинства штаммов вируса гриппа В, выделенных в различных регионах мира и принадлежащих к различным генетическим линиям. Хотя нуклеотидная замена в PB2 гене не является уникальной, так как она встречалась у ряда вирусов линии В/Виктория, тем не менее, рестриктаза Hind III может применяться для определения происхождения гена PB2 у реассортантов, полученных на основе ХА донора В/СССР/60/69, поскольку у вирусов гриппа В линии В/Виктория, выделенных после 2002 года, сайт рестрикции для Hind III, характерный для гена PB2 донора В/СССР/60/69, отсутствует.

Таблица 4

Сайты рестрикции, уникальные для донора аттенуации В/СССР/60/69

Выявление целого ряда уникальных нуклеотидных замещений в генах внутренних и неструктурных белков донора аттенуации В/СССР/60/69, указывает на единый характер аттенуации вирусов гриппа А и В, полученных последовательным пассированием при пониженной температуре.

ПОДГОТОВКА И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕАССОРТАНТНЫХ ХА ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ПАНДЕМИЧЕСКИ ОПАСНЫХ ВИРУСОВ ГРИППА

Характеристика вирусов птичьего гриппа, использованных в качестве источника поверхностных антигенов. В процессе отбора потенциальных кандидатов для подготовки вакцинных штаммов против возможных пандемий будущего были изучены характеристики репродукции в РКЭ при различных температурах следующих апатогенных вирусов гриппа птиц: А/утка/Потсдам/1406-86 (H5N2), А/утка/Вьетнам/342/01 (H5N1), А/дикая утка/Нидерланды/12/00 (H7N3), А/Гонконг/1073/99 (H9N2), А/перепел/Гонконг/6/97 (H9N2), А/курица/Гонконг/G9/97 (H9N2). Показана высокая степень температуроустойчивости всех вышеперечисленных вирусов: показатели роста при 400С не отличались или были выше, чем при 34 и 370С, только при повышении температуры до 410С наблюдалось снижение репродукции на 3-4 lg ЭИД50/мл. Для реассортации классическими методами в куриных эмбрионах были выбраны вирусы А/утка/Потсдам/1406-86(H5N2) [H5N2-дт], А/дикая утка/Нидерланды/12/00 (H7N3) [H7N3-дт], А/перепел/Гонконг/6/97(H9N2) антигенной линии G1 [H9N2-дт]. Молекулярно-генетический анализ НА родительских штаммов «дикого» типа показал, что все они содержат в сайте протеолитического расщепления гемагглютинина один остаток аргинина – признак, характерный для низкопатогенных вирусов. Анализ тяжелой цепи гемагглютинина НА1 вирусов подтипа Н5 показал наличие аминокислотных различий между родительским вирусом, использованным для подготовки реассортантного вакцинного штамма подтипа А(H5N2) - А/утка/Потсдам/1402-6/86 – и вирусами, выделенными в Гонконге в 1997 году (95-96% гомологии), а также вирусом A/Гонконг/213/03(H5N1) (94% гомологии). Количество аминокислотных различий между А/утка/Потсдам/1402-6/86(H5N2) и другими более поздними изолятами A(H5N1) находится в пределах 9-11%. Родительские «дикие» штаммы подтипа A(H9N2) и A(H7N3) были на 98% идентичными изолятам, выделенным от больных в Гонконге в 1999 г. и в Нидерландах в 2003 г.

Ростовые характеристики реассортантов птичьих вирусов при различных температурах инкубации в РКЭ. Для детального исследования были отобраны реассортанты, содержащие все значащие мутации в генах внутренних и неструктурных белков, описанные ранее для ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/57(H2N2) [Лен/17]. С помощью ОТ-ПЦР-рестрикционного анализа и секвенирования генов НА и NA было показано, что реассортант А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) [Лен 17/Н5] унаследовал от «дикого» вируса только ген НА, а остальные 7 генов – от донора аттенуации Лен/17 (формула генома 7:1). Реассортанты подтипов Н7N3 и Н9N2 - А/17/дикая утка/Нидерланды/00/84 (H7N3) [Лен 17/Н7] и А/17/перепел/Гонконг/97/86 (H9N2) [Лен 17/Н9] - имели формулу генома 6:2, так как унаследовали гены НА и NA от «диких» родительских штаммов. Показано, что все реассортанты вирусов гриппа птиц на основе холодоадаптированного донора аттенуации Лен/17 обладают высокой продуктивностью в РКЭ (8,5-9,6 lg ЭИД 50/мл) и устойчиво проявляют ts- и ca- фенотип, то есть свойства, характерные для ХА донора аттенуации (табл.5).

Таблица 5

Репродукция в куриных эмбрионах реассортантов апатогенных вирусов

гриппа птиц

Оценка безвредности для кур ХА реассортантов, содержащих гены вирусов птичьего гриппа. Данный раздел работы был выполнен совместно с ветеринарной лабораторией, г. Афины, США под руководством Д. Свэйна. Для оценки аттенуации при введении курам использовали реассортанты вирусов птичьего гриппа подтипов А(H5N2) и А(H7N3) на основе Лен/17, а также родительские птичьи вирусы и донор аттенуации Лен/17. Патогенность определяли при внутривенном (в/в) введении стандартного разведения (10-1) вирусного материала (табл.6). «Дикий» вирус подтипа А(H5N2), а также ХА реассортанты подтипов А(H5N2) и А(H7N3) были безвредными и не вызывали развития инфекции. Из всех исследованных вирусов только «дикий» вирус H7N3-дт проявлял токсичность при в/в введении, когда развитие инфекции и смертность на 7-8 сутки наступали в 5 случаях из 8. После интраназального введения птичий вирус H7N3-дт был выделен из ротоглоточных и клоакальных смывов на 3-й день после инфекции в средних титрах 1,1-0,9 lg ЭИД50/мл. ХА реассортант данного подтипа не выделялся и не вызывал сероконверсий по данным радиальной иммунодиффузии в агарозном геле. Реассортант А(H5N2) и родительский вирус этого подтипа H5N2-дт, а также донор аттенуации Лен/17 также не были выделены после интраназального введения и не вызывали сероконверсий.

Таблица 6

Оценка безвредности и инфекционной активности реассортантов при внутривенном (в/в) и интраназальном введении курам

Таким образом, было установлено, что приобретение реассортантами «внутренних» генов донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) приводило к полной их аттенуации для кур. ХА реассортанты, являясь адаптированными к пониженной температуре репродукции и гиператтенуированными для кур, оказались неспособными ни инфицировать птиц, температура тела у которых значительно выше, чем у человека, ни выделяться от них в окружающую среду.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7