Пути усовершенствования живой гриппозной вакцины и тактики ее применения при подготовке к пандемии (стр. 2 )

Таблица 1

Нуклеотидные замещения в генах ХА штамма A/Москва/21/17/65(H2N2) по сравнению с пассажным вариантом A/Москва/21/65(H2N2)

*А>G

Замена триптофана на аргинин в 723 положении белка PB1 Москва/21/17 встречается у большинства проанализированных эпидемических вирусов и, таким образом, не может привносить изменений в сторону холодовой адаптации. Отсутствие отличий в РА белке Москва/21/17 от пассажного варианта подтверждает данные о роли отдельных генов, полученные на модели одногенных реассортантов на основе ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/57(H2N2) (Киселева, 2001), когда было показано, что наследование только РА гена от ХА варианта не приводило к аттенуации, если остальные гены происходили от исходного штамма «дикого типа».

Нуклеотидная замена в гене NP является незначащей и прослеживается на электрофореграмме в виде двойного пика с преобладанием А над G у ХА варианта и G над А у его предшественника. Эта мутация не является уникальной, так как встречается также у эпидемического штамма А/Энн Арбор/67. Уникальная мутация в М-гене штамма Москва/21/17 (T-182-A), приводящая к замене в мембранном белке М1, сопровождается изменениями свойств гидрофобности. Ранее при изучении роли отдельных генов в аттенуации штамма А/Ленинград/134/57(H2N2) было показано, что присутствие в геноме вирулентного штамма М-гена от ХА варианта не приводило к проявлению ts- и ca- фенотипа (Киселева, 2001).

Мутация в гене NS приводит к аминокислотной замене в белке NS1 (I-65-V), которая расположена в N-концевом участке α-спирали, состоящем из 73 аминокислот, который является эффекторным доменом взаимодействия с РНК (Qian et al., 1994), а также играет ключевую роль в модулировании таких факторов врожденного иммунитета, как интерферон α/β (Wang et al., 2000). Эта мутация является уникальной, однако, как будет продемонстрировано ниже, оказалось, что замещение NS-гена Москва/21/17 на NS-ген эпидемического вируса не приводило к изменению ts- и ca- фенотипа. Ранее в исследованиях in vitro было показано, что уровни индукции ранних цитокинов ХА реассортантными штаммами A(H1N1) и A(H3N2) на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) в основном совпадали с аналогичными показателями для эпидемических вирусов соответствующего серотипа. Индукция интерферона I типа ХА реассортантами оказалась сниженной по сравнению с эпидемическими родителями. Изучение одногенных реассортантов, включающих мутантные гены донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2), показало, что включение генов РВ2 или РВ1 в состав реассортантов значительно снижало продукцию ранних цитокинов, включая и интерферон I типа, при инфицировании эпителиальных макрофагов человека. В то же время, в отношении реассортантов, включающих мутантный М или NS гены, такого снижения не наблюдалось (Rekstin et al., 2006).

Локализация мутации в гене НА, приводящей к аминокислотной замене в одном из петлеобразных участков глобулярной части тяжелой цепи НА1, свидетельствует, что она могла появиться в процессе адаптации при длительном пассировании в РКЭ (Каверин с соавт., 2000). В гене нейраминидазы различий не выявлено.

Был проведен сравнительный анализ известных последовательностей генов внутренних и неструктурных белков таких доноров аттенуации подтипа H2N2, как А/Ленинград/134/17/57 (Klimov, Cox, 1988), А/Энн Арбор/6/60 (Maassab, 1969) и ХА штамма, полученного пассированием на культуре клеток Vero: А/Сингапур/1/57са (Romanova et al., 2004). Результаты представлены в таблице 2. Общим признаком для всех ХА штаммов является полигенный характер изменений, приводящих к проявлению са- и att- фенотипа при традиционном способе получения ХА штаммов, то есть методом последовательного пассирования при пониженной температуре, даже если это пассирование осуществляется в различных системах (куриные эмбрионы, первичные или перевиваемые культуры). Cопоставление данных о мутациях в различных генах и генных продуктах внутренних и неструктурных белков различных ХА штаммов подтипа A(H2N2) указывает на отсутствие каких-либо универсальных позиций в их геномах, мутации в которых должны приводить к аттенуации. Исключение составляет замена аланина в позиции 86 белка М2 на серин у штамма А/Энн Арбор/6/60 или треонин у штамма А/Ленинград/134/17/57, однако по данным Jin et al. (2003) эта мутация не связана с температурочувствительностью. Еще одним исключением является незначащая нуклеотидная замена в 813 положении гена NS вирусов А/Энн Арбор/6/60 (А→G) и ХА А/Сингапур/1/57са.

Таблица 2

Мутации в генах негликозилированных белков ХА штаммов А(H2N2)

Данные сравнительного анализа подтвердили, что наибольшим изменениям подвергаются гены полимеразного комплекса холодоадаптированных штаммов. Большинство нуклеотидных замен в этом случае сопровождается аминокислотными замещениями в соответствующих полимеразных субъединицах. Во всех случаях наиболее консервативным является белок NP. Аминокислотные замещения в NP-белке ХА вариантов по сравнению с «дикими» штаммами или отсутствуют (А/Ленинград/134/17/57, А/Сингапур/1/57ха), или существенно не влияют на структурную организацию белка. Во всех случаях множественный характер изменений в геноме ХА штаммов указывает на последовательную сопряженную эволюцию различных белковых субъединиц в процессе серийных пассажей при пониженной температуре. Эти сочетанные изменения в различных генах доноров аттенуации могут обеспечивать генетическую стабильность реассортантов на основе подобных штаммов.

Далее была поставлена задача оценить генетическую стабильность штамма А/Москва/21/17 и потенциальную возможность его применения как нового донора аттенуации. С этой целью были получены полигенные реассортанты с современным эпидемическим вирусом А/Новая Каледония/20/99(H1N1). Один из реассортантов унаследовал от эпидемического вируса гены HA и NA (структура генома 6:2), а другой помимо этого еще NS-ген (структура генома 5:3) (табл. 3). Секвенирование показало сохранность всех мутаций в генах внутренних и неструктурных белков, приобретенных реассортантами от ХА родителя А/Москва/21/17.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7