Wat zijn de implicaties van gemodificeerde nucleïnezuren en DNA-structuren voor biotechnologie en genetische therapieën?

De efficiëntie waarmee peptidenucleïnezuren (PNAs) membranen passeren is geringer dan bij natuurlijke nucleïnezuren. Om deze beperking te overwinnen, worden liposomen vaak ingezet als hulpmiddelen voor de celafgifte van PNAs. Aan de andere kant zijn LNA's (locked nucleic acids) stabiele RNA-derivaten die bestand zijn tegen nucleasen. In LNA's is de 2'-hydroxylgroep van het suiker gekoppeld aan het C4'-atoom via een methyleengroep (CH2), wat resulteert in een rigide bicyclische ringstructuur die de furanose in de C3'-endo configuratie vergrendelt. Deze specifieke structuur heeft belangrijke implicaties voor de stabiliteit en interactie van de LNA’s met nucleïnezuurstrengen, waarbij ze zich binden aan complementaire RNA- en DNA-strengen met een uitzonderlijk hoge affiniteit. Dit komt voort uit de rigiditeit van de gemodificeerde ribose, die de entropische kosten voor het vormen van duplexen verlaagt.

LNA’s behouden echter de negatief geladen ribose-fosfaatruggegraat, wat hen onderscheidt van PNAs. In tegenstelling tot LNA’s, die een minder flexibele structuur vertonen, hebben PNAs een neutrale polyamide ruggegraat, wat hun effectiviteit bij het binden aan nucleïnezuren beperkter maakt, vooral op genetisch niveau. Dit verschil in flexibiliteit tussen LNA’s en RNA betekent dat LNA’s minder structurele variabiliteit vertonen, wat een belangrijke beperking vormt voor hun gebruik in bepaalde toepassingen.

Triplexstructuren kunnen verschillende vormen aannemen, afhankelijk van de samenstelling van de sequentie en de oriëntatie van de derde streng ten opzichte van de poly-purinestreng van de duplex. In het TC-triplex vormt de pyrimidinerijke derde streng bijvoorbeeld parallel aan de purinerijke streng van de duplex. Dit resulteert in triplets van T·A-T en C+·G-C via Hoogsteen interacties. Triplets die C+·G-C-paarvorming omvatten, vereisen een lage pH om het N3-atoom van cytosine te protoneren. Dit aspect heeft toepassingen in de gene-silencing en genbewerking, waar oligonucleotiden die triplexen vormen met promoterregio’s in het genoom kunnen worden gebruikt voor het afsilenceren van genen. Dit maakt de triple-helixbenadering bijzonder aantrekkelijk voor de gerichte levering van moleculen of eiwitten naar specifieke locaties in het DNA, door bijvoorbeeld crosslinkingagentia, nucleasen of transcriptiefactoren te koppelen aan triplex-vormende oligonucleotiden.

Naast hun rol in de nucleus kunnen G-quadruplexen zich ook vormen in mRNA en mogelijk betrokken zijn bij de controle van de translatie. De vorming van dergelijke secundaire structuren in mRNA kan invloed hebben op de vertaling van genen en biedt mogelijkheden voor het reguleren van eiwitproductie.

De dynamiek van dergelijke structuren heeft grote implicaties voor de moleculaire genetica en biotechnologie. Het vermogen om DNA-structuren te manipuleren, of het nu gaat om triplexen, quadruplexen of hogere-orde structuren, biedt veelbelovende mogelijkheden voor genetische therapieën en het gerichte ingrijpen in cellulaire processen.

Hoe anomalne verstrooiing de fasen in röntgenkristallografie beïnvloedt

In röntgenkristallografie is het begrijpen van de anomalne verstrooiing cruciaal voor het bepalen van de structuur van moleculen. Wanneer een kristal wordt bestraald met röntgenstralen, verstrooien de atomen in het kristal deze stralen. De mate van verstrooiing wordt beïnvloed door de elektronen in de atomen, wat resulteert in een verstrooiingsfactor die afhangt van de energie van de röntgenstralen. Echter, in sommige gevallen kunnen atomen in het kristal anomalne verstrooiing vertonen, wat de analyse complexer maakt.

In een kristal waar anomalne verstrooiing aanwezig is, kunnen de structuurfactoren van eiwitten en hun Friedel-maten worden gemeten om de positie van de anomalne scatterers te berekenen via een anomalne verschil-Pattersonkaart. Dit proces is vergelijkbaar met het gebruiken van een verschil-Pattersonkaart bij het lokaliseren van zware atomen via isomorfe vervangingen, maar het voordeel van anomalne diffractie is dat de verschillen worden berekend met gegevens binnen één dataset, wat de problemen van niet-isomorfisme vermijdt.

De gegevens van anomalne diffractie kunnen worden verzameld op een golflengte waarop de anomalne verstrooiing maximaal is, zoals de piek van de absorptie van een element. Dit is de techniek die bekendstaat als Single Wavelength Anomalous Dispersion (SAD). Bij SAD wordt de anomalne informatie van één golflengte gebruikt om fasen te berekenen. SAD heeft een fase-ambiguïteit, vergelijkbaar met de Isomorphous Replacement (SIR) techniek, maar deze kan vaak worden opgelost door densiteitsmodificatie. Dit biedt de mogelijkheid om zeer gedetailleerde structuren van eiwitten te bepalen, zelfs wanneer zwakke signalen van bijvoorbeeld zwavelatomen in Cys en Met gemeten worden. Het gebruik van deze techniek voor eiwitten kan de standaardmethode worden voor de de novo bepaling van eiwitkristalstructuren.

Als de SAD-techniek niet succesvol is, kan Multiple Wavelength Anomalous Dispersion (MAD) worden toegepast. Dit vereist het verzamelen van datasets bij verschillende golflengtes, waaronder de piek en inflectiewaarden van de absorptie, wat resulteert in verbeterde fasen. MAD biedt vaak betere resultaten dan SAD, maar het vereist meer tijd voor gegevensverzameling en verwerking. Bij het gebruik van MAD is het belangrijk om voorzichtig te zijn met stralingsbeschadiging, aangezien deze de reflectie-intensiteiten aanzienlijk kan veranderen en de magnitude van het anomalne signaal kan overschaduwen.

Het toevoegen van dergelijke anomalne scatterers kan de kwaliteit van de elektronenkaart aanzienlijk verbeteren. Hoewel de toevoeging van zware atomen, zoals Se-Met, een voordeel biedt voor de phasering, kunnen deze modificaties ook de oplosbaarheid en stabiliteit van eiwitten beïnvloeden. Het gebruik van Se-Met kan bijvoorbeeld de hydrophobiciteit van eiwitten verhogen, wat hun oplosbaarheid kan verlagen, wat weer van invloed kan zijn op de kwaliteit van de kristallen.

Anomalne verstrooiing, zowel via de SAD- als de MAD-techniek, biedt krachtige middelen voor het oplossen van kristalstructuren. Dit zijn geavanceerde technieken die van essentieel belang zijn voor het verkrijgen van gedetailleerde en nauwkeurige moleculaire modellen, wat niet alleen voor fundamenteel wetenschappelijk onderzoek, maar ook voor toepassingen in de farmaceutische industrie van groot belang is.