Absorptiemetingen spelen een cruciale rol in het kwantificeren van biomoleculen. Fluorescente moleculen, die typisch worden gebruikt in spectroscopie, hebben vaak grote extinctiecoëfficiënten. De hoogste waarden voor eenvoudige organische fluoroforen, die in typische systemen worden aangetroffen, overschrijden zelden de 200.000 M⁻¹cm⁻¹. Er zijn echter uitzonderingen, zoals Cy5, Cy5.5 en Cy7, die extinctiecoëfficiënten van 250.000 M⁻¹cm⁻¹ of hoger vertonen. Dit benadrukt een belangrijke beperking: met een padlengte van 1 cm ligt het praktische concentratiebereik voor de kwantificering van biomoleculen via absorptie tussen 10⁻⁴ en 10⁻⁷ molair. Dit bereik is essentieel bij het interpreteren van spectrale gegevens in veel biologische experimenten.

De term "transmissie" verwijst naar de hoeveelheid licht die door een monster heen gaat, wat wordt uitgedrukt als T = I/I₀. De absorptie, A, is dan gelijk aan -log₁₀(T). Als een monster een optische dichtheid van 1 heeft, betekent dit dat slechts 10% van het incident licht door het monster wordt doorgelaten, terwijl 90% wordt geabsorbeerd. Optische dichtheden van 2 en 0,3 corresponderen respectievelijk tot 99% en 50% absorptie van licht. Dit concept speelt een rol bij het begrijpen van de zogenaamde "inner filter effect", zoals verder besproken in hoofdstuk 3.

De absorptiemetingen worden vaak uitgevoerd met een spectrofotometer, waarbij licht van een deuterium- of halogeenlamp wordt gebruikt, afhankelijk van het golflengtebereik. Deze instrumenten zijn meestal ontworpen volgens het zogenaamde "dubbelstraal"-systeem, waarbij het geabsorbeerde licht van het monster in real-time wordt vergeleken met dat van een blanco-oplossing, zoals een oplosmiddel of buffer. De spectrofotometer berekent vervolgens de absorptie of transmissie op een specifieke golflengte of door een reeks golflengten te scannen.

Als de extinctiecoëfficiënt van een verbinding bekend is, kan de optische dichtheid worden gebruikt om de concentratie van die verbinding te berekenen. Bijvoorbeeld, bij een optische dichtheid van 1,0 voor een alkalisch fluoresceïne-oplossing bij 490 nm, en een extinctiecoëfficiënt van 80.000 M⁻¹cm⁻¹, wordt de concentratie berekend op 1,25 × 10⁻⁵ M. Absorptiemetingen bij 280 nm zijn bijzonder nuttig voor het schatten van de concentratie van eiwitten, vooral als de aminozuursequentie van het eiwit bekend is. Met behulp van een eenvoudige formule kan de eiwitconcentratie nauwkeurig worden geschat, rekening houdend met het aantal tryptofaan-, tyrosine- en cystine-residuen.

Toch zijn er uitdagingen die men moet begrijpen bij het gebruik van absorptiemetingen. De Beer-Lambert-wet, die stelt dat er een lineaire relatie bestaat tussen concentratie en absorptie, houdt niet altijd stand in de praktijk. In de vroege dagen van commerciële spectrofotometers waren afwijkingen vaak het gevolg van instrumentgebreken zoals fluorescentie of parasitair licht, dat licht op ongewenste golflengten dat de detector bereikte. Deze fenomenen kunnen leiden tot een kunstmatig lage absorptie. Zo kan een optische dichtheid van 2, waarbij slechts 1% van het licht bij de detector komt, verstoord worden door parasitair licht, wat het resultaat vertekent.

Moderne spectrofotometers zijn meestal goed ontworpen om dergelijke problemen te minimaliseren. Als het echter absoluut noodzakelijk is om de optische dichtheid van een sterk absorberende oplossing te meten en het monster niet kan worden verdund, kan men een cuvet gebruiken met een kortere padlengte. Deze cuvetten, die in hoofdstuk 3 worden besproken, verminderen de optische dichtheid tot een beheersbaar niveau. Daarnaast zijn er nieuwere soorten absorptiemetingen, zoals de Thermo Scientific™ NanoDrop™ One Spectrofotometer, die absorptie in een zeer klein volume, meestal tussen de 0,5 en 2 µl, kunnen meten. Deze instrumenten bieden de mogelijkheid om veel meer geconcentreerde oplossingen te analyseren dan met conventionele spectrofotometers met een padlengte van 1 cm.

Een ander probleem bij absorptiemetingen is lichtscattering, of turbidity, die vaak voorkomt bij biologische monsters zoals membraaneiwitten of aggregaten van eiwitten. Turbiditeit kan worden gemeten met behulp van optische dichtheid of absorptie, maar het is essentieel om te begrijpen dat deze metingen niet altijd de werkelijke absorptie van licht weerspiegelen. Turbiditeit is namelijk gerelateerd aan de optische dichtheid door een factor 2,303, wat de conversie van natuurlijke logaritmen naar logaritmen van basis 10 weerspiegelt. Het is belangrijk te beseffen dat scattering de meetresultaten kan verstoren, vooral bij oplossingen die eiwitten bevatten die zich kunnen aggregaten of bij membraaneiwitten die lichte verstrooiing veroorzaken.

In samenvatting moeten wetenschappers zich bewust zijn van de beperkingen van absorptiemetingen, vooral in biologische systemen waar complexiteit en verstoringen door aggregatie of scattering veel voorkomende uitdagingen zijn. Het is van belang om de juiste apparatuur te gebruiken, het effect van scattering goed te begrijpen, en, indien nodig, de monsterconcentratie te optimaliseren om nauwkeurige en betrouwbare resultaten te verkrijgen.

Hoe Correctie van Emissiespectra de Nauwkeurigheid van Fluorescentiemetingen Verbetert

Het verschijnsel van de Stokes-verschuiving is fundamenteel voor de interpretatie van fluorescentiespectra. De verschuiving van de absorptie- naar de emissielijn ontstaat doordat de energie van de geëxciteerde toestand in de meeste gevallen lager is dan de energie van de geabsorbeerde foton. Dit wordt vaak verklaard door de gelijkenis tussen de energieën van de vibratiemanifolds in de grondtoestand en de eerste geëxciteerde elektronische toestand. Dit maakt het mogelijk om de absorptie- en emissiespectra te beschouwen als spiegelbeelden van elkaar, vooral wanneer deze in energie-eenheden worden uitgezet, zoals omgekeerde golflengten. Dit wordt vaak visueel weergegeven met behulp van het Perrin–Jabłoński diagram, hoewel dit diagram niet alle mogelijke excitatietoestanden en relaxatieprocessen weergeeft, zoals dipolaire relaxatie of intersysteemovergang, die in latere hoofdstukken aan bod zullen komen.

Naast de Stokes-verschuiving zijn er echter nog andere aspecten van spectrale metingen die de nauwkeurigheid kunnen beïnvloeden, en deze moeten gecorrigeerd worden om een "echte" moleculaire spectrum te verkrijgen. Emissiespectra zoals die van fluoresceïne, die vaak in wetenschappelijke literatuur worden gepresenteerd, zijn in werkelijkheid "onbewerkte" spectra. Ze geven niet de werkelijke moleculaire emissie weer, omdat de optische en elektronische apparaten die worden gebruikt voor metingen, zoals monochromators en fotomultiplicatorbuizen (PMT), niet perfect reageren op verschillende golflengten. De spectra die worden getoond, moeten worden gecorrigeerd voor deze instrumentale afwijkingen, en deze correctie is cruciaal voor de nauwkeurigheid van de spectroscopische gegevens.

Het proces van het corrigeren van emissiespectra begint met het identificeren van de achtergrondsignalen die door de oplosmiddelen of verontreinigingen in de oplossing kunnen worden gegenereerd. De emissie van het oplosmiddel kan soms veel sterker zijn dan de fluorescente emissie van de onderzochte moleculen, wat de interpretatie van de spectrale data bemoeilijkt. In dergelijke gevallen moet de achtergrond van het oplosmiddel worden gemeten met precies dezelfde instellingen die voor de monsters worden gebruikt. Dit houdt in dat de instellingen van de monochromator, de spanning van de fotomultiplicator en de versterkingsfactoren zorgvuldig moeten worden gecontroleerd.

Als het signaal van de achtergrond echter niet significant is, kan het achtergrondsubstractieproces worden overgeslagen, hoewel dit in de praktijk zelden het geval is. Er bestaan systemen die automatisch achtergrondcorrectie uitvoeren, maar het is belangrijk om niet blindelings op dergelijke functies te vertrouwen. De gebruiker moet altijd zelf verifiëren hoe groot de invloed van de achtergrond daadwerkelijk is, bijvoorbeeld door te beoordelen of de achtergrond slechts een klein percentage van het signaal bedraagt of juist een groot percentage. Dit geeft inzicht in de mate van correctie die noodzakelijk is.

Naast de achtergrond zijn er andere spectrale artefacten, zoals Ramanverstrooiing, die invloed kunnen hebben op de gemeten emissiespectra. Watermoleculen vertonen specifieke O-H stretchfrequenties die de Ramanverstrooiing veroorzaken, wat leidt tot een verlies van energie in het verstrooide licht. Dit fenomeen wordt vaak als een storende factor gezien, maar het kan in feite ook worden gebruikt als een norm voor de intensiteit van de lichtbron in een spectrometer. Door de Ramanverstrooiing van water te meten, kan men de prestaties van de lichtbron monitoren en aangeven wanneer de lamp minder licht levert dan verwacht. Dit kan bijvoorbeeld wekelijks worden gecontroleerd door de intensiteit van de Ramanverstrooiing te monitoren bij een constante oplichtingsinstelling.

Na de correctie voor achtergrondsignalen, moet ook rekening worden gehouden met de intrinsieke kenmerken van het gebruikte instrument. Het is essentieel om de spectrale respons van het systeem te corrigeren door gebruik te maken van gestandaardiseerde lampen die nauwkeurig zijn gekalibreerd. Deze lampen kunnen worden gebruikt om een "lampcurve" te genereren, die vervolgens kan worden vergeleken met gestandaardiseerde gegevens van bijvoorbeeld het Nationale Bureau voor Standaarden (NBS) om correctiefactoren voor het systeem te bepalen. Dit zorgt ervoor dat het uiteindelijk gemeten spectrum het "echte" moleculaire spectrum van het monster weerspiegelt.

Veel moderne spectrofluorimeters zijn uitgerust met software die automatisch de nodige correcties uitvoert, wat de procedure vereenvoudigt. Toch moeten gebruikers er zich van bewust zijn dat de vervanging van onderdelen zoals de PMT de noodzaak kan creëren om nieuwe correctiefactoren te genereren, wat de consistentie van de spectrale gegevens beïnvloedt. In dit geval kan het handig zijn om bekende standaarden te gebruiken die reeds gecorrigeerde of moleculaire spectra bevatten, zoals die welke beschikbaar zijn bij wetenschappelijke leveranciers zoals Sigma-Aldrich.

Samenvattend is het correct uitvoeren van de spectrale metingen van cruciaal belang om betrouwbare gegevens te verkrijgen in fluorescentieonderzoek. De achtergrondcorrectie, het beheren van Ramanverstrooiing en de instrumentele calibratie zijn de belangrijkste stappen om ervoor te zorgen dat het uiteindelijke spectrum nauwkeurig de moleculaire eigenschappen van het monster weerspiegelt. Bij het uitvoeren van spectroscopische metingen is het essentieel om altijd bewust te zijn van de instrumentele variaties en de noodzaak om met de juiste normen te werken voor nauwkeurige en reproduceerbare resultaten.

Hoe Ionensensoren en Fluorescente Probes de Biologische Wetenschappen Revoluteren

Ionensensoren hebben de laatste decennia een cruciale rol gespeeld in het monitoren van cellulaire processen, waarbij fluorescentie als een van de meest toegepaste technieken naar voren is gekomen. Een belangrijk voorbeeld hiervan zijn aptamers, die, door hun vermogen om specifieke doelwitten te binden, als biosensoren kunnen worden gebruikt. Deze aptamers worden vaak geïdentificeerd door middel van SELEX-procedures (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), wat hen in staat stelt om te reageren op specifieke moleculen zoals cocaïne, zoals geïllustreerd in de toepassing van een split-aptamersensor. Dit type biosensor is in staat om de dissociatiesnelheid van het split-aptameer te meten in functie van de concentratie van het doelmolecuul.

Naast aptamers zijn er ook biosensoren die de levensduur van fluorescentie gebruiken in plaats van de intensiteit om biologische parameters te monitoren. Deze techniek biedt voordelen bij het meten van fluctuerende ionen en moleculen, zoals calcium, in levende cellen. Mehl et al. (2024) beschrijven bijvoorbeeld de toepassing van merocyanine-kleurstoffen voor het kwantificeren van de subcellulaire concentratie van geactiveerd Cdc42, een eiwit dat betrokken is bij celregulatie. Fluorescentie in de levensduurmodus, oftewel FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), stelt onderzoekers in staat om de ruimtelijke en temporele variaties van deze eiwitten nauwkeuriger te monitoren dan via intensiteitsmetingen, die veel meer afhankelijk zijn van de concentratie van de probe zelf.

De noodzaak voor het detecteren van zware metalen in het milieu en in biologische systemen heeft geleid tot de ontwikkeling van verschillende biosensoren die specifiek zijn voor ionen zoals Pb²⁺, Hg²⁺, As³⁺, en anderen. Deze ionen zijn niet alleen schadelijk voor de gezondheid, maar kunnen ook de stabiliteit van ecosystemen ernstig verstoren. Het detecteren van deze ionen kan bijdragen aan het verbeteren van de volksgezondheid en het monitoren van verontreinigingen in natuurlijke hulpbronnen.

Wanneer we het hebben over ionensensoren, is het belangrijk om te begrijpen dat ze in wezen biosensoren zijn die specifiek reageren op de aanwezigheid van een ion in een bepaald biologisch systeem. De evolutie van iongevoelige micro-elektroden naar fluorescentie-gevoelige probes heeft het mogelijk gemaakt om gedetailleerde informatie te verkrijgen over ionconcentraties en -verdelingen in levende cellen. De meest gebruikte fluorescentieprobes voor calcium zijn gebaseerd op BAPTA (1,2-bis(o-aminofenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraazijnzuur), dat twee calciumionen kan binden, wat een verandering in de excitatie- of emissiespectra van de gekoppelde fluoroforen veroorzaakt. Deze probes maken het mogelijk om calciumconcentraties ratiometrisch te meten, wat helpt om de nauwkeurigheid van de metingen te verbeteren, vooral in complexe levende systemen waar de probeconcentratie niet uniform is.

Bovendien zijn de chemische eigenschappen van de chelerende moleculen die in deze probes worden gebruikt, van cruciaal belang. Het moet niet alleen selectief zijn voor het doelion, maar ook een dissociatieconstante hebben die geschikt is voor de specifieke toepassing. De uitdagingen hierbij zijn groot, vooral gezien de complexiteit van biologische systemen en de behoefte aan probes die zowel gevoelig als selectief zijn voor specifieke ionen. Dit geldt niet alleen voor calcium, maar ook voor andere ionen zoals natrium, magnesium, kalium, zink en chloor.

Wat betreft pH-probes, is het belangrijk om te weten dat de bepaling van de zuurgraad in cellen van essentieel belang is voor het begrijpen van een breed scala aan biochemische en fysiologische processen. In 1909 introduceerde de Deense chemicus Søren Peder Lauritz Sørensen de pH-schaal, die later werd geformaliseerd als een universele maatstaf voor zuur- en alkaliteit. Het meten van de pH in levende cellen is van groot belang omdat de intracellulaire pH invloed heeft op vitale processen zoals celgroei, apoptose, endocytose, ionentransport, en eiwitvouwing. Diverse ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratieve aandoeningen zoals Alzheimer, worden geassocieerd met abnormale pH-waarden in cellen.

De moderne technologieën voor pH-metingen in cellen, zoals het gebruik van fluorescente pH-sensoren, maken het mogelijk om de pH in specifieke organellen of subcellulaire compartimenten te bepalen. Het gebruik van litmus en andere traditionele indicatoren heeft plaatsgemaakt voor geavanceerdere probes die op basis van hun fluorescentie in staat zijn om veranderingen in de pH te detecteren. Dit is van cruciaal belang voor onderzoek naar de rol van pH in ziekteprocessen en voor het monitoren van de fysiologische toestand van cellen in verschillende omgevingen.

Naast het gebruik van ratiometrische metingen bij calcium, kunnen ook levensduurmetingen van fluorescentie nuttig zijn om de mate van ionbinding te bepalen. Omdat de levensduur een intrinsieke eigenschap is van het molecuul en niet afhankelijk is van de concentratie van de probe, kan dit waardevolle informatie opleveren, vooral in levende cellen waar variaties in concentratie door de cel heen de resultaten van intensiteitsmetingen kunnen verstoren.

Een ander belangrijk aspect bij het ontwerpen van ionensensoren is de moleculaire afgifte van de probe in de cellen. Vaak worden de meest populaire probes in hun ester-vorm aangeboden, zodat ze door de celmembranen kunnen diffunderen en intracellulair geactiveerd worden door esterases. Dit maakt de technologie gemakkelijker toepasbaar in real-time studies van levende cellen.

Hoe Richard Hooker Gods Wetten Begrijpt: Natuurwetten en Openbaring
Wat is de toekomst van post-liberalisme in de politieke sfeer?
Hoe wordt de Vibratie-Hamiltoniaan van Watermoleculen Geconstrueerd?
Hoe wordt de wet van Fick toegepast in de nucleaire reactorfysica?