Hoe Fluorescentie- en Absorptiemetingen de Keuze van Cuvettes Beïnvloeden

De meeste in vitro fluorescentiemetingen worden uitgevoerd met behulp van fluorescentie-cuvettes. Wie een website bekijkt die cuvettes aanbiedt, komt al snel verschillende variaties tegen, afhankelijk van het materiaal, de padlengtes en de geometrieën. In dit hoofdstuk worden de meest gangbare cuvettes besproken, evenals de keuzecriteria die van invloed zijn op hun gebruik in specifieke toepassingen.

Absorptie-cuvettes, hoewel goedkoper, kunnen de nauwkeurigheid van de metingen in sommige gevallen beïnvloeden. Een absorptiecuvette kan de intensiteit van de metingen maar licht verminderen—ongeveer 10% in het geval van het instrument dat in een test werd gebruikt. Echter, deze cuvettes veroorzaken vaak ongewilde verstoringen, vooral bij polarimetrische metingen, doordat de niet-gepolijste wanden van de cuvette het licht kunnen verstrooien. Dit kan resulteren in een lagere gemeten polarisatie van de fluorescerende lichtsignalen.

Er zijn ook verschillende innovaties geweest op het gebied van cuvettes. Zo werd er tijdens mijn onderzoek een oude maar effectieve oplossing bedacht waarbij twee aangrenzende zijden van een fluorescentiecuvette werden voorzien van een spiegelcoating. Het idee was dat de excitatielichtstraal dan door het monster heen zou reflecteren en de fluorescerende straling zou zich terugkaatsen naar de detector. Deze aanpak verbeterde het signaal met maar liefst drie keer, wat aanvankelijk als een nieuwe vondst werd beschouwd. Later bleek echter dat dit idee al eerder was toegepast door wetenschappers als Francis Perrin en Gregorio Weber.

Naast de standaardmaterialen voor cuvettes, zoals glas en kwarts, worden er nu ook kunststof cuvettes gebruikt. Deze laatste zijn aanzienlijk goedkoper, maar hebben een beperktere transmissiecapaciteit, vooral bij het meten van ultraviolet licht. Terwijl glas tot ongeveer 300 nm kan meten, kan kwarts tot een veel lagere golflengte doorgelaten worden, soms zelfs tot 200 nm. Desondanks vertoont kwarts, vooral van lagere kwaliteit, vaak eigen fluorescerende eigenschappen die de metingen kunnen verstoren. Voor toepassingen die zich in het ultraviolet bevinden, wordt daarom meestal Suprasil-kwarts aanbevolen, omdat dit zeer weinig fluorescerende verontreiniging vertoont.

Bij de keuze van een cuvette is ook de padlengte van groot belang. De meeste cuvettes hebben een padlengte van 1 cm, maar in sommige gevallen kunnen kleinere cuvettes nodig zijn, vooral wanneer de monsterhoeveelheid beperkt is of wanneer de concentratie van het monster hoog is. Voor dergelijke situaties zijn er kleinere cuvettes beschikbaar, zoals de T-vormige cuvettes of vierkante cuvettes met een kleiner pad, die in specifieke adapters passen.

Naast de keuze van de juiste cuvettes, moeten ook de eigenschappen van de optische instrumenten waarmee de metingen worden verricht, in acht worden genomen. Het instrument moet in staat zijn om de juiste golflengten nauwkeurig te isoleren, en de detector moet gevoelig genoeg zijn om zwakke fluorescerende signalen te detecteren zonder dat deze door omgevingslicht of interne reflecties worden verstoord.

Wat is de rol van fasors en kwantumopbrengst in fluorescence-microscopie?

De phasorbenadering, die oorspronkelijk werd geïntroduceerd om de analyse van fluorescentie-leeftijdsbeelden (FLIM) te vereenvoudigen, heeft zich verder uitgebreid naar andere spectrale gegevens en heeft zich bewezen als een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van biologische processen. De toepasbaarheid van fasorplots is breed en omvat uiteenlopende toepassingen zoals de studie van moleculaire dynamica in levende cellen, super-resolutie-imaging en zelfs de kwantificering van verschillende componenten in fluïdische systemen. Dit hoofdstuk richt zich op de basisprincipes van fasors, hun werking en hun integratie in FLIM-technieken, naast de concepten van kwantumopbrengst en quenching die essentieel zijn voor het begrijpen van fluorescerende processen.

In de context van super-resolutie-imaging zijn fasors een cruciale component van technieken zoals SPLIT, die worden besproken in hoofdstuk 10. De snelheid en eenvoud van fasor-analyse in vergelijking met traditionele fittingmethoden maken het een uitstekende keuze voor toepassingen waarbij snelheid en precisie cruciaal zijn, zoals in medische en biologische imaging.

Als we de kwantumopbrengst uitdrukken als een ratio van de emissiesnelheid gedeeld door de som van alle andere deactivatieprocessen van de opgewonden toestand, krijgen we een meer gedetailleerde uitleg van de efficiëntie van de emissie. Dit is een belangrijk concept omdat de kwantumopbrengst niet alleen aangeeft hoe goed een molecuul in staat is om licht uit te zenden, maar ook welke andere processen, zoals niet-stralende ontspanning of quenching, invloed hebben op de fotonemissie.

Quenching zelf is een proces waarbij de fluorescentie-emissie van een molecuul wordt verminderd door een interactie met een ander molecuul of een externe factor. Dit kan gebeuren door energieoverdracht naar een ander molecuul, of door vibraties die de energietoestand van het fluorofore molecuul verlagen. De effecten van quenching zijn belangrijk bij het interpreteren van FLIM-gegevens, omdat ze de kwantumopbrengst kunnen verminderen en de nauwkeurigheid van metingen kunnen beïnvloeden. Dit fenomeen wordt vaak gebruikt in studies die gericht zijn op de dynamica van moleculaire interacties, bijvoorbeeld in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-experimenten, waar quenching een essentiële rol speelt bij het detecteren van interacties tussen moleculen op korte afstanden.

Daarnaast moeten we ook het belang van de spectrale resolutie begrijpen. De precisie waarmee fluorescentie-levensduren kunnen worden gemeten, is afhankelijk van de spectrale scheiding van de verschillende emissies die mogelijk samenkomen in één pixel of beeld. Dit maakt het essentieel om de meetmethode zo in te stellen dat overlap van verschillende emissiepieken wordt geminimaliseerd, wat kan worden bereikt door het gebruik van polar plots en fasoranalyses die de spectrale interferentie verhelpen.

Samenvattend, het begrijpen van fasors, kwantumopbrengst en quenching biedt onderzoekers een krachtig gereedschap om fluïdische systemen, moleculaire interacties en dynamica op een gedetailleerder niveau te bestuderen. Dit opent de deur naar geavanceerdere toepassingen in zowel basisonderzoek als medische diagnostiek, waar tijdsresolutie en nauwkeurigheid essentieel zijn voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten. Het is cruciaal om de relaties tussen de verschillende spectroscopische parameters te begrijpen en hoe ze elkaar beïnvloeden in de context van complexe biologische systemen.