Nel contesto della rilevazione di biomarcatori per malattie infettive, come HIV e HCV, la concentrazione di RNA nelle soluzioni può variare da 50 a 106 molecole/ml per l'HIV e fino a 108 molecole/ml per l'HCV. In tali circostanze, è preferibile aumentare il limite massimo di quantificazione piuttosto che diluire il campione sconosciuto, per evitare artefatti derivanti dalla diluizione. Questo approccio è supportato dalla letteratura, che suggerisce che, in alcuni casi, la diluizione dei campioni possa compromettere la precisione e la sensibilità delle misurazioni.

L'uso delle nanoparticelle d'oro (AuNP) è emerso come una tecnica efficace per amplificare il segnale e migliorare la rilevazione del DNA target, ottimizzando così il limite superiore di quantificazione. In particolare, la dimensione e la concentrazione delle AuNP giocano un ruolo cruciale nella determinazione della sensibilità della rilevazione. In esperimenti precedenti, è stato osservato che modificando la dimensione delle AuNP e il numero di molecole di DNA sondaggio legate alla superficie delle particelle, si poteva non solo ridurre gli errori nella determinazione della concentrazione del DNA target, ma anche estendere il range dinamico della rilevazione.

Inoltre, la creazione di dimeri di AuNP, ossia aggregati di due particelle collegate da catene alchiliche, ha suscitato notevole interesse. Tali dimeri non solo amplificano significativamente il segnale di plasmoni di superficie localizzati (LSPR), ma permettono anche una maggiore tunabilità ottica e anisotropia, a seconda della configurazione delle particelle. Il miglioramento del campo elettromagnetico nella regione di gap interparticellare (hot spot) è di grande interesse per le applicazioni in spettroscopia Raman a superficie migliorata (SERS), poiché consente la rilevazione multiplex a livello di singola molecola di biomarcatori per malattie, senza l'uso di etichette.

Il fattore di miglioramento Raman, che è strettamente legato alla dimensione del gap tra le particelle e alle dimensioni stesse delle AuNP, ha un impatto diretto sulla qualità e sull'affidabilità dei risultati. Un'alternativa semplice ed efficace alla formazione di dimeri è stata sviluppata con l'uso di AuNP modificate con alkanetioli terminati in gruppo carbossilico, sfruttando le interazioni van der Waals tra le catene alchiliche. Cambiando la lunghezza delle catene alchiliche, è stato possibile regolare il gap tra le particelle, ottimizzando la formazione di dimeri ed evitando la formazione indesiderata di aggregati.

Per la realizzazione pratica di queste modifiche, è stato sviluppato un protocollo che prevede la sintesi di coniugati ssDNA-Alkanethiol-AuNP. In un esempio di protocollo, è stata utilizzata una sospensione colloidale di AuNP con diametro di 40 nm, la quale è stata modificata per legare il DNA e formare dimeri mediante ibridazione. I processi di immagazzinamento, ibridazione e centrifugazione sono stati ottimizzati per massimizzare la formazione dei dimeri, eliminando i reagenti non legati.

Il controllo delle dimensioni delle AuNP e la dispersione delle sospensioni di nanoparticelle sono fondamentali per ottenere una buona uniformità nei dimeri formati. È stato dimostrato che la distribuzione delle dimensioni delle AuNP può essere misurata con tecniche come la spettroscopia UV-visibile e la diffrazione di luce dinamica (DLS), mentre la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) fornisce informazioni cruciali sulla conformazione e sul gap interparticellare nei dimeri.

Infine, l'utilizzo delle AuNP per la rilevazione del DNA tramite spettroscopia Raman offre il vantaggio di poter analizzare campioni complessi senza la necessità di marcatori fluorescenti, aumentando così l'efficienza e riducendo i costi associati. La possibilità di eseguire simulazioni elettromagnetiche in 3D con software come Lumerical FDTD ha permesso di ottimizzare ulteriormente i parametri di progettazione, come la dimensione del gap interparticellare, per massimizzare l'assorbimento e la diffusione della luce, garantendo così una miglior qualità dei dati sperimentali.

In sintesi, l'impiego di AuNPs, in particolare nella forma di dimeri, si sta rivelando una tecnologia promettente per la quantificazione rapida e sensibile del DNA. Le tecniche di ottimizzazione dei parametri come la concentrazione di AuNP, la dimensione delle particelle, e la lunghezza delle catene alchiliche sono fondamentali per il miglioramento dei limiti di quantificazione e la riduzione degli errori sperimentali. In questo contesto, il miglioramento delle tecniche di fabbricazione e caratterizzazione delle AuNP continuerà a svolgere un ruolo centrale nella medicina diagnostica avanzata.

Come ottimizzare la formazione di dimere di AuNP per migliorare la sensibilità nelle analisi del DNA

La distribuzione delle dimensioni del dimeri di AuNP è cruciale per comprendere il comportamento ottico e la diffusione di particelle in sospensione. Il segnale legato alla diffusione traslazionale del dimerio si trova attorno ai 64 nm, che corrispondono al diametro di una particella "sferica" equivalente al "dumbbell" dimer rispetto al movimento diffusive. Le distribuzioni delle dimensioni per R5 a R15 sono molto simili, dimostrando l'uniformità del dimerio. Un segnale rilevante intorno ai 9 nm proviene dalla diffusione rotazionale del dimerio. Poiché il dimerio presenta un'anisotropia ottica distinta tra le modalità longitudinale e trasversale, il movimento rotazionale causa fluttuazioni significative nella luce dispersa e nel picco di correlazione a un ritardo corrispondente al tempo di diffusione rotazionale. L'anisotropia ottica e l'intensità del segnale risultante aumentano con la riduzione della distanza interparticellare (lunghezza della catena alchilica), che è coerente con il risultato di uno spostamento verso il rosso più grande della modalità longitudinale con la riduzione della distanza tra le particelle.

Abbiamo anche condotto esperimenti di formazione di multimero utilizzando AuNP di altri diametri, tra cui 20, 30, 50, 60 e 80 nm, modificati con R5, R7, R10 e R15. La concentrazione di NaCl nel tampone modificato e nel tampone di legame è stata ottimizzata, in base alle dimensioni degli AuNP, per massimizzare l'efficienza della formazione dei dimere, evitando l'aggregazione indesiderata di AuNP. I risultati della separazione elettroforetica e della misura dello spettro di estinzione per i dimere mostrano una separazione distinta delle bande elettroforetiche, un cambiamento sistematico nella risposta colorimetrica e uno spostamento del picco del dimerio con la variazione della lunghezza della catena alchilica.

È importante notare che il grado di spostamento verso il rosso della modalità longitudinale diventa meno significativo con la riduzione delle dimensioni di AuNP. Questo è dovuto al fatto che l'entità dello spostamento verso il rosso è sensibile alla distanza relativa tra gli AuNP (il rapporto tra la distanza interparticellare e il diametro di AuNP) così come alla sua distanza assoluta. Per confermare questo fatto, sono stati eseguiti simulazioni FDTD sugli spettri di assorbimento dei dimere di AuNP di 20–80 nm in acqua con spazi interparticellari di 1.0, 1.4, 2.0 e 3.0 nm.

Sono stati discussi due possibili meccanismi di formazione dei multimero attraverso l'interazione tra COOH-alkanetioli. Il primo si basa sul legame idrogeno tra i terminali COOH, che consente agli alkanetioli COOH di formare un bilayer. Il secondo meccanismo è l'interazione di van der Waals tra le catene alchiliche, che penetrano l'una nell'altra. Se è presente un legame idrogeno e si forma un bilayer, la distanza interparticellare deve essere quasi uguale al doppio della lunghezza di un COOH-alkanetiolo, che deve essere maggiore di 2.0, 2.8, 4.0 e 6.0 nm per R5, R7, R10 e R15, rispettivamente. Tuttavia, la distanza interparticellare stimata tramite TEM è vicina alla lunghezza di un singolo COOH-alkanetiolo, il che suggerisce che l'interazione di van der Waals tra le catene alchiliche sia più probabile.

Per approfondire il meccanismo di legame, sono stati eseguiti spettroscopie di scattering Raman micro di dimere di AuNP di 40 nm modificati con R5 a R15 in sospensione. La selettiva intensificazione del segnale Raman, che origina dagli alkanetioli COOH-interagenti per formare il dimerio, è stata osservata. La distanza interparticellare più corta (R5) ha prodotto il segnale Raman più forte, mentre l'intensità del segnale è diminuita drasticamente con l'aumento della distanza tra le particelle, evidenziando che il segnale Raman dalla regione dello spazio interparticellare è enfatizzato.

In termini di applicazioni, questa metodologia potrebbe rivelarsi fondamentale per misurazioni a livello molecolare singolo. La distanza interparticellare dei dimere non è completamente occupata da molecole di alkanetiolo, consentendo che molecole di analiti possano essere intrappolate tra le particelle, fungendo da "gabbia" che consente misurazioni di SERS a livello di singola molecola.

In questo contesto, l'ottimizzazione della modificazione della superficie degli AuNP è stata fondamentale per ottenere una buona dispersività e una elevata efficienza di ibridazione. Le modifiche alla superficie degli AuNP, utilizzando vari alkanetioli, hanno aumentato la densità di carica superficiale e le relative interazioni repulsive. Tali modifiche hanno reso la superficie idrofobica, favorendo l'estensione degli ssDNA e aumentando così l'efficienza di ibridazione. L'introduzione dell'oligoetilene glicolico nell'alkanetiolo ha prevenuto il legame non specifico causato dall'intreccio delle catene alchiliche. Le condizioni ottimali sono state ottenute regolando la densità di carica superficiale tramite l'introduzione di un gruppo terminale COOH, bloccando completamente il legame non specifico e permettendo un'alta efficienza di ibridazione. Utilizzando questo approccio, è stato possibile ottenere una soglia di rilevamento di 1 pM di DNA target con separazione semplice mediante gel di elettroforesi. Questo elevato livello di sensibilità è dovuto all'uniformità delle dimensioni degli AuNP e al controllo della densità di carica superficiale tramite la modifica con alkanetioli.

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