Comment mesurer les protéines : Méthodes et applications spectroscopiques

Les méthodes de quantification des protéines sont essentielles dans de nombreux domaines de la biologie moléculaire et de la biochimie. L’une des approches les plus courantes repose sur des mesures de l'absorbance directe des protéines dans la gamme des UV–Vis. Cette technique repose sur le fait que de nombreuses protéines absorbent la lumière dans la région visible et proche UV. L’absorption est principalement attribuée aux liaisons peptidiques des protéines, responsables de la transition p→p*, qui engendre des bandes d’absorption caractéristiques, généralement autour de 190 nm et 215 nm. Cependant, cette absorbance varie selon les protéines et les groupes prosthétiques présents, ce qui influence la précision des mesures.

Le calcul de la concentration protéique par spectrophotométrie nécessite parfois des ajustements en fonction des composés spécifiques présents dans l'échantillon. Par exemple, la méthode la plus couramment utilisée pour mesurer les protéines par absorbance directe est l'approche Warburg-Christian, qui repose sur la mesure de l'absorbance à 280 nm. À cette longueur d'onde, la tryptophane et la tyrosine absorbent la lumière, et leur quantité dans l'échantillon peut être utilisée pour déterminer la concentration en protéines. Cependant, cette méthode peut être perturbée par la présence d’acides nucléiques qui absorbent à 260 nm, d’où la nécessité d'appliquer un facteur de correction pour tenir compte de cette interférence.

Quels sont les principes et les applications des systèmes massiques multi-analyseurs et des techniques chromatographiques en métabolomique ?

Les systèmes à analyseurs multiples ont été développés afin de dépasser la simple identification de la masse moléculaire, en permettant la détermination détaillée de la structure moléculaire. Ces dispositifs comprennent des combinaisons d’analyseurs identiques ou hybrides, réunissant différents types d’analyseurs de masse. Parmi eux, le triple quadripôle (QQQ) couplé à des pièges ioniques linéaires est un instrument très sélectif utilisé pour la quantification sensible d’un ou de quelques analytes spécifiques au sein d’un mélange complexe. Dans une expérience dite de suivi multiple de réactions (MRM), les ions analytes sont d’abord sélectionnés par le premier quadripôle, puis transférés dans un second quadripôle servant de cellule de collision où ils sont fragmentés grâce à un gaz collisionnel. Les fragments sélectionnés traversent ensuite le troisième quadripôle jusqu’au détecteur. L’analyse des fragments ioniques générés permet ainsi d’élucider la structure des molécules étudiées.

Les spectromètres à temps de vol avec quadripôle (Q-ToF) combinent la filtration de masse par quadripôle avec l’analyse à haute résolution basée sur le temps de vol des ions. Ces instruments sont particulièrement adaptés aux analyses non ciblées ou à la quantification de nombreux analytes simultanément, bien que leur sensibilité soit généralement moindre que celle des QQQ. Des améliorations sont possibles en piégeant les ions dans le second quadripôle avant leur libération en paquets dans le tube ToF, augmentant ainsi la sensibilité.

L’hyphenation des spectromètres de masse avec des techniques chromatographiques constitue une étape essentielle pour séparer les métabolites avant leur analyse massique. La chromatographie en phase gazeuse (GC), la première technique hyphenée développée, est utilisée depuis les années 1970 pour l’identification et la quantification de métabolites de faible masse. Les colonnes capillaires, apparues dans les années 1980, permettent une meilleure séparation dans un four thermostatique qui module la température pour contrôler la volatilité des composés. La GC-MS est adaptée aux petites molécules volatiles ; les composés polaires doivent souvent être dérivatisés pour augmenter leur volatilité, par exemple par silylation. Malgré des temps d’analyse historiquement longs, l’amélioration des colonnes a permis de réduire ces durées de plusieurs dizaines de minutes à quelques minutes.

La chromatographie capillaire électrophorétique (CE), moins courante, exploite le déplacement différentiel des ions polaires sous l’effet d’un champ électrique appliqué dans une colonne remplie d’un gel. Cette technique est également compatible avec les analyseurs de masse mentionnés, souvent via une interface ESI.