Микрофильтрация, в основном, является гидродинамическим процессом, близким к обычной фильтрации. Специфическая особен­ность микрофильтрации - использование мембран с диаметром пор от 0,1 до 10 мкм для отделения мелких частиц твердой фазы, в том числе микроорганизмов, в этом случае ее называют стерилизующей фильт­рацией. Поэтому в отличие от процесса фильтрации при микрофильт­рации явления диффузии (особенно при небольших размерах пор от 0,1 до 0,5 мкм) также играют определенную роль.

В основе ультрафильтрации лежит использование мембран с диа­метром пор от 0,001 до 0,1 мкм. Ультрафильтрация применяется для разделения клеток и молекул.

Мембранные методы разделения, применительно к биологическим суспензиям, обладают рядом преимуществ.

1. Концентрирование и очистка осуществляются без изменения аг­регатного состояния и фазовых превращений.

2. Перерабатываемый продукт не подвергается тепловым и хими­ческим воздействиям.

3. Механическое и аэродинамическое воздействие на биологиче­ский материал незначительно.

4. Легко обеспечиваются герметичность и асептические условия.

5. Аппаратурное оформление компактно по конструкции, отсутст­вуют движущиеся детали.

6. Процесс не обладает высокой энергоемкостью, в большинстве случаев энергия затрачивается только на перекачивание растворов.

Механизм переноса атомов, молекул или ионов различных веществ через полупроницаемые мембраны может быть объяснен одной из сле­дующих теорий.

Теория просеивания предполагает, что в полупроницаемой мем­бране существуют поры, размеры которых достаточны для того, чтобы пропускать растворитель, но слишком малы для того, чтобы пропус­кать молекулы или ионы растворенных веществ.

Теория молекулярной диффузии основана на неодинаковой рас­творимости и на различии коэффициента диффузии разделяемых ком­понентов в полимерных мембранах. Теория капиллярно-фильтрационной проницаемости основана на различии физико-химических свойств граничного слоя жидкости на поверхности мембраны и раствора в объеме.

Из предложенных теорий, получила распространение капиллярно-фильтрационная модель.

Основным рабочим органом мембранных аппаратов являются по­лупроницаемые мембраны. Мембраны должны обладать высокой раз­делительной способностью или селективностью, высокой удельной производительностью или проницаемостью, постоянством своих ха­рактеристик в процессе эксплуатации, химической стойкостью в раз­деляющей среде, механической прочностью, невысокой стоимостью. Селективность и проницаемость - это наиболее важные технологиче­ские характеристики мембран и аппарата в целом.

Селективность мембраны зависит от размера и формы молекул растворенного вещества. Следует иметь в виду, что практически во всех случаях существуют молекулы, задерживаемые мембраной лишь частично. Мембраны изготавливают из различных материалов: поли­мерных пленок, стекла, керамики, металлической фольги и т. п. Широ­кое распространение получили мембраны из полимерных пленок.

Полупроницаемые мембраны бывают пористые и непористые. Че­рез непористые мембраны процесс осуществляется за счет молекуляр­ной диффузии. Такие мембраны называются диффузионными и при­меняются для разделения компонентов с близкими свойствами. Порис­тые мембраны изготавливаются в основном из полимерных материалов и могут быть анизотропными и изотропными.

Пористые мембраны получают обычно путем удаления растворите­лей или вымыванием предварительно введенных добавок из растворов полимеров при их формировании. Полученные таким образом мембра­ны имеют тонкий 0,25-0,5 мкм поверхностный слой на микропористой подложке толщиной 100-250 мкм. Процесс мембранного разделения осуществляется в поверхностном активном слое, а подложка обеспечи­вает механическую прочность мембраны.

Широкое распространение получили ядерные мембраны, или нуклеопоры. Эти мембраны образуются облучением тонких полимерных пленок, заряженными альфа-частицами с последующим травлением пор химическими реагентами.

К основным достоинствам ядерных мембран относятся:

- правильная круглая форма пор;

- возможность получить мембраны с заранее заданными разме­рами и числом пор;

- одинаковый размер пор;

- химическая стойкость.

Ядерные мембраны изготавливают на основе покарбонатных пле­нок с диаметром пор от 0,1 до 8 мкм.

Наряду с полимерными известны мембраны с жесткой структурой:

металлические, из пористого стекла, керамики.

Металлические мембраны изготавливают выщелачиванием или возгонкой одного из компонентов сплава фольги. При этом получают высокопористые мембраны с порами одинакового размера - в пределах 5- 0,1 мкм.

Другой способ получения металлических мембран - спекание ме­таллического порошка при высоких температурах методом порошко­вой металлургии.

Недостатки мембранных методов разделения:

1. Некоторые материалы, из которых изготавливаются мембраны, быстро изнашиваются.

2. Возникают определенные трудности при обработке растворов, содержащих твердую фазу.

Тем не менее, следует отметить перспективность применения мем­бранных методов разделения в технологии микробиологического син­теза.

ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ СЕЛЕКТИВНОГО РАЗДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ РАСТВОРОВ И СУСПЕНЗИЙ НА ПОРИСТЫХ МЕМБРАНАХ

К основным мембранным методам разделения жидких систем отно­сятся обратный осмос, ультра - и микрофильтрация. Эти методы харак­теризуются такими общими чертами, как использование полупрони­цаемых, т. е. по-разному пропускающих разные компоненты растворов и суспензий, мембран, применение в качестве движущей силы процес­са избыточного давления, способы борьбы с концентрационной поля­ризацией.

Деление указанных методов является в значительной степени ус­ловным и базируется, как правило, на размерах фильтруемых объектов и размерах пор соответствующих полупроницаемых мембран.

Более отчетливо следует разграничить методы ультра - и микро­фильтрации по фазовым состояниям разделяемых систем (соответст­венно, растворы и суспензии), а методов ультрафильтрации и обратно­го осмоса по механизму проницаемости (вязкое течение и активиро­ванная диффузия).

Можно приблизительно определить, что обратноосмотические мембраны могут задерживать частицы размером более 1-10-4 мкм, т. е. гидратированные неорганические ионы, а ультрафильтрация наиболее эффективна для частиц размером более 1-10-3 мкм, т. е. ультрафильтра-ционные мембраны могут задерживать органические молекулы и ионы. Соответственно, микрофильтрация позволяет эффективно задерживать частицы от 5-10-2 до 10 мкм, те которые не осаждаются из растворов в поле гравитационных сил.

Тем не менее, четко определить границы применения различных мембранных методов не представляется возможным как из-за общно­сти физических явлений, лежащих в основе данных методов, так и ввиду широкого спектра свойств и природы разделяемых баромембранными процессами веществ.

ФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МИКРОФИЛЬТРАЦИИ

Разделение растворов и суспензий методом микрофильтрации ос­новано на различии и эффективных гидродинамических размерах раз­деляемых молекул и частиц. Процесс разделения описывается в рамках различных теорий и механизмов полупроницаемости, учитывающих влияние физико-химических, гидродинамических и межмолекулярных факторов на прохождение частиц через мембраны.

Как правило, анализ и расчет процессов ультра - и микрофильтра­ции проводится с единых позиций. Такой подход правомерен, если учесть, что протекание этих процессов обычно сопровождается обра­зованием слоя осадка на мембране, оказывающего основное сопротив­ление массопереносу. Образование этого осадка и его свойства могут быть описаны едиными зависимостями.

Поверхностные явления на границе мембрана-раствор, свойства раствора и растворенного вещества (для микрофильтрации - свойства диспергированных частиц) оказывают существенное влияние на про­цесс ультра - и микрофильтрации.

Объект применения микрофильтрации - как правило, коллоидные (дисперсные) системы, имеющие дисперсную среду («растворитель») и дисперсную фазу (частицы, взвешенные в растворителе). В разделе­нии этих фаз часто и состоит задача проведения микрофильтрации жидкостей.

Важнейшую роль во всех процессах разделения мембранных игра­ют адгезионные и электростатические взаимодействия частиц с по­верхностью мембраны.

Биологические клеточные объекты представляют собой типичные лиофильные системы. Для них, в отличие от лиофобных систем, харак­терно сильное межмолекулярное взаимодействие вещества дисперсной фазы с дисперсной средой. Такое взаимодействие приводит к образо­ванию сольватных гидратных (в случае, если дисперсионной средой является вода) оболочек из молекул дисперсионной среды вокруг час­тиц дисперсной фазы. Кроме этого, клетки микроорганизмов обладают зарядом (электрокинетический потенциал — ЭКП), величина которого различна у разных микроорганизмов. Для одного и того же вида мик­роорганизмов величина заряда меняется в зависимости от условий сре­ды и процессов, происходящих в самой клетке. Наличие у клеток за­ряда позволяет рассматривать биологические суспензии как растворы электролитов.

КОНЦЕНТРАЦИОННАЯ ПОЛЯРИЗАЦИЯ

При разделении растворов и суспензий с помощью полупроницае­мых мембран, через мембрану преимущественно проходит раствори­тель. При этом концентрация растворенного вещества в пограничном слое у поверхности мембраны увеличивается. Повышение концентра­ции происходит до тех пор, пока под действием возникающего гради­ента концентраций растворенного вещества между поверхностью мем­браны и объемом раствора не установится динамическое равновесие.

Явление образования у поверхности мембраны пограничного слоя, в котором концентрация растворенного вещества больше, чем в основ­ном объеме раствора, получило название концентрационной поляриза­ции. Влияние концентрационной поляризации на фильтрацию всегда отрицательно по следующим причинам:

- Снижается эффективное давление вследствие увеличения осмоти­ческого давления раствора, определяемого концентрацией именно в пограничном слое. Это приводит к снижению, как скорости процесса, так и селективности, сокращается срок службы мембран, который в значительной степени зависит от концентрации растворенного вещества.

- Концентрационная поляризация связана с образованием погранич­ного слоя, отделяющего поверхность мембраны от раствора в объеме. Толщина этого слоя в общем случае определяется гидродинамически­ми условиями в установке - интенсивностью перемешивания и скоро­стью движения потока. Профиль концентрации этого слоя зависит от режима движения раствора.

Различают два режима концентрационной поляризации:

- предгелевый, когда концентрация у поверхности мембраны Cw ниже концентрации гелеобразования Cg;

- режим гелевой поляризации, когда Cw==Cg, и на мембране образу­ется слой геля.

Образование геля на поверхности мембраны приводит к резкому падению проницаемости и росту задерживающей способности микрофильтрационных мембран. Однако существует предположение, что снижение проницаемости при концентрационной поляризации мем­браны достигается не полной блокировкой ее пор слоем геля, а их мо­дификацией гелем таким образом, что эффективные размеры всех пор уменьшаются на некоторую постоянную величину R. Образу­ется так называемая динамическая гелевая мембрана. При этом в уменьшенных порах мембраны реализуется классический капиллярно-фильтрационный механизм разделения.

Считается также, что для возникновения концентрационной поля­ризации размеры фильтруемых частиц должны обеспечивать «крити­ческое» отношение размеров частицы и поры, характеризующее пере­ход из предгелевого в гелевый режим концентрационной поляризации вследствие увеличения коэффициента задержания.

Для уменьшения вредного влияния концентрационной поляризации на процесс микрофильтрации используют различные способы: повы­шают температуру (вследствие чего снижается вязкость и увеличива­ется концентрация гелеобразования), применяют электрическое поле, употребляют высокие скорости тангенциального потока и пульсационные режимы фильтрации.

ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА ХАРАКТЕРИСТИКИ РАЗДЕЛЕНИЯ

Выбор рабочего давления зависит от вида процесса, природы и концентрации разделяемого раствора, типа используемой мембраны, конструкции аппарата, гидравлического сопротивления и т. д. Для микрофильтрации рабочее давление составляет 0,03-0,1 МПа, и для каждого раствора определяется экспериментальным путем.

Увеличение рабочего давления приводит к увеличению скорости фильтрации до некоторых пределов, обусловленных тем, что увеличе­ние давления приводит и к увеличению и уплотнению слоя геля на по­верхности мембраны.

В результате воздействия высокого давления на мембраны могут наблюдаться значительные остаточные деформации: при снятии дав­ления структура мембраны не возвращается в исходное состояние. Усадка структуры мембраны снижает проницательность и повышает селективность.

Анализ данных о влиянии температуры на селективность и прони­цаемость мембран при микрофильтрации показывает, что повышение температуры приводит к увеличению и проницаемости, и селективно­сти. Это объясняется тем, что уменьшается вязкость пермеата, а также значительно снижается влияние концентрационной поляризации мем­бран.

При увеличении концентрации растворенных веществ в разделяе­мом растворе ухудшаются рабочие характеристики мембран - удель­ная производительность и селективность. При концентрировании по­вышается осмотическое давление раствора, а следовательно снижается эффективная движущая сила процесса разделения.

ЛЕКЦИЯ 4. ВАКЦИНЫ.

Вакцинация способствует формированию у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам и тем самым защищает его от инфекции. В ответ на пероральное или парентеральное введение вакцины в организме хозяина вырабатываются антитела к патогенному микроорганизму, которые при последующей инфекции приводят к его инактивации (нейтрализации или гибели), блокируют его пролиферацию и не позволяют развиться заболеванию.

Эффект вакцинации открыл более 200 лет назад — в 1796 г. — врач Эдвард Дженнер. Он доказал экспериментально, что человек, перенесший коровью оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится невосприимчивым к оспе натуральной. Натуральная оспа - высококонтагиозное заболевание с высокой смертностью: даже если больной не погибает, у него нередко возникают различные уродства, психические расстройства и слепота. Дженнер публично провел прививку коровьей оспы 8-летнему мальчику Джеймсу Фиппсу, использовав для этого экссудат из пустулы больной коровьей оспой, а затем через определенное время дважды инфицировал ребенка гноем из пустулы больного натуральной оспой. Все проявления заболевания ограничились покраснением в месте прививки, исчезнувшим через несколько дней.

Ранее такие инфекционные болезни, как туберкулез, оспа, холера, брюшной тиф, бубонная чума и полиомиелит, были настоящим бичом для человечества. С появлением вакцин, антибиотиков и внедрением мер профилактики эти эпиидемические болезни удалось взять под контроль. Однако защитные меры со временем становились неэффективными, и возникали новые вспышки заболеваний. В 1991 г. эпидемия холеры поразила Перу; в течение трех следующих лет было выявлено примерно 1 млн. заболевших, несколько тысяч из них умерли. К сожалению, против многих болезней человека и животных вакцин не существует. Сегодня во всем мире более 2 млрд. людей страдают заболеваниями, которые можно было бы предотвратить с помощью вакцинации. Вакцины могут оказаться полезными и для профилактики постоянно появляющихся «новых» болезней (например, СПИДа).

Как правило, современные вакцины создают на основе убитых (инактивированных) патогенных микроорганизмов либо живых, но невирулентных (аттенуированных) штаммов. Для этого штамм дикого типа выращивают в культуре, очищают, а затем инактивируют или модифицируют таким образом, чтобы он вызывал иммунный ответ, достаточно эффективный в отношении вирулентного штамма. Несмотря на значительные успехи в создании вакцин против таких заболеваний, как краснуха, дифтерия, коклюш, столбняк, оспа и полиомиелит, производство современных вакцин сталкивается с целым рядом ограничений:

• Не все патогенные микроорганизмы удается культивировать, поэтому для многих заболеваний вакцины не созданы.

• Для получения вирусов животных и человека необходима дорогостоящая культура животных клеток.

• Титр вирусов животных и человека в культуре и скорость их размножения часто бывают очень низкими, что удорожает производство вакцин.

• Необходимо строго соблюдать меры предосторожности, чтобы не допустить инфицирования персонала.

• При нарушении производственного процесса в некоторые партии вакцины могут попасть живые или недостаточно ослабленные вирулентные микроорганизмы, что может привести к неумышленному распространению инфекции.

• Аттенуированные штаммы могут ревертировать к исходному штамму, поэтому необходимо постоянно контролировать вирулентность.

• Некоторые заболевания (например, СПИД) нельзя предупреждать с помощью традиционных вакцин.

• Большинство современных вакцин имеют ограниченный срок годности и сохраняют активность только при пониженной температуре, что затрудняет их использование в развивающихся странах.

В последнее десятилетие, с развитием технологии рекомбинантных ДНК, появилась возможность создать новое поколение вакцин, не обладающих недостатками традиционных вакцин. Для их разработки применяют методы генной инженерии.

• Патогенный микроорганизм модифицируют, делетируя гены, ответственные за вирулентность. Способность вызывать иммунный ответ при этом сохраняется. Такой микроорганизм можно безбоязненно использовать в качестве живой вакцины, поскольку выращивание в чистой культуре исключает возможность спонтанного восстановления целого гена.

• Создают живые непатогенные системы переноса отдельных антигенных детерминант неродственного патогенного организма. Такая система переноса способствует развитию выраженного иммунного ответа на патогенный микроорганизм.

• Если патогенные микроорганизмы не растут в культуре, можно изолировать, клонировать и экспрессировать в альтернативном хозяине (например, в Е. coli или линии клеток млекопитающих) гены тех белков, которые содержат основные антигенные детерминанты, и использовать эти белки как «субъединичные» вакцины (см. следующий раздел).

• Некоторые патогенные микроорганизмы действуют опосредованно, вызывая развитие аутоиммунной реакции на инфицированные клетки организма-хозяина. Для таких заболеваний можно создать систему специфического уничтожения клеток-мишеней, сконструировав ген, кодирующий химерный белок, одна часть которого будет связываться с инфицированной клеткой, а другая - уничтожать ее. Эта система не является истинной вакциной, хотя она и действует только на инфицированные клетки, устраняя саму причину развития аутоиммунной реакции.

К вакцинам для животных предъявляются менее жесткие требования, поэтому первыми вакцинами, полученными с помощью технологии рекомбинантных ДНК, были вакцины против ящура, бешенства, дизентерии и диареи поросят. Создаются и другие вакцины для животных, а в скором времени появятся и рекомбинантные вакцины, предназначенные для человека.

Субъединичные вакцины

Как правило, вакцины содержат неповрежденные патогенные микроорганизмы, но при этом неживые или аттенуированные. Антитела, вырабатываемые в ответ на их введение, связываются с поверхностными белками патогенного организма и запускают иммунный ответ. В связи с этим возникает вопрос: должна ли вакцина содержать целые клетки или лишь какие-то специфические поверхностные компоненты? Что касается вирусов, то, как было показано, для выработки в организме-хозяине антител в ответ на вирусную инфекцию достаточно очищенных поверхностных белков вируса (белков капсида или внешней оболочки). Вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют «субъединичными»; для их разработки с успехом используется технология рекомбинантных ДНК.

Субъединичные вакцины имеют свои достоинства и недостатки. Достоинства состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызывать нежелательные побочные эффекты в организме-хозяине. Недостатки заключаются в том, что очистка специфического белка стоит дорого, а конформация выделенного белка может отличаться от той, которую он имеет in situ (т. е. в составе вирусного капсида или оболочки), что может приводить к изменению его антигенных свойств. Решение о производстве субъединичной вакцины принимается с учетом всех имеющих отношение к делу биологических и экономических факторов.

Противогерпетические вакцины

Вирус простого герпеса (HSV, herpes simplex virus) вызывает инфекционные заболевания генерализованного или местного характера (тяжелые поражения глаз, энцефалит, урогенитальные инфекции и т. д.). Кроме того, он является онкогенным, поэтому вакцинация убитым или аттенуированным вирусом сопряжена с определенным риском развития рака. Для защиты от HSV-инфекции можно использовать неонкогенную субъединичную вакцину.

Для создания любой субъединичной вакцины прежде всего нужно идентифицировать те компоненты патогенного микроорганизма, которые индуцируют выработку антител. В случае HSV типа I (HSV-1) таким компонентом является гликопротеин D оболочки (gD). В ответ на введение этого гликопротеина мышам у них вырабатываются антитела, нейтрализующие интактный HSV. Ген gD HSV-1 был изолирован, клонирован в одном из экспрессируюших векторов в клетках млекопитающих и введен в яйцеклетки китайского хомячка (СНО), в которых в отличие от Е. coli происходит гликолизирование чужеродных белков. Полноразмерный ген gD кодирует белок, в норме связывающийся с мембраной клетки млекопитающего. Такой белок труднее очистить, чем растворимый, поэтому ген gD модифицировали, удалив ту его часть, которая кодирует С-концевой трансмембранный домен. Затем модифицированным геном трансформировали СНО-клетки, которые гликозилировали белковый продукт и секретировали его во внешнюю среду, поскольку он не мог встраиваться в клеточную мембрану. Лабораторные испытания показали, что антитела, вырабатываемые в ответ на введение модифицированного белка gD, эффективны в отношении как HSV-1, так и HSV-2.

Противоящурные вакцины

Вирус ящура (FMDV, foot-and-mouth disease virus) в высшей степени вирулентен и вызывает массовую гибель крупного рогатого скота и свиней. Для защиты от FMDV-инфекции используют вакцину, содержащую вирус, инактивированный формалином. В мире ежегодно производится примерно 1 млрд. доз этой вакцины.

Основной антигенной детерминантой, индуцирующей образование антител, является вирусный капсидный белок 1 (VP1, viral protein 1). Это более слабый антиген, чем интактные вирусные частицы, но все же он индуцирует образование антител и обеспечивает защиту животных от инфекции. Поэтому были предприняты попытки клонировать VPl-ген.

Геном FMDV представляет собой одноцепочечную РНК. Поэтому сначала синтезировали полноразмерную двухцепочечную кДНК длиной примерно 8000 п. н. Затем ее расщепили с помощью рестрицируюших эндонуклеаз и клонировали полученные фрагменты в экспрессирующем E. coli-векторе. Продукт кодирующей последовательности VPl-гена идентифицировали иммунологическими методами как часть слитого (химерного) белка, синтез которого контролируется системой pL-промотор—cl-penpeccop. Белок состоит из 396 аминокислотных остатков, содержит часть молекулы репликазы бактериофага MS2 и полноразмерный VP1-белок FMDV, благодаря чему он и индуцирует выработку нейтрализующих FMDV антител.

Получить разрешение на применение вакцины, содержащей химерный белок, очень трудно, поэтому, вероятно, придется субклонировать VP1-последовательность в другом экспрессирующем векторе. Так или иначе, субъединичная вакцина против ящура скоро будет готова для проведения доклинических испытаний.

Противотуберкулезные вакцины

Туберкулез - системное инфекционное заболевание, широко распространенное во всем мире. Его возбудителем является бактерия Mycobacterium tuberculosis. Она инфицирует разные ткани и органы (чаще всего легкие) и приводит к гибели клеток. У пациентов наблюдаются лихорадка, потеря веса, а в отсутствие лечения заболевание заканчивается смертью. По оценкам, этим патогенным микроорганизмом инфицировано около 2 млрд. людей, а туберкулез ежегодно уносит примерно 3 млн. жизней. Последние 50 лет для лечения туберкулеза использовали антибиотики, но уже появилось множество устойчивых к ним штаммов М. tuberculosis, так что заболевание, казавшееся побежденным, вновь стало серьезной проблемой.

В настоящее время в ряде стран в качестве противотуберкулезной вакцины используют один из штаммов Mycobacterium bovis, бациллу Кальмета—Герена (BCG, bacillus Calmette-Guerin). Однако эффективность такого подхода вызывает сомнения по двум причинам: 1) живые BCG-клетки могут вызвать серьезное заболевание у лиц со сниженным иммунным статусом (например, у больных СПИДом); 2) лица, которым ввели BCG-вакцину, дают положительный ответ на обычную процедуру выявления вызывающих туберкулез бактерий, что не позволяет отличить их от больных туберкулезом. В связи с этим в некоторых странах, в том числе и в США, BCG-вакцина к использованию не разрешена. В попытках создания более безопасной и эффективной субъединичной противотуберкулезной вакцины были изучены иммуннопротективные свойства очищенных внеклеточных белков М. tuberculosis. Из жидкой бактериальной культуры выделили и очистили шесть основных из 100 секретируемых белков, и каждый из них по отдельности, а затем различные их комбинации использовали для иммунизации морских свинок. Животным вводили в виде аэрозоля примерно 200 живых клеток М. tuberculosis, что является для них весьма высокой дозой. Через 9-10 нед животных умерщвляли и исследовали их легкие и селезенку на предмет присутствия этой патогенной бактерии. При введении некоторых комбинаций очищенных белков потеря веса, поражение легких и селезенки и уровень смертности были такими же, как и при иммунизации живой BCG-вакциной. Теперь нужно провести сравнение эффективности белков М. tuberculosis, полученных с помощью технологии рекомбинантных ДНК, с эффективностью секреторных белков и разработать безопасную и эффективную вакцину для профилактики туберкулеза у человека.

Пептидные вакцины

Далее возникает следующий вопрос: может ли небольшой участок белковой молекулы (домен) служить эффективной субъединичной вакциной и индуцировать выработку антител? Интуитивно кажется, что те домены, которые доступны для антитела (т. е. те, которые находятся на поверхности вируса), обладают иммуногенными свойствами, а внутренние домены несущественны, если только они не влияют на конформацию иммуногенного домена. Если это предположение верно, то короткие пептиды. имитирующие эпитопы (антигенные детерминанты), можно использовать для создания вакцин.

Имея все это в виду, синтезировали химическими методами домены VP1 FMDV и проверили возможность создания на их основе пептидных вакцин. Каждый из пептидов, соответствующих аминокислотным остаткам 141—160, 151—160 и 200—213 С-концевого участка VP1 и аминокислотным остаткам 9—24, 17—32 и 25—41 N-концевого участка, сшили по отдельности с инертным белком-переносчиком (гемоцианином моллюска фиссурелии), чтобы предотвратить их разрушение, и ввели морским свинкам. Синтез антител в количестве, достаточном для защиты животного от последующих FMDV-инфекций наблюдался только при введении пептида 141-160. Введение же целого VP1 или пептидов 9-24, 17-32 и 25-41 индуцировало синтез антител в меньших количествах.

Более длинный пептид, состоящий из аминокислотных остатков 141—158 и 200—213, которые были соединены двумя пролиновыми остатками, индуцировал эффективный синтез антител у морских свинок даже в том случае, когда он не был сшит с белком-носителем. Эта «двухпептидная» молекула оказалась эффективнее любого изолированного пептида и блокировала пролиферацию FMDV у крупного рогатого скота и морских свинок.

Эти результаты являются весьма многообещающими, однако количество (доза) пептидного материала, необходимого для индукции иммунного ответа, примерно в 1000 раз выше, чем в случае убитой FMDV-вакцины. Чтобы решить эту проблему, фрагмент ДНК, кодирующий пептид из аминокислотных остатков 142-160 VP1 FMDV, сшили с геном, кодирующим коровый белок гепатита В (HBcAg). При экспрессии этого химерного гена в Е. coli или культуре животных клеток его продукты — белковые молекулы - в процессе самосборки образовывали стабильные «27нм-частицы», на поверхности которых находился пептид из VP1 FMDV. Эти частицы обладали высокой иммуногенностью. Таким образом, HBcAg можно использовать в качестве эффективной молекулы-носителя синтетических пептидов. Сравнение иммуногенности различных пептидных FMDV-вакцин, содержащих домен 142-160 VP1-белка, проведенное на морских свинках, показало, что иммуногенность химерного белка, состоящего из HBcAg и указанного домена, в 10 раз ниже, чем у инактивированных FMDV-частиц, в 35 раз выше, чем у химерного белка, содержащего b-галактозидазу Е. coli и домен 137-162 из VP1 FMDV, и в 500 раз выше, чем у свободного синтетического пептида, состоящего из аминокислотных остатков 142-160. Поскольку синтетический пептид, сшитый с HBcAg, образует 27нм-частицы, сходные с вирусом гепатита В, и они обладают почти такой же иммуногенностью, как и интактный вирус, на основе которого получен синтетический пептид, этот подход может стать основным способом доставки пептидных вакцин к месту их действия.

И все же существует несколько ограничений на использование коротких пептидов в качестве вакцин.

• Эпитоп, использующийся для создания эффективной пептидной вакцины, должен представлять собой короткий, но непрерывный участок белковой молекулы, а это бывает не всегда.

• Конформация пептида должна быть такой же, как у эпитопа в интактной вирусной частице.

• Изолированный эпитоп может не обладать достаточной иммуногенностью. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать высокоспецифичной, относительно недорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам, хотя для этого необходимо провести еще немало исследований.

Генная иммунизация

Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животного-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. coli-плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в 103-104 раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для создания вакцины технологии рекомбинантных ДНК. Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероятностью подвергаются правильной посттрансляционной модификации, чем белки, синтезируемые организмами-хозяевами. Этот метод, получивший название генной иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних животных.

Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. В одной из серий экспериментов мышам в квадрицепсы обеих задних конечностей вводили раствор с Е. соli-плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А, транскрипция которой находилась под контролем промотора вируса саркомы Рауса или цитомегаловируса. Хотя уровень экспрессии гена нуклеопротеина был настолько низок, что не поддавался регистрации, через 2 нед после иммунизации в крови мышей обнаруживались антитела к нему. Выживаемость иммунизированных мышей оказалась значительно выше, чем мышей из контрольной группы. Более того, они были нечувствительны и к другому штамму вируса гриппа. Такая перекрестная защита не вырабатывается при введении традиционных противогриппозных вакцин, полученных на основе поверхностных антигенов вируса, и поэтому каждая вакцина специфична лишь к одному штамму вируса. Более того, традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор, пока остаются неизмененными поверхностные антигены. К сожалению, для генов поверхностных антигенов характерна высокая частота мутаций, что приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса. Коровые же белки, такие как нуклепротеин, относительно стабильны и активируют иммунную систему по другому механизму, чем поверхностные антигены.

ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения одного и того же гена.

Судьба введенной в клетку ДНК точно неизвестна. В принципе она может интегрировать в геном хозяина с весьма серьезными последствиями, если при этом затрагивается какой-то важный ген или происходит злокачественная трансформация клетки. Однако такое развитие событий считается крайне маловероятным. Скорее всего такая ДНК какое-то время просуществует в клетке в виде нереплицируюшегося внехромосомного элемента, а затем разрушится. Генную иммунизацию пока используют для выработки иммунитета к некоторым патогенным микроорганизмам (вирусу гриппа А, вирусу иммунодефицита человека типа I, вирусу бычьего герпеса, вирусу бешенства, Plasmodium sp., вызывающему малярию, вирусу гепатита В) у животных, но не у человека.

Для облегчения доставки ДНК в клетки животных при проведении генной иммунизации был создан модифицированный штамм Shigella flexneri. Эта бактерия проникает в эпителиальные клетки животных путем фагоцитоза, и присутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки-хозяина, где и происходят транскрипция и трансляция переносимого ею гена, находящегося под контролем эукариотического промотора. Shigella — это патогенный микроорганизм, и как таковой он не может использоваться для доставки ДНК. Ее непатогенный штамм можно получить, введя делецию в ген asd, кодирующий фермент аспартат-b-полу-альдегид—дегидрогеназу, который участвует в синтезе компонента клеточной стенки диаминопимелиновой кислоты. Штаммы с мутацией в asd-гене растут только в присутствии диаминопимелиновой кислоты и их можно использовать для доставки плазмидной ДНК в эпителиальные клетки животных, поскольку они в них не пролиферируют.

Эксперименты, в которых в качестве вектора для доставки ДНК в клетки использовались Shigella, были проведены на морских свинках, и хотя они оказались успешными, судить о безопасности данной системы можно будет лишь после проведения клинических испытаний. Огромным преимуществом этого подхода является возможность перорального введения вакцин.

Аттенуированные вакцины

В некоторых случаях в качестве живых вакцин можно использовать генетически модифицированные (рекомбинантные) микроорганизмы (бактерии или вирусы). Такие вакцины содержат либо непатогенные микроорганизмы, синтезирующие антигенные детерминанты определенного патогенного агента, либо штаммы патогенных микроорганизмов, у которых модифицированы или делетированы гены вирулентности. В этих случаях основные антигенные детерминанты являются составными компонентами бактерериальных или вирусных частиц и имеют такую же конформацию, какую они принимают в болезнетворном микроорганизме. Изолированным антиген часто утрачивает исходную конформацию и вызывает лишь слабый иммунный ответ.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9