Решение этих проблем позволяет получать более стабильные ре­зультаты по стерильности и накоплению микробной массы при реак­торном способе культивирования микроорганизмов.

1.5. ВЫРАЩИВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В РЕАКТОРЕ И КОНТРОЛЬ ЗА ПРОЦЕССОМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Рассмотрим примеры особенностей культивирования некоторых микроорганизмов с применением:

1. Активной аэрации микробных культур.

2. В покоящемся состоянии без применения механических меша­лок (без аэрации).

3. В состоянии анаэробиоза.

Промышленное культивирование микроорганизмов с применением активной аэрации

Процесс осуществляют в реакторах объёмом от 0,01 до 100 м3, как правило, в асептических условиях. Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность стерильность и стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор пода­ют простерилизованную в УНСи охлажденную до 25-35°С питатель­ную среду, вносят посевной материал в количестве 5-10% объёма пи­тательной среды (0,2-0,4 млрд. живых микробных клеток в 1 мл по оптической концентрации), включают систему аэрации и перемеши­вающее устройство. Так, например, для листерий и сальмонелл ско­рость вращения механической мешалки составляет 150-180 об/мин, а культура микробов аэрируется подогретым до 37°С очищенным, сте­рильным воздухом с коэффициентом подачи 1,5 л воздуха на 1 л среды в одну минуту. Коэффициент заполнения реактора обычно 0,5-0,8.

Превышение этой величины может привести к значительному уносу пены с отходящим воздухом и нарушению асептических условий.

Температуру культивирования поддерживают путём подачи охла­ждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппа­рата.

Оптимальная температура для разных микроорганизмов различна, обычно от 25 до 37°С.

Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе культиви­рования добавляют соответствующие титрующие агенты (щёлочи, ки­слоты, раствор аммиака и др.). Продолжительность выращивания мик­роорганизмов в культиваторе 18-24 ч, спорообразующих - 40-48 ч и 200-250 ч - для актиномицетов и микроскопических грибов.

Процесс культивирования контролируют по показателям приборов - изменение температуры, рН, расход воздуха, частота вращения ме­шалки, а также путём периодического отбора проб (через 1-12 ч в зависимости от длительности процесса).

В отобранных пробах определяют содержание углеводов, общего и аммонийного азота, фосфора, биомассы, целевого продукта метабо­лизма, морфологию микробных клеток, наличие посторонней микро­флоры.

Технология культивирования микроорганизмов в покоящемся состоянии без аэрации

Некоторые микроорганизмы относятся к группе микроаэрофильных (возбудители бруцеллёза, лептоспироза, кампилобактериоза и др.), которые не требуют принудительной аэрации питательной среды, в которой они выращиваются.

Применяют баллонный и реакторный способы культивирования.

Баллонный способ, в частности для культивирования лептоспир, заключается в том, что микробные культуры лептоспир каждого серо­логического варианта выращиваются в 16-литровых стеклянных бал­лонах с 10-12 л сывороточной или альбуминно-сывороточной (произ­водственной) средами при температуре 27-28°С в течение 5-7 суток.

При реакторном способе культивирование проводят в ферментерах, которые могут быть объединены в единую технологическую цепочку. Так, на Ставропольской биофабрике при культивировании лептоспир было смонтировано 54 реактора объёмом от 250 до 5000 л.

Технология промышленного культивирования анаэробных микроорганизмов

К анаэробным микроорганизмам относятся такие, которые способ­ны жить и размножаться при отсутствии атмосферного кислорода.

В силу биологических особенностей анаэробов методы культиви­рования их в промышленности имеют свои особенности.

1. При культивировании анаэробных микроорганизмов нужно в реакторах создать условия полного вытеснения из питательной среды свободного кислорода. Это достигается путём заполнения анаэро(бо)статов газовой смесью водорода и двуокиси углерода, а оста­точный кислород может быть удалён путём каталитического связыва­ния с воздухом.

Анаэробные условия могут быть достигнуты также добавлением в среду восстанавливающих агентов, таких как цистина и сульфида на­трия, аскорбиновой кислоты.

2. Степень анаэробиоза определяется окислительно-восстанови­тельным потенциалом (Eh). Для этих целей в среду вводят окисли­тельно-восстановительные индикаторы, чаще всего используют резазурин (диазорезоурин)-10-4 ч л -1, меняющий цвет от сине-розового до бесцветного. Бесцветное состояние достигается при Eh около 100 мВ и указывает на наличие анаэробных условий.

3. При культивировании анаэробов необходимо постоянно коррек­тировать рН среды, поддерживая её в пределах 7,2-7,8. В процессе роста анаэробов рН среды очень быстро снижается в кислую сторону, что приводит к ингибированию их роста.

1.6. ПЕРИОДИЧЕСКИЕ И ХЕМОСТАТНЫЕ СИСТЕМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

При глубинном выращивании микроорганизмов их культуры могут находиться в периодических, или "закрытых", и хемостатных (непре­рывных) - "открытых" системах.

Закрытой называют такую систему (культуру), когда хотя бы один из компонентов питательной среды или она вся не может ни поступать в систему, ни покидать её. В такой системе скорость роста микроорга­низмов должна после ускорения стремиться к нулю из-за недостатка субстрата или из-за гибели микробных клеток вследствие накопления продуктов метаболизма. Следовательно, периодические культуры микроорганизмов находятся в неустойчивом состоянии.

Открытая (хемостатная) система - это система, когда все питатель­ные компоненты могут поступать в реактор, в котором выращивается тот или иной микроорганизм, и удаляться из реактора в виде продук­тов синтеза микроорганизмов (антибиотики, витамины, ферменты и т. д.) или биомасса самих микроорганизмов. При этом скорость посту­пления питательной среды в реактор и удаление из него продуктов синтеза или биомассы можно регулировать в нужной нам среде раз­множения микроорганизмов.

Периодическое культивирование микроорганизмов

В периодическом состоянии динамика роста и размножения микро­организмов в жидкой питательной среде обладает рядом особенностей, общих для бактерий, актиномицетов, микроскопических грибов, микоплазм и других про - и эукариот. При индивидуальном развитии им свойственна высокая скорость размножения. Развитие происходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность которых зависят от физиологического состояния клеток, определяемого в свою очередь условиями разнообразных факторов среды, в которой разви­ваются популяция того или иного организма.

Другими словами, фазы роста микроорганизма отражают количест­венные и качественные изменения в их биомассе и окружающей среде.

В простой гомогенной периодической культуре микроорганизмов выделяют от 4 до 8, и даже до 16 фаз.

1. Исходная фаза (лаг-фаза или индукционный период) являет­ся фазой задержки роста, когда размножения микробных клеток не происходит. Эта фаза характеризуется отсутствием роста клеток. В этот период посевная культура приспосабливается к изменившимся внешним условиям и вырабатывает ферменты, необходимые для роста на данной питательной среде. В лаг-фазе в клетках культуры происхо­дят значительные качественные изменения: возрастет количество нук­леиновых кислот, в первую очередь РНК, активизируются одни фер­менты и синтезируются другие.

Продолжительность лаг-фазы зависит от следующих факторов:

- от состава питательной среды - если питательная среда по составу мало отличается от среды, на которой росла посевная культура, лаг-фаза может практически отсутствовать;

- от качества посевного материала ~ количества в нем жизнеспо­собных клеток, их возраста, способа хранения;

- от посевной дозы.

2. Период положительного ускорения роста. Длительность этого периода для большинства микроорганизмов составляет 2 часа, и она зависит от температуры, состава питательной среды, качества посевно­го материала. Многие авторы эти две фазы рассматривают вместе. Число клеток остаётся постоянным из-за отсутствия в этот период кле­точного деления. Общее состояние микробных клеток характеризуется как состояние приспособления к питательной среде. В этот период усиливается синтез веществ, клеток, они увеличиваются в размере, в них образуется большое количество индуцибельных ферментов.

3. Фаза логарифмического (лог-фаза) или экспоненциального (показательного) роста. Она характеризуется постоянной и макси­мальной скоростью роста клеток. Рост микробов в эту фазу происхо­дит в геометрической прогрессии.

Продолжительность этой фазы зависит:

- от запаса питательных веществ в среде;

- от условий аэрации;

- от перемешивания и др. факторов.

Для описания процессов роста микроорганизмов используют такие характеристики, как общая и удельная скорости роста биомассы (или числа клеток). Другой важной характеристикой роста культуры явля­ется время генерации, за которое биомасса культуры удваивается. Время генерации из разных культур микроорганизмов сильно различа­ется. Наиболее быстрорастущие бактерии при благоприятных услови­ях генерации имеют период генерации - 20-25 мин.

Продолжительность генерации в лог-фазе у разных микроорганиз­мов не одинакова. Так, для сальмонелл она равна 20-30 мин., для стрептококков и стафилококков - 25-35 мин., для эшерихий - 15-17 мин.

На продолжительность генераций влияют температура, рН среды, состав среды и т. д.

Если на единицу объема растущей периодической культуры прихо­дится а0 клеток - это число клеток, которое внесли в питательную сре­ду с маточной культурой в момент to, то после п делений за время t число клеток будет Ао х 2n = Аt

Логарифмируя это выражение получим: lg Аt == lg Ао + п lg 2.

Количество клеток в момент to и t определяют подсчетом в камере Горяева с помощью автоматических счетчиков, используемых для подсчета форменных элементов крови типа Целлоскоп или Каултера, или спектро-фотометрически (турдиметрически или нефелометрически). Однако с помощью этих методов определяются как живые, так и мертвые клетки.

В некоторых случаях проводят подсчет только живых клеток. Для этого производят высев клеток на плотные питательные среды с по­следующим подсчетом числа колоний, образуемых жизнеспособными клетками.

Из приведенного уравнения можно рассчитать количество делений клеток и константу скорости деления (V) — число клеточных делений в 1 час.

п == lgAt-lgAo,

lg2

V=п lgAt-lgAo

t lg2 (t,-to)

Рассмотрим конкретный пример. В питательную среду внесли 1клеток. Через 10 часов культивирования в среде выявили миллиард) микробных клеток.

Константа скорости деления (число клеточных делений в час) рав­на:

Ig109 – lgl03 9-3 6

V - ———————— = ————— = ———— = 2.

0,3010x10 0,3010x10 3,010

Число клеточных делений равно:

IglO 9 - lglO3 9-3 6

п - ——————— == ————— = ——— = 20.

0,3010 0,3 0,3

Время, необходимое для одного клеточного деления (tn),или время генерации:

t 10

tn = — = —— == 0,5 часа.

п 20

Эти данные используют при выборе производственных штаммов и для их объективной оценки. Рост периодической культуры можно проследить не только по чис­лу клеток, но и по урожаю клеток. Под урожаем понимают разность между полученной и исходной массами бактерий. Массу выражают в граммах сухого вещества. Это имеет производственное значение, т. к. рост микробной клетки сопровождается не только делением клеток, но и увеличением размеров и массы одной конкретной особи между дву­мя делениями.

Обозначим первоначальную массу клеток Ао, а Аt - масса клеток через время t. Тогда урожай бактериальной массы А = аt -a0.

Еще одним важным производственным показателем характеристи­ки штаммов бактерий является скорость экспоненциального роста. Для ее расчета используют показатель плотности бактериальной суспен­зии. Это связано с тем, что константа скорости роста и константа ско­рости деления клеток не равноценны, т. к. число и масса клеток не идентичные понятия и во время роста периодической культуры соот­ношение между этими двумя показателями изменяется.

Обозначим константу скорости роста - ц, начальную плотность суспензии бактерий через Хо (г/см3), а конечную Xt (г/см3), при этом начальное время to, а конечное время t1. Тогда константу скорости рос­та вычисляют по формуле:

lgX t-lgXo lgX t-lgXo

M =——————— = —————————.

Lg e(t1-t0) 0,43429 t

t- время культивирования, час; lg e == 0,43429.

Время удвоения клеточной массы td можно рассчитать по формуле:

td = ln 2 = 0,693

M M

ln - натуральные логарифмы при основании e, е = 2,71828.

С экономической точки зрения важным показателем процесса культивирования является показатель, называемый экономическим коэффициентом. Если обозначить его через букву Y, его можно рас­считать по формуле:

А

Y= __

S

где S - количество потребленного субстрата (г); А - сухая бакмасса (г).

Высокая скорость развития микроорганизмов сохраняется на всей экспоненциальной стадии. Однако эта зависимость наблюдается в те­чение ограниченного времени. По мере роста культуры в среде посте­пенно потребляются питательные вещества, накапливаются продукты обмена, затрудняется транспорт питательных веществ (в первую оче­редь кислорода) и метаболитов вследствие увеличения плотности по­пуляции.

4. Фаза отрицательного ускорения. В эту фазу скорость размно­жения замедляется, а время генерации увеличивается. Наступление этой фазы обусловлено истощением питательной среды и накоплением в культуральной жидкости токсических веществ, которые начинают ингибировать развитие культуры. Кроме того, в эту фазу происходит наивысшее накопление микробной массы в единице объёма.

5. Стационарная фаза роста, или максимума, на протяжении ко­торой численность микробной популяции не уменьшается. В эту фазу скорость размножения и отмирания клеток одинаковая. Концентрация живых клеток в эту фазу достигает максимума, и она называется М-концентрацией. В этой фазе сама биомасса микроорганизмов и про­дукты их биосинтеза обладают наибольшей биотехнологической цен­ностью.

6. Фаза отмирания микробной популяции. Любая микробная популяция, растущая в сосуде с несменяемой средой, вступает после фазы стационарного роста в стадию отмирания. По скорости отмира­ния вначале устанавливают фазу ускоренного отмирания (VI), затем фазу постоянной скорости отмирания (VII) и фазу замедленной скоро­сти отмирания (VIII). Причинами отмирания микробной популяции являются истощение среды и накопление в ней большого количества токсических продуктов метаболизма. В период стадии отмирания об­щее количество биомассы уменьшается, что чаще всего происходит за счет аутолиза.

Продолжительность стадии отмирания у различных микроорганиз­мов не одинакова: у пневмококка она составляет 2-3 суток, у эшери-хий — несколько месяцев. В этот период в культуре находят значитель­ное уменьшение клеток. У них уменьшается биохимическая и анти­генная активность.

Учитывая это для изготовления ряда биопрепаратов отбирают культуры микроорганизмов чаще всего в фазе отрицательного ускоре­ния роста, или в начале стационарной фазы роста, когда концентрация живых микробных клеток приближается или равна М-концентрации.

Хемостатная культура, или метод непрерывного культивирования микроорганизмов

Хемостатная, или непрерывная, культура представляет собой проч­ную культуру тех или иных микроорганизмов. В таком случае воз­можность продления жизни микробной популяции поддерживается с помощью непрерывной подачи свежей среды и постоянного отбора микробной биомассы или образовавшихся продуктов метаболизма, т. е. можно культуру микроорганизма как бы зафиксировать в одной, например стационарной, фазе роста и получать нужные продукты об­мена или биомассу во времени столько, сколько требуется. Таким об­разом, максимальная производительность в хемостатной культуре все­гда выше, чем максимальная производительность в периодической культуре.

Нужно сказать, что до 50-х годов для культивирования микроорга­низмов с целью их всестороннего изучения служила простая периоди­ческая культура. Только с переходом к методу хемостатного культи­вирования обнаружился недостаток периодической культуры, которая не даёт полного представления обо всех изменениях, происходящих в клетке, и о влиянии внешних факторов на протекающие в ней процес­сы.

Развитие хемостатного культивирования открыло возможность управлять процессом, контролируя рост и поведение микроорганиз­мов, а при необходимости вмешиваться в этот процесс, изменяя ско­рость роста до задаваемых пределов путём воздействия на такую куль­туру внешними факторами. В настоящее время интерес к непрерывно­му культивированию растёт как в нашей стране, так и за рубежом. Од­нако, несмотря на преимущества хемостатных культур, в биологиче­ской промышленности при производстве вакцин они не получили ещё достаточного применения по следующим причинам:

1. Технические трудности, в первую очередь связанные с создани­ем асептических условий.

2. Не во всех случаях непрерывный процесс предпочтительнее пе­риодического, поскольку при низкой удельной скорости роста биомас­сы периодический процесс по эффективности не уступает непрерыв­ному и более выгоден, т. к. его проще осуществить.

3. Интенсивный биосинтез многих продуктов метаболизма проис­ходит при медленном росте биомассы, поэтому в периодических про­цессах концентрация целевого продукта в культуральной жидкости обычно выше, чем в непрерывных, что существенно повышает эффек­тивность стадий выделения и очистки продукта. Всё это свидетельствует о том, что периодические процессы в бу­дущем будут применяться.

2. ОСОБЕННОСТИ БИОТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ

Вирусы являются облигатными внутриклеточными микроорганиз­мами, поэтому на искусственных питательных средах они не растут. Для культивирования вирусов используют 3 живые системы:

1. Восприимчивые животные.

2. Куриные эмбрионы.

3. Культуры клеток.

При лабораторном культивировании вирусов используют культу­ры клеток, растущие на поверхности стенок тех или других емкостей (матрасах).

В крупномасштабном производстве используют метод выращива­ния суспензионных клеточных культур. Этот метод впервые описал в 1953 г. Оуенс. Он показал способность клеток размножаться в жидкой среде в свободном суспендированном состоянии. Клетки перевивае­мых линий могут длительно культивироваться во взвешенном состоя­нии. В таких условиях клетки размножаются, не прикрепляясь к стен­кам культурального сосуда, благодаря постоянному перемешиванию среды. Перемешивание суспензионных культур проводят лопастными и магнитными мешалками, а также круговыми качалками.

В настоящее время указанная клеточная система широко использу­ется в вирусологических исследованиях для накопления больших ко­личеств вируссодержащего материала при изготовлении вакцин, т. к. при оптимальном режиме выращивания клетки в суспензиях быстро размножаются и дают более высокий «урожай», чем в стационарных культурах.

Суспензионные культуры готовят из однослойных клеточных культур. Клетки снимают со стекла с помощью растворов Версена и трипсина. Осадок клеток после центрифугирования ресуспендируют в свежей ростовой питательной среде. Приготовленную суспензию по­мещают в культуральные сосуды, реакторы, ферментеры и выращива­ют при постоянном и интенсивном перемешивании. Это делается для того, чтобы поддерживать клетки во взвешенном состоянии, препятст­вовать их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в то же вре­мя не вызывать их механического повреждения. Способ суспензионного выращивания клеток в биологической про­мышленности стал применяться сравнительно недавно.

Даже за короткий срок получены впечатляющие результаты. Боль­шие успехи достигнуты при получении суспензионных постоянных культур клеток ВНК-21 для выращивания вируса ящура, вируса бе­шенства клеток почки поросят JBRS-2 для размножения вируса ящура, вируса везикулярной болезни свиней и др.

Выращивание клеточных культур осуществляют в специальных ре­акторах емкостью 1000 и более литров при температуре 36-37° С, рН 7,4 и непрерывном перемешивании суспензии клеток при 300-350 об/мин.

Несмотря на достижения по выращиванию суспензионных клеточ­ных культур, на многих предприятиях биологической промышленно­сти чаще используются методы получения клеточных линий в состоя­нии покоя или роллерным (динамичным) способом.

ЛЕКЦИЯ 3.

Концентрирование и высушивание биопрепаратов

В культуральной жидкости после окончания процесса ферментации содержатся микроорганизмы, продукты их жизнедеятельности, остатки питательной среды, пеногаситель, растворимые и нерастворимые ве­щества. Целевым продуктом биосинтеза могут быть непосредственно сами микроорганизмы, либо их метаболиты, растворенные в культу­ральной жидкости или находящиеся внутри клеток микроорганизмов.

Почти во всех случаях для получения целевого продукта необходи­мо отделить взвешенную фазу - массу микроорганизмов от культу­ральной жидкости.

Культуральные жидкости обычно являются сложными смесями и содержат большое число компонентов, многие из которых обладают близкими физико-химическими свойствами.

Наряду с растворенными минеральными солями, углеводами, бел­ками и другими органическими веществами культуральные жидкости содержат в значительном количестве полидисперсные коллоидные частицы и взвеси. Следовательно, они являются не только многоком­понентными растворами, но и суспензиями. Дисперсная фаза этих сус­пензий состоит из мицелия или клеток микроорганизмов, а также из твердых частиц, содержащихся во многих питательных средах - муки, хлопьев из кукурузного экстракта и т. п. Содержание микроорганизмов в культуральной жидкости, как правило, очень низкое. В 1 л содержит­ся обычно 5-10 г сухой биомассы. Отделение такого количества взве­шенной фазы-трудная технологическая задача, которую приходится решать путем концентрирования биомассы различными способами (флотирование, сепарирование, упаривание).

В производственных условиях приходится затрачивать значитель­ное количество энергии на обработку больших объемов труднофильт-руемых суспензий.

Способы отделения клеточной биомассы микроорганизмов от куль­туральной жидкости можно разделить на:

- механические (отстаивание, фильтрование, центрифугирование)

- теплотехнические (сушка).

В зависимости от конечной цели выбирают различные сочетания этих способов. При выборе схемы концентрирования и извлечения биомассы проводят предварительную экономическую оценку выбран­ного способа с учетом товарной формы биопрепаратов, концентрации микроорганизмов в культуральной жидкости и др.

Большинство целевых продуктов микробиологического синтеза не­стабильны и подвержены влиянию различных факторов. Белки, напри­мер, исключительно чувствительны к нагреванию, изменению рН сре­ды, к многим физическим и химическим воздействиям.

Очень часто выделить целевой продукт с помощью одного метода практически невозможно. Поэтому применяют комбинацию несколь­ких методов.

1.МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ПРОДУКТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА

При выборе метода выделения и концентрирования того или иного продукта микробиологического синтеза необходимо учитывать сле­дующие факторы:

1. Физико-химические свойства культуральной жидкости.

2. Свойства выделяемого продукта (термолабильность, стойкость к различным химическим агентам и др.).

3. Требования к конечной форме продукта (степень чистоты и сте­пень концентрирования).

4. Технологические и технико-экономические показатели (выход продукта, производительность оборудования, необходимость даль­нейшей обработки и др.).

Все методы выделения продуктов микробиологического синтеза из культуральной жидкости делят на две группы:

1. Экстракция, ионный обмен, адсорбция, кристаллизация - если целевой продукт в растворе.

2. Осаждение, фильтрование, центрифугирование, сепарирование - если целевой продукт в виде твердой фазы.

Часто невозможно выделить целевой продукт с помощью одного метода, тогда применяют комбинацию нескольких методов и в процес­се выделения переводят продукт из растворимой формы в нераствори­мую (или наоборот). Как правило, при выделении растворенных ве­ществ культуральную жидкость приходится подвергать предваритель­ной обработке и очистке с помощью осаждения, фильтрования, центрифугирования, сепарирования и мембранных методов (электродиа­лиз, ультра - и микрофильтрация).

1.1. ОСАЖДЕНИЕ

Осаждение (седиментация) - это процесс расслоения дисперсных систем под действием силы тяжести и отделение дисперсной фазы в виде осадка.

Простейший случай седиментации - отстаивание применяют в следующих случаях:

1. При диаметре частиц более 3 мкм, когда броуновское движение не оказывает существенного влияния на процесс отстаивания.

2. При выделении стабильных продуктов, когда фактор времени не имеет решающего значения.

3. При более низких, чем при других методах, затратах.

4. В особых случаях, когда необходимо разделить частицы на фракции по размеру или плотности на основании их различных скоро­стей осаждения.

5. Если необходимо предварительно разделить суспензию на две фракции - осадок и надосадочную жидкость, которые в дальнейшем можно обрабатывать на различном оборудовании.

Скорость осаждения биомассы из культуральной жидкости невели­ка и составляет порядка 10-6 – 10-7 м/с.

Для ускорения процесса осаждения применяют:

1. Коагулянты - вещества, переводящие взвешенные частицы в агрегатно-неустойчивое состояние.

2. Флокулянты - вещества, способствующие разрушению колло­идных структур и образованию крупных хлопьев.

В качестве коагулянтов применяют обычно желатин, рыбный клей, казеин, в качестве флокулятов - метилцеллюлозу, пектин, альгинат натрия и др.

1.2. ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

Центрифугирование - это разделение неоднородных систем под воздействием поля центробежных сил.

Для центрифугирования применяют центрифуги различных конст­рукций.

Центрифуги, имеющие высокий фактор разделения и оснащенные тарельчатым барабаном называют сепараторами. В микробиологиче­ской промышленности сепараторы являются одним из самых распро­страненных типов центрифуг. Сепараторы позволяют сконцентриро­вать осадок до влажности 60-90%.

В последние годы появились специальные герметичные сепарато­ры, позволяющие вести процесс сепарирования в автоматизированном режиме, оптимально подобранном для специфических условий кон­кретных культуральных жидкостей.

Области применения центрифугирования:

1. Выделение биомассы из культуральной жидкости (дрожжи, бак­терии, грибы).

2. Отделение различных целевых продуктов микробиологического синтеза (антибиотики, ферменты, витамины и др.), переведенных предварительно в твердую фазу.

3. Разделение эмульсий, образующихся при экстракции.

Недостатки центрифугирования:

1. Сложность конструкции, высокая энергоемкость и стоимость.

2. Сложность эксплуатации (ненадежность, вибрация, шум, необ­ходимость периодической разборки и мойки).

3. Воздействие на клетку центробежной силы, нагрев, трудность герметизации и обеспечения асептических условий ведения процесса.

Главные достоинства центрифугирования и сепарирования - вы­сокая производительность и высокая степень концентрирования - по­зволяют успешно конкурировать с другими способами выделения и концентрирования как в промышленных, так и в лабораторных услови­ях.

1.3. ФИЛЬТРОВАНИЕ

Фильтрование - это разделение твердой и жидкой фаз суспензии при пропускании ее через пористую перегородку.

Конечная цель фильтрования - получение твердой или жидкой фа­зы (когда одна из них является отходом), а также одновременное полу­чение твердой и жидкой фаз.

Фильтрование - гидродинамический процесс, скорость которого прямо пропорциональна разности давлений, создаваемой по обеим сторонам фильтровальной перегородки и обратно пропорциональна сопротивлению, испытываемому жидкостью при ее движении через поры перегородки и слой образовавшегося осадка.

На процесс фильтрования влияет ряд факторов, которые можно разделить на две группы:

1. Макрофакторы - разность давлений, толщина слоя осадка, вяз­кость жидкой фазы и др. Эти факторы заведомо известны и контроли­руются с помощью приборов.

2. Микрофакторы - размер и форма частиц осадка и пор фильтро­вальной перегородки, толщина двойного электрического слоя на по­верхности частиц и др. Эти факторы менее изучены и их характеризу­ют лишь косвенными методами. Именно микрофакторы оказывают решающее влияние на процесс фильтрования и затрудняют его мас­штабирование.

При фильтровании культуральной жидкости образуются большей частью студенистые хлопьевидные или мелкозернистые осадки, обла­дающие большим сопротивлением. Средняя скорость фильтрации при этом составляет всего 50 л/м2 в час.

Для увеличения скорости фильтрования обычно используют два приема:

1. Предварительная обработка суспензий.

2. Применение вспомогательных фильтровальных материалов. Предварительная обработка культуральной жидкости позволяет бо­лее полно перевести целевой продукт в жидкую или твердую фазу, обеспечить лучшее разделение фаз и получить продукт, годный для дальнейшей очистки и выделения. В результате предварительной об­работки происходит коагуляция взвешенных частиц.

Наиболее распространены следующие способы предварительной обработки:

1. Кислотная коагуляция (применяется для выделения антибиоти­ков, стойких к низким рН).

2. Обработка электролитами.

3. Тепловая коагуляция (возможна в тех случаях, когда продукт стоек к нагреванию до 70-80°С).

4. Образование наполнителей при добавлении химических агентов. В качестве вспомогательных фильтровальных материалов исполь­зуются фильтровальные порошки, которые вносят в фильтруемую жидкость как наполнители или предварительно наносят на рабочую поверхность фильтра в виде грунтового слоя.

1.4. ЭКСТРАКЦИЯ

Экстракция — процесс разделения смеси твердых и жидких ве­ществ с помощью избирательных (селективных) растворителей (экст-рагентов).

Физическая сущность экстракции состоит в переходе извлекаемого компонента их одной фазы (жидкой или твердой) в фазу жидкого экст-рагента при их взаимном соприкосновении. Экстрагируемые компо­ненты переходят из исходного раствора в растворитель вследствие разности концентраций, поэтому данный процесс относится к числу диффузионных.

Процесс экстракции проводится обычно в двухфазных системах:

«твердое тело-жидкость» или «жидкость-жидкость».

Область применения экстракции: выделение и очистка антибиоти­ков, витаминов и аминокислот.

Преимущества метода:

1. Низкие затраты.

2. Высокая скорость экстракционных процессов.

Недостаток метода: использование вредных, взрывоопас­ных органических растворителей.

1.5. ИОНООБМЕН

Ионообмен представляет собой сорбционный процесс.

Адсорбция - это процесс поглощения одного или нескольких ком­понентов целевого продукта из газовой смеси или раствора твердым веществом – адсорбентом.

Процессы адсорбции (как и другие процессы массопередачи) изби­рательны и обычно обратимы. Благодаря этому становится возможным выделение поглощенных веществ из адсорбента, т. е. проведение про­цесса десорбции,

Первые сорбционные методы выделения и очистки биологически активных веществ и антибиотиков были основаны на применении мо­лекулярных сорбентов (активированные угли, окись алюминия и др.). Молекулярные сорбенты которые одинаково хорошо сорбируют выде­ляемое вещество и ряд примесей.

В настоящее время разработаны ионообменные сорбенты (иониты), которые характеризуются различной избирательностью и высокой специфичностью.

Иониты - это органические и неорганические вещества, практиче­ски нерастворимые в воде и обычных растворителях, которые содер­жат активные (ионогенные) группы с подвижными ионами, способные обменивать эти ионы на ионы электролитов при контакте с их раство­рами.

Наиболее перспективны синтетические ионообменные смолы (КУ-2, КБ-4, КБ-ЧП-2, КМД, АВ-17, ЭДЭ-10 и др.).

В зависимости от наличия ионогенных групп иониты можно разде­лить на 2 основных класса:

1. Ионообменные сорбенты, содержащие кислотные группы - катиониты (нерастворимые кислоты).

2. Ионообменные сорбенты, содержащие основные группы - анио-ниты (нерастворимые основания).

Иониты нашли широкое применение в технологии производства антибиотиков на этапе их сорбции из культуральной жидкости.

1.6. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ

Кристаллизация - это выделение твердой фазы в виде кристаллов, главным образом, из растворов и расплавов.

Кристаллизация антибиотиков и других биологически активных веществ основана на резком уменьшении их растворимости в результа­те изменения температуры раствора (обычно понижения, но иногда, например, в случае эритромицина - повышения) или перевода их в другую плохо растворимую химическую форму. Последнее достигает­ся изменением рН раствора или добавлением соответствующего реа­гента, часто с одновременным снижением температуры.

Кристаллизация является не только способом получения антибио­тиков в твердом виде, но и очень эффективным средством очистки от сопутствующих примесей, что является существенным преимуществом по сравнению с некоторыми другими методами разделения.

Метод кристаллизации нашел применение в технологии получения антибиотиков (тетрациклина, эритромицина и др.), витаминов, полисахаридов.

1.7. УПАРИВАНИЕ

Упаривание - это процесс концентрирования жидких растворов путем частичного удаления растворителя испарением при нагревании жидкости. В ряде случаев упаренный раствор подвергают последую­щей кристаллизации.

Концентрированные растворы и твердые вещества, получаемые в результате упаривания, легче и дешевле перерабатывать, хранить и транспортировать.

Обычно упаривание в производстве антибиотиков осуществляют при температуре 60-70°С под вакуумом, поэтому данный метод недо­пустим при переработке термолабильных биологически активных ве­ществ.

2. МЕМБРАННЫЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ

К мембранным методам разделения относятся:

1. Диализ и электродиализ.

2. Обратный осмос.

3. Микрофильтрация.

4. Ультрафильтрация.

В основе этих методов лежит явление осмоса - диффузии раство­ренных веществ через полупроницаемую перегородку, представляю­щую собой мембрану с большим количеством (дона 1 м2) мелких отверстий - пор, диаметр которых не превышает 0,5 мкм.

Под мембраной обычно принято понимать высокопористую или беспористую плоскую или трубчатую перегородку, оформленную из полимерных или неорганических материалов и способную эффективно разделять частицы различных видов (ионы, молекулы, макромолекулы и коллоидные частицы), находящиеся в смеси или растворе. Использо­вание мембран позволяет создавать экономически высокоэффективные и малоотходные технологии.

Среди мембранных процессов особенно интенсивно развиваются баромембранные. Если обратный осмос изучен достаточно полно, то существенно в меньшей мере это касается микрофильтрации и тем бо­лее ультрафильтрации, несмотря на ее очевидную перспективность. Границы баромембранных методов разделения четко не определены, что, по видимому, принципиально невозможно, поскольку микро - и ультрафильтрация и обратный осмос в широких пределах перекрываются как в отношении их физико-химического описания, так и решае­мых задач. Следовательно, приведенная классификация барометриче­ских методов разделения в значительной мере условна. Тем не менее, каждый из указанных методов имеет свои характерные особенности, на основании которых предложено несколько их классификаций.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9