Лекции по курсу: биотехнология для студентов факультетов: ветеринарной медицины, биотехнологии (стр. 2 )

1.1. ОТБОР ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И РАБОТА С НИМИ

Эталонные, или референтные, штаммы хранятся и поддерживаются на заданном уровне во ВГНКЙ ветеринарных препаратов. Эти штам­мы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины. При этом инактивированные вакцины, как правило, готовятся из высоковирулентных штаммов, а живые вакцины - из аттенуированных (ослабленных), авирулентных штаммов.

Наряду с производственными и эталонными штаммами во ВГНКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки каче­ства вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильными морфо­логическими, специфическими и биологическими свойствами. Основ­ными требованиями к этим штаммам являются их высокие антигенные и иммуногенные свойства.

Антигенные свойства штаммов оцениваются по титру антител в сыворотке крови чувствительных животных через определенные сроки после введения им микроорганизмов.

Иммуногенньхе свойства штаммов определяются по устойчиво­сти привитых животных к заражению возбудителем болезни опреде­ленной дозой контрольного (вирулентного) штамма и выражают 50%-ной дозой иммуногенности или по нарастанию титра антител в сыво­ротке крови. При этом 80% привитых животных должны быть невос­приимчивы к инфекции, против которой их вакцинировали.

Безвредность (реактогенность) эталонного, производственного штамма проверяют по выраженности реакции у лабораторных и есте­ственно-восприимчивых животных на 5-10-кратное увеличение приви­вочной дозы.

Производственные, эталонные штаммы, должны сохранять генети­ческую стабильных антигенных, иммуногенных и других присущих им биологических свойств на протяжении 10-20 последовательных пере­севов как in vivo, так и in vitro.

1.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСЕВНОЙ МИКРОБНОЙ КУЛЬТУРЫ

Обычно производственное культивирование микроорганизмов при изготовлении вакцин осуществляют в больших объемах. Поэтому вна­чале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находяще­гося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, де­лают посевы в небольшие емкости, например во флаконы емкостью 100-200 см3, заполненные по 50-150 мл производственной средой. За­тем из флаконов делают высевы в большие емкости - бутыли объемом 18-20 литров.

При хорошем накоплении микроорганизмов такую культуру вно­сят в реактор и называют посевной (матрацной, матровой, маточной). При этом нужно предварительно рассчитать необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроор­ганизмов, исходя из посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 10 % по объему. Посевные микробные культуры также контролиру­ются на сохранение ими типичных морфологических, культурально-биохимических, антигенных и иммуногенных свойств и отсутствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ).

1.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Одним из этапов получения биопрепаратов является культивирова­ние микроорганизмов, которое невозможно без достаточного количе­ства разнообразных стандартных, эффективных и недорогих питатель­ных сред (ПС).

В этой связи представляется целесообразным рассмотреть основ­ные принципы, лежащие в основе конструирования ПС, к которым относятся:

- удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов;

- выбор сырьевых источников для конструирования ПС;

- дифференциация ПС по целевому назначению;

- оптимизация ПС;

- стандартизация ПС.

Удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов

Основополагающим принципом конструирования ПС является полноценность, т. е. состав среды должен удовлетворять питательным потребностям культивируемых микроорганизмов.

В процессе роста микроорганизмы потребляют из окружающей их питательной среды целый ряд разнообразных химических веществ, составляющих основу энергетического и конструктивного обмена в клетках.

Поступление питательных веществ в цитоплазму может осуществ­ляться через всю поверхность клетки и связано с их диффузией, а так­же с действием специальных транспортных систем. Причем необходи­мые для роста и жизнедеятельности клетки элементы должны нахо­диться в определенной, легкоусваиваемой форме.

К основным компонентам, формирующим клеточное вещество, от­носятся: углерод, азот, кислород и водород. Содержание этих элемен­тов в различных микроорганизмах практически постоянно.

Синтетические возможности микроорганизмов и способы получе­ния ими энергии разнообразны, следовательно, и очень индивидуаль­ны их потребности в источниках питания.

Отсюда ясно, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов и клеток не существует.

Разнообразие микроорганизмов проявляется, прежде всего, в отно­шении к источникам углерода и азота. Эти элементы представлены в средах различными веществами, и именно они определяют специфич­ность сред.

В зависимости от формы, в которой микроорганизмы используют необходимые им питательные вещества, их подразделяют на две большие группы:

1. Автотрофы — микроорганизмы, которые могут синтезировать вещества своей протоплазмы из простых неорганических соединений. Например, они ассимилируют углерод из углекислоты воздуха, азот из аммиака.

2. Гетеротрофы - микроорганизмы, для которых источником угле­рода и азота служат органические вещества. Они усваивают органиче­ские углеродсодержащие соединения: углеводы, органические кисло­ты, спирты и углеводороды. Наиболее доступные из источников угле­родного питания-углеводы, такие как глюкоза, сахароза или мальтоза.

В зависимости от типов используемых азотистых соединений мик­роорганизмы разделяют на две группы:

1. Протеолитические, расщепляющие высокомолекулярные белко­вые вещества и пептиды;

2. Дезаминирующие, требующие присутствия в среде готовых ами­нокислот, расщепление которых сопровождается выделением аммиака.

Очень часто микроорганизмы и клетки нуждаются во многих при­родных аминокислотах, которые являются универсальными компонен­тами питания. Они целиком включаются в структуру клетки.

Из всех незаменимых аминокислот ключевая роль принадлежит глутамину, а также аргинину, который имеет принципиальное значе­ние для обезвреживания токсичных метаболитов незаменимых амино­кислот и аммиака.

Неорганические соли, входящие в состав ПС, удовлетворяют по­требности микроорганизмов в ионах К+, Mg2+, Мп2+ , Fe2+ или Fe3+, Р043-, S042-. Они же определяют необходимое осмотическое давление среды, величину рН и буферную емкость.

В ПС необходимо также наличие некоторых других ионов, в част­ности, Zn2+ Cu2+ , Co2+ ,Ca2+, СL - и др. Обычно они присутствуют в дос­таточном количестве в виде примесей в питательных основах, мине­ральных компонентах среды или содержатся в водопроводной воде, используемой для приготовления ПС.

Функция необходимых микроорганизмам и клеткам ионов метал­лов заключается в том, что они служат активаторами и кофакторами

многих ферментов, кроме того, участвуют в регуляции синтеза белка, являются компонентами белковых комплексов.

Считается также, что в ПС должны присутствовать факторы роста, различные по химической природе соединения, главным образом, ор­ганические вещества (витамины, аминокислоты, жирные кислоты, пу-риновые и пиримидиновые основания), добавление которых в очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение микро­организмов.

К факторам роста относят витамины группы В, гемин (фактор X), путресцин, олеиновую кислоту, козимазу (фактор Y) и ее ферменты, пуриновые основания (аденин, гуанин, ксантин, гипоксантин) и пири­мидиновые (цитозин, тиамин, урацил), гормоны и др.

Функции факторов роста разнообразны. Они участвуют в процес­сах обмена веществ. Отсутствие или недостаток их в среде приводит к бактериостатическому эффекту.

Выбор сырьевых источников для конструирования питательных сред

Другим наиболее важным принципом конструирования ПС являет­ся выбор сырьевых источников.

Качество ПС во многом определяется полноценностью состава пи­тательных субстратов и исходного сырья, используемого для их при­готовления. Большое разнообразие видов сырьевых источников ставит сложную задачу выбора наиболее перспективных, пригодных для кон­струирования ПС требуемого качества. Определяющую роль в данном вопросе играют, прежде всего, биохимические показатели состава сы­рья, от которых зависит выбор способа и режимов его переработки с целью наиболее полного и эффективного использования содержащих­ся в нем питательных веществ.

Для получения ПС с особо ценными свойствами применяют прежде всего традиционные источники белка животного происхождения, а именно мясо крупного рогатого скота (КРС), казеин, рыбу и продукты ее переработки. Наиболее полно разработаны и широко применяются ПС на основе мяса КРС.

Учитывая дефицит кильки каспийской, широко применяемой в не­далеком прошлом, для получения рыбных питательных основ стала использоваться более дешевая и доступная непищевая продукция рыб­ной промышленности - сухой криль, отходы переработки мяса криля, филетированный минтай и его перезрелую икру. Наибольшее же рас­пространение получила рыбная кормовая мука (РКМ), удовлетворяю­щая требованиям биологической ценности, доступности и относитель­ной стандартности.

Довольно широкое распространение получили ПС на основе казеи­на, который содержит все компоненты, имеющиеся в молоке: жир, лак­тозу, витамины, ферменты и соли. Однако необходимо отметить, что в связи с удорожанием продуктов переработки молока, а также повыше­нием спроса на казеин на мировом рынке, применение его носит не­сколько ограниченный характер.

Из непищевых источников белка животного происхождения в каче­стве сырья для конструирования полноценных ПС необходимо выде­лить кровь убойных животных, которая богата биологически активны­ми веществами и микроэлементами и, кроме того, содержит продукты клеточного и тканевого обмена. Гидролизаты крови сельскохозяйст­венных животных используются в качестве заменителей пептона в дифференциально-диагностических питательных средах.

К другим видам белоксодержащего сырья животного происхожде­ния, которые могут быть использованы для конструирования ПС, от­носятся: плацента и селезенка КРС, сухой белковый концентрат - про­дукт переработки мясных отходов, спилковая обрезь, получаемая при обработке кожи, эмбрионы домашних птиц - отход вакцинного произ­водства, кровезаменители с истекшим сроком годности, творожная сыворотка, мягкие ткани моллюсков и ластоногих.

Перспективно использование тушек пушных зверей из зверо-хозяйств, крови КРС, получаемой на мясокомбинате, обезжиренного молока и молочной сыворотки (отходы маслозаводов).

В целом же ПС, приготовленные из сырья животного происхожде­ния, имеют высокое содержание основных питательных компонентов, являются полноценными и сбалансированными по аминокислотному составу и достаточно хорошо изучены.

Из продуктов растительного происхождения в качестве белкового субстрата для ПС возможно использование кукурузы, сои, гороха, кар­тофеля, люпина и др. Однако, растительное сельскохозяйственное сы­рье содержит белок, несбалансированный состав которого зависит от условий выращивания культур, а также липиды в больших количест­вах, чем продукты животного происхождения.

Обширную группу составляют ПС, изготавливаемые из белкового сырья микробного происхождения (дрожжи, бактерии и т. д.). Амино­кислотный состав микроорганизмов, служащих субстратом для приготовления ПС, хорошо изучен, а биомасса используемых микроорга­низмов является полноценной по составу питательных веществ и ха­рактеризуется повышенным содержанием лизина и треонина.

Разработан целый ряд ПС комбинированного состава из белковых субстратов различного происхождения. К ним относятся дрожжевая казеиновая питательная среда, дрожжевая мясная и т. д.

Основой большинства известных ПС являются гидролизаты казеи­на, мяса КРС и рыбы (до 80%). Удельный же вес непищевого сырья в технологии конструирования ПС составляет всего 15% и в дальней­шем требует увеличения.

Используемое для получения питательной основы (ПС) непищевое сырье должно удовлетворять определенным требованиям, а именно быть:

^ полноценным (количественный и качественный состав сырья должен, в основном, удовлетворять питательным потребностям микро­организмов и клеток, для которых разрабатываются ПС);

^ доступным (иметь достаточно обширную сырьевую базу);

^ технологичным (затраты на внедрение в производство должны осуществляться с использованием имеющегося оборудования или су­ществующей технологии);

^ экономичным (затраты на внедрение технологии при переходе на новое сырье и его переработку не должны превосходить нормы за­трат для получения целевого продукта);

^ стандартным (иметь длительные сроки хранения без изменения физико-химических свойств и питательной ценности).

Дифференциация питательных сред по целевому назначению

Прежде чем приступить к разработке ПС, необходимо решить во­прос о предназначении будущей среды. Следовательно, дифференциа­ция ПС по целевому назначению также является одним из основных принципов их конструирования.

В соответствии с этим принципом среды подразделяют:

• на микробиологические (предназначенные для культивирования бактерий,

дрожжей, грибов);

• среды для культур клеток, часть из которых относят также к ви­русологическим средам.

По физическому состоянию ПС классифицируются на:

> жидкие

> жидкие концентрированные

> полужидкие

> твердые (плотные)

> сухие.

Жидкие среды лучше обогащать кислородом, в них легче изучить влияние на культуру различных факторов, определить бактериальную массу, образование веществ и побочных продуктов. Жидкие среды ис­пользуют для проведения более точных исследований, их составом проще варьировать.

Полужидкие среды получают путем добавления к жидким концен­трирующих примесей, например 0,5% агара, и используют, в частно­сти, для культивирования анаэробных микроорганизмов или при ди­агностике вирусов в чувствительных тканевых культурах.

Для культивирования клеток широко применяются жидкие концен­трированные среды, выпускаемые фирмами в виде 10-, 50- и 100-кратных концентратов.

К плотным ПС обычно относят агаризованные среды, но в качест­ве уплотняющих веществ могут использоваться желатина, силикагель, карбоксилметилцеллюлоза и другие. К ним можно отнести свернутую сыворотку, свернутый яичный белок, картофель, ломтики моркови, зерна, пшено, рис и отруби.

Плотные ПС, в отличие от жидких, более удобны в транспортиров­ке. На них легче проводить микроскопическое изучение культур, легче выявить заражение посторонней микрофлорой и выделить чистую культуру из отдельных колоний. Кроме того, для хранения микроорга­низмов, как правило, применяются именно плотные ПС. Однако, по­скольку плотные среды получают, главным образом, включением в их состав агара, то вместе с ним могут быть внесены в качестве примесей различные катионы, питательные вещества и ростовые факторы в ко­личестве, достаточном для проявления роста некоторых нежелатель­ных культур.

Очень удобны в работе и перспективны в использовании сухие ПС. Они стандартны, хорошо хранятся и транспортируются, быстро рас­творяются в воде при комнатной температуре. Их широко используют для получения диагностических ПС. Дифференциация ПС проводится также по сложности. По этому признаку среда подразделяются на:

< простые, или обычные (пептонная вода, мясо-пептонный буль­он, мясо-пептонный агар, питательная желатина и др.); их иногда на­зывают универсальными;

< сложные, политропные, или специальные (кровяной агар, асци-тический агар и бульон, мясо-пептонный сахарный бульон, сыворо­точный агар и бульон, свернутая сыворотка, кровяной бульон).

По происхождению и природе составных элементов среды подраз­деляются на:

> естественные (натуральные, комплексные);

> полусинтетические;

> синтетические.

Натуральные ПС - это природные, комплексные органические сре­ды неизвестного или неопределенного состава, которые включают ' продукты животного или растительного происхождения.

К ним относятся пептоны, кровь, отвары и экстракты, полученные из природных субстратов (мясо, рыба, навоз, почва, крупы), овощные или фруктовые соки, сусло, молоко, ткани и сыворотка животных, кар­тофель, соевые бобы и др.

На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорга­низмы, т. к. в них имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития. Но они имеют сложный непостоянный хими­ческий состав, т. е. нестандартны, что является их очевидным недос­татком. И поэтому мало пригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, т. к. не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды и образование продуктов обмена по ходу развития.

Полусинтетические среды, кроме органических и неорганических веществ известного состава, содержат в незначительных количествах продукты природного происхождения. Эти ПС также отличаются не­стандартностью (хотя и более стандартны, чем натуральные). Приме­ром могут быть: картофельная среда с глюкозой, состав которой зави­сит от сорта и возраста картофеля; дрожжевая среда; мясо-пептонный бульон и др.

Синтетические ПС готовят из точно определённых количеств орга­нических и неорганических химических соединений известного соста­ва и воды. Преимущество синтетических сред — постоянный состав и воспроизводимость. Однако, как правило, в них требуется вносить различные добавки, в частности факторы роста.

Следует отметить, что среды, содержащие агар, нельзя рассматри­вать как синтетические из-за сложности и недостаточной определён­ности состава агара.

Возможность менять состав среды в нужном направлении делает синтетические среды весьма пригодными для систематического изуче­ния физиологии микроорганизмов путем широкого синтеза питатель­ных веществ из определённых составных частей.

Отдельные штаммы одного и того же вида бактерий по-разному относятся к различным химическим соединениям, и в связи с этим он получил практическое приложение в вопросах дифференциации от­дельных штаммов внутри групп.

По набору питательных веществ выделяют:

• минимальные среды, которые содержат лишь источники питания, достаточные для роста;

• богатые среды, в состав которых входят многие дополнительные вещества.

В зависимости от назначения ПС различают:

• дифференциально-диагностические

• элективные

• селективные

• ингибиторные

• среды для поддержания культуры

• накопительные (насыщения, обогащения)

• консервирующие

• контрольные.

Дифференциально-диагностические - это сложные среды, на кото­рых микроорганизмы разных видов растут по-разному, в зависимости от биохимических свойств культуры. Они предназначены для иденти­фикации видовой принадлежности микроорганизмов, широко исполь­зуются в клинической бактериологии и проведении генетических ис­следований.

Селективные, ингибиторные и элективные ПС предназначены для выращивания строго определенного вида микроорганизма. Эти среды служат для выделения бактерий из смешанных популяций и диффе­ренцирования их от сходных видов. В их состав добавляют различные вещества, подавляющие рост одних видов и не влияющие на рост дру­гих.

Например, для выделения грамотрицательных бактерий рода Brucella из зараженной почвы или навоза применяют питательный агар с добавлением некоторых антибиотиков и кристаллвиолета, которые подавляют большинство патогенных грибов и бактерий, но не влияют на рост бруцелл. В больших концентрациях хлорид натрия подавляет рост многих бактерий, но хорошо переносится стафилококками.

Для достижения избирательности употребляют также азид, цитрат, теллурит, лаурилсульфат и селенит натрия, йод и фенилэтанол. Для этих же целей используют натуральную желчь, очищенные желчные соли и их заменители.

Среду можно сделать селективной за счет величины рН. Примера­ми является среда Сабуро для культивирования дрожжей с низким рН, а также среды с рН от 8 до 9 для выделения холерного вибриона. В последнее время в качестве веществ, придающих средам селективный характер, применяют антимикробные агенты, такие как антибиотики и другие химиотерапевтические вещества.

Элективные ПС нашли широкое применение при выделении возбу­дителей кишечных инфекций. При добавлении малахитовой или брил­лиантовой зелени, солей желчных кислот (в частности, таурохолево-кислого натрия), значительного количества хлорида натрия или ли­моннокислых солей подавляется рост кишечной палочки, но рост па­тогенных бактерий кишечной группы не ухудшается. Некоторые элек­тивные среды готовят с добавлением антибиотиков.

Среды для поддержания культуры составляют так, чтобы в них не было селективных веществ, способных вызывать изменчивость куль­тур.

Накопительные ПС (обогащения, насыщения) — это среды, на кото­рых определенные виды культур или группы культур растут быстрее и интенсивнее сопутствующих. При культивировании на этих средах обычно не применяются ингибиторные вещества, а, наоборот, создают благоприятные условия для определенного присутствующего в смеси вида. Основой сред накопления являются желчь и ее соли, тетратионат натрия, различные красители, селенитовые соли, антибиотики и др.

Консервирующие среды служат для первичного посева и транспор­тировки исследуемого материала.

Выделяют также контрольные ПС, которые применяют для контро­ля стерильности и общей бактериальной обсемененности антибиоти­ков.

По масштабам использования ПС подразделяются на:

> производственные (технологические);

> среды для научных исследований с ограниченным по объему применением.

Производственные ПС должны быть доступными, экономичными, удобными в приготовлении и использовании для крупномасштабного культивирования. Среды для научных исследований, как правило, бы­вают синтетическими и богатыми по набору питательных веществ.

Прописи применяемых в настоящее время ПС очень многообразны. Особенно вариабельны по составу, как наиболее многокомпонентные системы, прописи для клеточных культур, которые могут включать более шестидесяти компонентов.

Оптимизация многокомпонентного состава питательной среды

Несмотря на наличие большого количества работ, посвященных вопросам питания микроорганизмов, не всегда с достоверной точно­стью удается определить количественные и качественные характери­стики необходимых для развития и метаболизма клеток питательных веществ. Поэтому при конструировании новых ПС необходимо прове­дение широких исследований по выбору ПС и оптимизации качест­венных и количественных компонентов среды с целью получения наи­более желаемого результата при ее использовании.

Культивирование микроорганизмов неразрывно связано с целесо­образностью выявления оптимальных условий ведения процесса. При этом приходится иметь дело с задачами определения оптимальных параметров процесса в зависимости от выбранного критерия оптими­зации. Их решение связано с необходимостью максимизации продук­тивности процесса по бактериальной массе и минимизации затрат.

Процессы культивирования микроорганизмов можно оптимизиро­вать методами, которые разделяются на две группы.

К первой группе относятся методы оптимизации по эксперимен­тальным данным. Они не требуют привлечения сложных математиче­ских расчетов, но связаны со значительными затратами времени, воз­никающими из-за необходимости проведения большого количества экспериментальных исследований.

Ко второй группе относятся методы с применением математиче­ских моделей.

В свою очередь последние подразделяются на две отличающиеся по сложности исполнения и точности описания реального процесса подгруппы.

К первой следует отнести методы, основанные на построении ма­тематической зависимости (уравнения регрессии) протекания ограни­ченных процессов с использованием традиционного метода планиро­вания эксперимента Бокса-Уилсона. Он позволяет строить поисковые модели, когда исследователь, не располагая сведениями о механизме соблюдаемого явления, имеет лишь информацию о реакции системы на возмущение.

Ко второй подгруппе относятся методы, основанные на построении моделей, базисом которых являются законы, описывающие протекание фундаментальных процессов микробиологии (например, процесс раз­множения и отмирания микроорганизмов). В этом случае принимается за основу положение, что комплекс всех изменений, происходящих в культуральной жидкости (изменение содержания компонентов ПС, образование и расходование промежуточных продуктов биосинтеза, выделение метаболитов и катаболитов, трансформация органических соединений) - это следствие процессов самовоспроизведения, а также результат реакций, связанных с адаптацией и саморегуляцией микроб­ной популяции.

Оптимизация процессов микробиологического синтеза, основанная на использовании методов второй подгруппы, является наиболее глу­бокой и точной, хотя и более трудоемка и длинна, т. к. требует основа­тельного изучения законов протекания элементарного акта на лабора­торном уровне с целью последующего создания математической моде­ли в форме кинетических уравнений. На основе этой модели идет дальнейшая балансировка состава ПС, а также поиск оптимума основ­ных режимов ведения процесса.

Задача оптимизации управляемого периодического процесса куль­тивирования по максимизации бактериальной массы или целевого про­дукта в общем виде выглядит следующим образом: определяется наи­более рациональный состав исходной ПС, а затем профили изменения основных технологических параметров, обеспечивающих значение выбранного критерия эффективности при заданных ограничениях.

Важнейшим элементом оптимизации технологического процесса является выбор критерия эффективности. В качестве критериев ис­пользуют такие показатели, как концентрация живых микробных кле­ток, съем целевого продукта с единицы объема среды и т. д. Обычно оптимизация процесса культивирования начинается с выбора ПС, обеспечивающей питательные потребности популяции микробов или синтез максимального количества продуктов метаболизма. Количество компонентов, входящих в ПС для выращивания микро­организмов, может превышать десяток элементов. Биологической роли каждого элемента, влияющего в целом ряде случаев в микродозах на активность метаболических превращений в клетке, посвящено боль­шое число исследований.

Сложность выбора определяется еще и тем, что на рост микроор­ганизмов влияет также взаимное соотношение компонентов.

Большое количество и взаимосвязь составляющих ПС ингредиен­тов обуславливает выбор методов экспериментального исследования. Обычно используемые методы однофакторного планирования в этих условиях малоэффективны. Использование же математических мето­дов многофакторного планирования экспериментов позволяет устано­вить необходимые концентрации компонентов питания с учетом их совместного влияния на скорость роста, качество биомассы и количе­ство целевого продукта.

Обычную схему оптимизации ПС можно представить следующими этапами (схема.1).

Схема. 1. Схема оптимизации ПС.

Высоко объективным является и метод балансировки состава ПС, в основу которого заложено использование уравнения ассимиляции микробной популяции, где учитываются такие показатели:

> концентрация потребляемого субстрата;

> время потребления;

> концентрация биомассы;

> коэффициент метаболизма;

> константы скорости образования и отмирания микроорганизмов;

> концентрация субстрата в начальный момент культивирования.

Обычно при периодическом процессе культивирования большинст­во важных параметров, в том числе и концентрация питательных ве­ществ в культуральной жидкости, изменяется в течение времени. Вме­сте с тем, профили их изменения не всегда близки к оптимальным. Поэтому при подборе ПС для периодического культивирования возни­кает противоречие между необходимостью внесения в нее достаточно большого количества субстратов и ингибирующим влиянием высоких концентраций одного или нескольких элементов питания на рост мик­робной клетки и(или) биосинтез целевого продукта. Снижение кон­центрации таких субстратов в исходной ПС с последующим их добав­лением в ферментер, по определенной программе, позволяет исклю­чить ингибирование процесса в начальной фазе роста и в то же время не допустить его лимитирования в последующий период размножения микробов.

Стандартизация питательных сред

Кроме оптимизированного состава, питательные среды, используе­мые в микробиологической практике для выполнения различных экс­периментальных работ, а также для выпуска стабильных по своим свойствам биопрепаратов, должны быть стандартны.

Под стандартностью ПС принято понимать постоянство их состава по биохимическим показателям: аминокислотному, минеральному, жирнокислотному, углеводному составам, а также содержанию вита­минов, углеводородов, антибиотиков и др. компонентов.

Многогранность и сложность проблемы стандартизации обуславли­вают необходимость использования комплексного подхода к решению данных задач, который предусматривает не только разработку требова­ний к качеству сырья, материалов, полуфабрикатов, унификацию тех­нологии оснастки оборудования, но также и разработку совокупности мероприятий, методов и средств, направленных на установление, обеспечение и поддержание необходимого уровня качества препарата на всех стадиях его изготовления и применения.

Большое значение для получения более стандартных ПС имеют разработки на использование в их производстве сухих питательных основ, готовых сухих ПС промышленного изготовления и сухих вита­минсодержащих добавок.

Примером может служить технология изготовления сухого фермен­тативного гидролизата казеина неглубокой степени расщепления, ко­торый широко используется при конструировании многих ПС, а также сухой экстракт кормовых дрожжей.

Работы, направленные на повышение стандартности ПС, могут приводить к их удорожанию, но это считается оправданным, т. к. при­менение разнокачественных сред может приводить к срыву еще более дорогостоящего эксперимента, к появлению брака и к получению не­сопоставимых результатов.

Создание и развитие системы оценки стандартности состава и свойств ПС, оценка воспроизводимости технологии их приготовления являются как одними из основных принципов конструирования ПС, так и передовыми задачами развития микробиологии на современном этапе.

1.4. ПОДГОТОВКА БИОРЕАКТОРА К ПОСЕВУ

Современные биореакторы изготавливаются из нержавеющей стали и представляют собой довольно сложный аппарат, в который осущест­вляют закачку соответствующей для культивируемого микроба пита­тельной cреды.

Реактор имеет рубашку для нагревания паром и охлаждения водой с соответствующей запорной фурнитурой. Внутри реактора имеется турбинная механическая или электромагнитная мешалка со скоростью 150-200 об/мин и трубка для подачи воздуха. На крышке реактора имеются отверстия для подающей и отводящей трубок, смотровое ок­но, окно для освещения и отверстие для вставления четырёх сифонов, служащих для внесения посевного материала, взятия проб, внесения пеногасителя, глюкозы и других питательных веществ, а при необхо­димости и факторов роста. Современные реакторы оснащены различ­ными измерительными приборами.

Регулирование температуры осуществляется автоматически. Реги­страция её, а также измерения рН осуществляется с помощью элек­тронного потенциометра.

При первичной установке реакторов в цехах и при их последующей эксплуатации важной инженерно-технической проблемой является технологическая обвязка биореакторов трубопроводами. К комплексу наиболее важных проблем технологической обвязки относятся:

1. Стерилизация внутренней полости реактора текучим паром.

2. Подача стерильного воздуха во внутреннюю полость реактора при культивировании, либо при удалении готового продукта из неё на последующую обработку.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9