3.7. Эмбриобанк для сохранения генетических ресурсов

и др. [60] отмечают, что потеря наиболее ценной племенной части сельскохозяйственных животных за последние 20 лет в Казахстане вызывает особую тревогу. В связи со сложившейся ситуацией становится сверхактуальной разработка научных основ сохранения аборигенных (местных) пород и популяций животных, представляющих особую генетическую и социальную ценность. Возникла настоятельная и неотложная необходимость разработки научных основ долгосрочного сохранения и перманентного ускоренного воспроизводства редких и ценных генотипов всех видов и пород животных Казахстана. Отмечено, что разработка криогенной технологии сохранения генома животных и диких их сородичей способствует широкому международному обмену геноматериалом, созданию банка их генофонда. Выполнение проекта имеет стратегическое значение в решении проблем сохранения исчезающих генотипов животных и обеспечения продовольственной безопасности страны.

Достижения биотехнологии позволяют положить на неограниченное хранение в жидком азоте по 200 эмбрионов и 1 тыс. доз спермопродукции, для гарантированного возобновления в случае необходимости любой породной группы домашних животных и почти всех млекопитающих, которым грозит уничтожение [61].

В работах , К. Канапина [62] рассматриваются вопросы сохранения породного генофонда овец. Показано, что наибольшее сокращение претерпевали тонкорунные и полутонкорунные породы. Приведены задачи селекционных центров по сохранению малочисленных и исчезающих пород, типов и отродий овец, а также методы их сохранения и этапы работ. Отмечено, что для сохранения генофонда исчезающих пород сельскохозяйственных животных имеются два пути: создание генофондного хранилища спермы; организация коллекционного стада. Важность программы по созданию банка генов эмбрионов и семени баранов исчезающих и малочисленных пород, типов и линий овец соответствует поручению главы Правительства «О создании национального хранилища генетических ресурсов растений и животных» уникального комплекса, соответствующего международным стандартом, вместимостью 500 тыс. растений и генетических материалов животных. Выполнение этих задач государственной важности требует совершенствования достигнутых уровней биотехнологии, разработки новых приемов повышения темпов воспроизводства стада. Здесь главное – получить потомство от высокоценных производителей и предков по материнской линии, которые при минимальных затратах дают больше продукции. Первостепенная роль должна отводиться апробированным методам биотехнологии, таким как отбор и использование генетически ценных производителей, включая опыт зарубежных стран. Метод заготовки кратковременного и длительного хранения спермы и трансплантации эмбрионов позволяет реализовать потенциал значительных генетических ресурсов, использовать производителей и овцематок не только в сезон осеменения, но и практически круглый год, доставлять криоконсервированную сперму в крестьянские и фермерские хозяйства, где отсутствуют племенные производители высокого качества. Проведение этих работ значительно увеличит получение потомков от выдающихся животных и, соответственно, шире распространит желательные генотипы в популяции. В 2005 г. заготовлено семени в соломинках для коктейля всего 5657 доз, в т. ч. южноказахский меринос – 227, казахской курдючной полугрубошерстной породы каргалинского типа – 1067, казахской курдючной с черной головой – 140, сарысуйского типа сарыаркинской породы – 665, казахской тонкорунной – 892, архаромериносов – 297, типа гемпшир – 687, едилбаевской породы – 752, курдючной с белой шерстью – 927 доз.

На современном этапе при замораживании семени баранов предложено немало различных синтетических сред. В лаборатории биотехнологии воспроизводства сельскохозяйственных животных исследовательского центра овцеводства разработаны среды (А. с. N 698617 и патент N 5086), обеспечивающие 4-5 баллов подвижности у заморожено-оттаянного семени барана. Была поставлена задача – увеличить защитные свойства среды, позволяющие повысить подвижность и оплодотворяющую способность замороженного семени. Изучили биологические буферы и обнаружили, что одним из наиболее подходящих буферов, с хорошей буферной емкостью в пределах рН 5,8-7,2 является буфер «бис-трис». Было обнаружено, что некоторые аминокислоты предохраняют белки и фосфолипиды растительного и животного происхождения, включая сперматозоиды барана, от вредного воздействия криоконсервации. С этой целью решили ввести в состав синтетической среды аминокислоту аргинин, обладающую криозащитными и антиоксидатными свойствами. Отмечено, что среда бис-трис с аминокислотой аргинин достоверно повышает подвижность замороженно-оттаянного семени барана [63].

Подготовка спермы к замораживанию заключается в ее разбавлении, цель которой – создание окружающей среды, которая может защитить половые клетки от повреждений в процессе криоконсервирования. Кроме того, при разбавлении увеличивается объем, что дает возможность разделить эякулят хряка на несколько спермодоз. После получения спермы, ее как можно быстрее нужно разбавить, чтобы предотвратить процессы интоксикации. Среда для разбавления спермы хряков должна содержать такой набор осмотически активных компонентов, которые в определенных соотношениях могли бы обеспечить спермиям оптимальные физико-химические параметры (рН, осмолярность, соотношение полярных и неполярных соединений, ионов и др.)., а также температурного шока, криоповреждений и микробной контаминации.

Кроме процесса разбавления спермы, существует ряд технологических приемов, позволяющих подготовить сперму к глубокому замораживанию. К таким приемам относятся различные способы инкубации спермы, применение анаэробных условий, введение антиоксидантов. Кроме того, для лучшей переживаемости спермиев при криоконсервировании используют и различные приемы концентрирования спермы (фильтрацию, отстаивание, центрифугирование), а также способы разбавления спермы. В настоящее время разработано три варианта криопротекторной обработки спермы: первый – без концентрирования сперматозоидов; второй – с концентрированием сперматозоидов ; ентрирования сперматозоидоври варианта криопртекторноймы, применение анаэробных условий, введение антиоксидантов. ных соотно; третий – диализом.

При сравнении трех способов обработки спермы перед замораживанием установлено, что наилучшие результаты по подвижности, выживаемости, сохранности акросом спермиев при замораживании – оттаивании наблюдаются при диализной обработке спермы. При невозможности обработать сперму с помощью диализа хорошие показатели наблюдаются при использовании концентрированной разбавленной спермы, полученной от хряков-производителей мануальным способом. [64].

Сохраняя сперму или яйцеклетки, можно долго хранить форму генетической информации. Однако для восстановления популяции требуется длительное время. Но хранение спермы – очень дешевый метод и легко осуществим в обычных программах разведения животных. Сохранение пород методом разведения стад является очень дорогим методом и требует огромного энтузиазма селекционеров. Кроме того, инбридинг и болезни могут влиять на качество этих генетических ресурсов.

Автор [65] отмечает, архары, обитающие на территории Казахстана, занесены в Красную книгу Казахстана и нуждаются в особой защите государства. Показано, что численность этих животных с каждым годом падает. В настоящее время принимаются срочные меры по сохранению существующих видов архаров во всем их генетическом многообразии. Одним из перспективных методов сохранения генофонда исчезающих видов диких и домашних животных является метод глубокого замораживания сперматозоидов. Целью настоящей работы является, отработка методики замораживания семени архара. Для проведения экспериментов были отобраны семенники убитых архаров во время коммерческой интерохоты. После двух-трехнедельного пребывания в замороженном состоянии, часть семени была оттаяна для осеменения подопытных овец. При этом они были изучены на подвижность. Установлено, что процесс замораживания и оттаивания оказывает определенное отрицательное влияние на жизнеспособность семени архаров. При этом степень этого влияния значительно варьирует в зависимости от качества сред, используемых для разбавления и замораживания. Лучшие показатели получены при использовании состава среды N 1(среда для замораживания спермиев). Если подвижность спермиев, разбавленных средой N 1, до замораживания составляла 70 %, то после оттаивания – 50 %. Это значит, что активность потеряна у 20 % спермиев, тогда как при использовании среды N 2, подвижность теряется у 33,3 % спермиев.

В Казахстане сформировались некоторые приоритеты в программе исследований по биотехнологии. Это искусственное осеменение, криоконсервация гамет, трансплантация эмбрионов, получение трансгенных животных.

Человечество всегда мечтало о возможности получения потомства от предков, которых нет в живых. Это осуществилось, когда был разработан метод криоконсервации спермы баранов-производителей в жидком азоте при температуре – 196 град. С. Проведены три опыта по применению замороженной спермы со сроком хранения 7, 8 и 9 лет. Проведенные три опыта показали, что можно использовать замороженную и сохраненную в течение 7-9 лет сперму баранов полутонкорунных пород с целью освежения крови разводимых в Казахстане овец. При этом суягность составляет 30,3-59,4 %, а плодовитость 112,7-133,1 %. Учитывая дороговизну существующих методов хранения спермы баранов, разработана синтетическая среда, которая сохраняет высокую выживаемость и оплодотворяющую способность спермы баранов-производителей в течение нескольких суток, с подвижностью спермиев более 7 баллов при температуре окружающей среды, без применения хладагентов и пищевых продуктов. Разработанная среда для пролонгации выживаемости спермы легко готовится и отличается дешевизной. Она позволяет транспортировать разбавленную сперму в течение 3 суток, при температуре окружающей среды в любые хозяйства.

Это показывает на перспективность данной технологии, особенно для новых сельхозформирований и фермерских хозяйств.

Метод криоконсервации семени проводится на баранах аборигенных пород, чингизская и чуйская. При этом учтено особая ценность по приспособленности этих овец в Казахстане [66].

Значительная роль в разведении овец отводится использованию баранов-производителей, которые могут обеспечить максимальный генетический прогресс в породе. Поэтому необходимо использовать как оцененных по потомству баранов улучшателей, так и не оцененных, но обладающих высокими фенотипическими достоинствами. Особую важность это приобретает в связи с широким внедрением в практику метода замораживания семени баранов-производителей.

Исследовательским центром овцеводства разрабатываются методики длительного хранения спермы баранов в жидком азоте. В результате установлено, что для глубокого замораживания спермы баранов-производителей в жидком азоте пригодна синтетическая среда N 2. Разработанная среда отличается антиоксидантным свойством и позволяет замораживать сперму баранов независимо от породы и направления продуктивности.

В связи с расширением поиска и внедрением в практику современных методик замораживания и длительного хранения семени производителей, актуальное значение приобретает изучение качества семени и его оплодотворяющей способности в зависимости от времени года. Изучена оплодотворяемость казахских курдючных грубошерстных овец, осемененных замороженно-оттаянным семенем баранов породы авасси. В опыте использовали густое семя с подвижностью не ниже 8 баллов и концентрацией не менее 2,5 млрд./мл. Качество семени оценивали визуально (объем, цвет и концентрация).

Для эксперимента использовались овцематки в возрасте 4-4,5 лет из двух отар, которые расположены примерно в 10 км друг от друга и имеют одинаковые условия кормления и содержания.

Цервикальное осеменение овец замороженно-оттаянным семенем проводили с помощью шприца полуавтомата и влагалищного зеркала. При двукратном осеменении овцам вводили в шейку матки по 0,2 мл оттаянного семени утром (8-10 ч.) и вечером (16-18 ч.). При однократном осеменении овцам вводили по 0,4 мл семени через 10-16 часов после выявления охоты.

В двух отарах цервикальному осеменению подвергалось 284 овец, в том числе в первой отаре 136, во второй 148 и свежеполученной спермой 14. Отмечено, что лучшие результаты получены при выборке овец утром и осеменении их вечером спустя 10-11 часа, суягность овец составила 58,8 %. Всего по двум отарам суягными оказались ,3 %) овцематок. Таким образом, эксперименты показали возможность длительного хранения семени баранов-производителей в жидком азоте без снижения его качественных показателей.

Проблема криоконсервации генетических ресурсов привлекает внимание не только криобиологов, но и других специалистов ввиду ее фундаментальности и практической значимости для человека, животного и растительного мира [67].

В настоящее время имеются существенные достижения в совершенствовании метода длительного хранения спермы животных в глубокозамороженном состоянии. С целью экономии расхода жидкого азота был испытан способ замораживания спермы баранов-производителей в алюминиевых пакетиках в горловине или же самом сосуде Дьюара. Среда для разбавления (патент 5182), степень разбавления 1:3, расфасовка по 1,5; 3,0; 4,5 мл. Эквилибрация 1,5-2,0 часа. Замораживание в горловине сосуда Дьюара в течении 4-5 минут, затем погружение в жидкий азот для длительного хранения. Ширина пакетика – 1,5, а длина – 7,5 см.

Было проведено 37 опытов.

При 1 сантиметре над поверхностью жидкого азота в 5 опытах подвижность разбавленного семени составила при объеме 1,5 мл – 8,4 балла, при объеме 3,0 мл в 4 опытах – 7,25 балла, при объеме 4,5 мл в 4 опытах – 7,25 балла, а размороженного соответственно 4,4-4,0 балла.

При 5 сантиметрах над поверхностью жидкого азота подвижность разбавленного семени составила при объеме 1,5 мл в 5 опытах - 8,4, при объеме 3,0 мл в 4 опытах – 7,5, при объеме 4,5 мл в 4 опытах – 7,5 балла, а размороженного соответственно 4,8-4,7 – 5,0 балла.

При 10 сантиметрах над поверхностью жидкого азота подвижность разбавленного семени составила при объеме 1,5 мл в 5 опытах – 8,4, при объеме 3,0 мл в 3 опытах – 7,33, при объеме 4,5 мл в 3 опытах – 7,33 балла, а размороженного соответственно 3,8-3,83 – 4,0 балла.

Таким образом, наиболее приемлемым является замораживание спермы баранов-производителей в алюминиевой фольге на расстоянии 5 сантиметров над поверхностью жидкого азота в горловине сосуда в течение 4-5 минут объемом 1,5-4,5 мл. При замораживании спермы объемом более 3,0 мл необходим двойной слой фольги [68].

В странах СНГ наиболее широко используется замораживание спермы в форме гранул объемом 0,1-0,2 мл на поверхности охлажденной фторопластовой пластины. Этот метод имеет следующие недостатки: высокий расход жидкого азота, гранула семени имеет открытую поверхность и не защищена от загрязнения и механических повреждений, миграция раствора спермиев с одной лунки на другую при замораживании, невозможность маркировки индивидуальных гранул, неодинаковый объем гранул при расфасовке с помощью шприца.

За рубежом более широкое применение получило замораживание спермы в соломинках объемом 0,25 и 0,5 мл с помощью компьютеризированных программных замораживателей, недостатками которых являются дороговизна, высокий расход жидкого азота и медленный режим замораживания.

В лаборатории воспроизводства исследовательского центра овцеводства был разработан новый способ замораживания семени в соломинках объемом 0,25 мл. Был определен оптимальный режим замораживания соломинок непосредственно в сосуде Дьюара. Преимуществом этого способа замораживания является пониженный расход жидкого азота, доступность материалов и простота изготовления инструментов для замораживания семени. С использованием нового способа было заморожено около 3 тыс. доз семени, при этом подвижность оттаянного семени составила 4-6 баллов.

Основным недостатком замораживания семени в соломинках объемом 0,25 мл является трудоемкость при расфасовке и маркировке соломинок. Маркировочная линия IVM французского производства является очень дорогой (20 тыс. евро).

В исследовательском центре овцеводства был испытан способ замораживания спермы баранов в алюминиевых пакетиках непосредственно в сосуде Дьюара. Подготовку семени к замораживанию проводили по обычной технологии, замораживание – в сосуде Дьюара в течение 4-5 мин. на высоте 1; 5 и 10 см от поверхности жидкого азота, затем семя погружали в жидкий азот. Было установлено, что наиболее высокую подвижность имело семя, замороженное на расстоянии 5 см над поверхностью жидкого азота.

При замораживании спермы объемом 4,5 мл пакетики в некоторых случаях лопались. Поэтому для замораживания семени объемом 4,5 мл необходимо изготавливать пакетики из двойного слоя фольги. Всего от высокоценных баранов-производителей с использованием этого способа было заготовлено около 4 тыс. доз семени. Недостатками замораживания семени в пакетиках из фольги являются: контакт спермы с алюминием, который токсичен для семени, трудоемкость изготовления пакетиков и неудобство их складирования и хранения.

В связи с вышеизложенным, разработан новый способ замораживания семени в больших соломинках для коктейля диаметром 0,5 см. Объем соломинки составляет 2,5-3,5 мл. Установили оптимальный режим замораживания в таких соломинках непосредственно в сосуде Дьюара и заморозили 6 тыс. доз семени. Подвижность оттаянного семени, замороженного таким способом, составляет 5-6 баллов.

Таким образом, разработано два новых способа замораживания спермы в минисоломинках объемом 0,25 мл и больших соломинках объемом 2,5-3,5 мл. Минисоломинки целесообразно использовать для заготовки спермы от особо ценных баранов для последующего осеменения лапароскопическим способом, тогда как оттаянную сперму из больших соломинок более удобно использовать для цервикального осеменения [69].

Исследовательским центром овцеводства разработана среда для хранения спермы при плюсовой температуре, условно названная ФСК (фосфатно-сульфатно-комплексонатная). Выживаемость спермиев в этой среде при комнатной температуре составила 665 условных единиц, или 136 ч при снижении подвижности спермиев с 9 до 7 баллов. В производственном опыте при осеменении 80 маток суягность овец после первичного осеменения составила при хранении семени до 8 ч – 62,3 %, при хранении до 32 ч – 50,0 и при хранении до 56 ч – 45,5 %. Следовательно, среда ФСК обеспечивает высокую выживаемость спермиев [70].

Для изучения оплодотворяющей способности свежеполученного, разбавленного и замороженного семени в период случной кампании осеменено соответственно 626, 344, и 66 маток в дозе 0,05; 0,1 и 0,2 мл. Процент оплодотворяемости определялся по количеству перегулявших маток, а плодовитость – по результатам ягнения. Установлено, что оплодотворяемость маток, осемененных свежеполученным семенем, была выше по сравнению с разбавленным на 2,9, а с замороженным на – 15,8 %. Выход ягнят в расчете на 100 объягнившихся маток соответственно на 7,3 и 25,9. Отмечено, что использование замороженного семени на производственном поголовье оказалось менее эффективным. Однако, учитывая то, что накопление семени производится от выдающихся в племенном отношении баранов и получая в течение года более 13000 овцедоз семени, можно с успехом использовать замороженное семя для ускорения темпов селекционной работы на племенной части стада. Целесообразность использования баранов-производителей в течение года подтверждается расчетом экономической эффективности, который проводился по прямым затратам на корма в период научно-хозяйственных опытов и стоимости продукции баранов-производителей: прирост массы тела, шерсть, овцедозы семени [52].

В работе [71] обобщены наиболее важные положения содержания, кормления и обслуживания быков. Полностью раскрыты вопросы организации получения, криоконсервации и хранения семени быков-производителей. Предложены принципы налаживания технологии получения и криоконсервации доброкачественного семени. Даны рекомендации по улучшению результативности искусственного осеменения крупного рогатого скота. Материалы по совершенствованию содержания, кормления и обслуживания быков, а также по получению, замораживанию качественного семени и его длительному хранению разработаны и использованы в процессе формирования производственно-технологической базы республиканского племенного центра АО «Асыл-Тyлik».

Г. Т Садыгожаева [72] отмечает, что одним из перспективных мероприятий в развитии молочного скотоводства является широкомасштабное внедрение искусственного осеменения. В 2004 г. в республике работало всего 1400 пунктов с охватом осеменением 19 % хозяйств по разведению КРС. Из 2,2 млн коров искусственно осеменяется ежегодно только 418 тыс., что совершенно недостаточно. Запас замороженного семени в республике составляет около 8 млн доз. При 50 %-ном охвате поголовья искусственным осеменением, этого семени хватит только на 2 года. Следовательно, одной из задач сельскохозяйственного сектора является выявление быков-улучшателей и расширение объема заготовки криоконсервированного семени. При отсутствии такой работы в настоящее время отдельные хозяйства вынуждены использовать импортируемое семя. В этой связи на современном этапе особую ценность имеет работа по использованию криоконсервированного семени быков-производителей зарубежной селекции.

Учитывая названные причины были проведены опыты в следующих хозяйствах: п/з «Каменский», СХПК п/з «Алматы» и АПК «Адал». При этом учитывался опыт США по использованию криоконсервированного семени. По последним данным в США работает более 60 центров, ежегодно осеменяющих 6,9 млн коров (в среднем на одного производителя приходится 2816 коров). В результате научно-исследовательских работ, проведенных в гг. по использованию криоконсервированного семени 23 быков 4 молочных пород, в трех хозяйствах Алматинской области получено 2237 генетически ценных телят. При этом был значительно обновлен генофонд молочного скота и установлена высокая эффективность использования криоконсервированного семени.

Внедрение в практику овцеводства метода длительного хранения спермы баранов коренным образом перестраивает организацию искусственного осеменения овец.

Использование замороженной спермы в овцеводстве экономически оправдано, так как значительно сокращаются трудовые и материальные расходы. Баранов-производителей можно использовать независимо от их места нахождения и расстояния, провести обмен спермой между хозяйствами как внутри страны, так и между зарубежными странами.

В работе [73] указано, что одной из важных задач селекции является создание новых пород и стад овец, сочетающих высокую плодовитость, мясную и шерстную продуктивность и хорошую приспособленность к местным природно-климатическим условиям. Одним из возможных путей создания такого типа является скрещивание различных пород и групп овец.

Благодаря выяснению специфики спермиев барана, анатомо-гистологических особенностей строения цервикального канала овец, разработке высокоэффективных защитных сред, кратности и времени осеменения к настоящему времени в нашей стране предложены комплексные технологии по криоконсервации спермы барана.

Сохраняемость биологических свойств спермиев в глубокозамороженном состоянии зависит от возраста, породных, индивидуальных и других особенностей производителя. Кормление, содержание и эксплуатация производителей являются наиболее мощными факторами, влияющими на качество спермопродукции и на способность спермиев сохранять оплодотворяющую силу в замороженном состоянии. В этой связи весьма интересным является научная работа с применением замороженной спермы баранов породы авасси, разводимые в Израиле.

Улучшение качества стада, повышение его продуктивности возможно только при рациональном и долгосрочном использовании высокоценных баранов-производителей. Поэтому особый интерес представляет метод глубокого замораживания и длительного хранения спермы в жидком азоте, позволяющий брать сперму от баранов в течение 7-9 месяцев, а иногда и всего года, хранить ее годами и создавать большие запасы генетического материала.

В связи с расширением поиска и внедрением в практику современных методик замораживания и длительного хранения семени производителей, которые способствуют более полному их использованию, актуальное значение приобретает изучение качества семени и его оплодотворяющей способности.

Цервикальное осеменение казахских курдючных овец замороженно-оттаянным семенем баранов породы авасси со сроком хранения один год проводилось в двух группах овец, в Абайском районе Восточно-Казахстанской области. Всего осеменено 114 овцематок, в том числе в первой группе 73, во второй 41. Отмечено, что живая масса ягнят, полученных в первой группе составила у баранчиков 5,6 кг с колебанием 4,9-6,1, а у ярочек соответственно 4,9; 4,5-5,8, во второй группе – 5,1 с колебанием 4,0-6,0, а у ярочек 5,2 кг. Результаты проведенных опытов свидетельствуют о возможности длительного хранения спермы баранов в целях рационального и долгосрочного использования баранов-производителей.

Благодаря исключительной эффективности метода криоконсервации спермы как средства практической реализации крупномасштабной генотипической селекции он стал основным элементом национальных программ развития животноводства
большинства стран мира.

Находясь в одинаковых условиях кормления и содержания, помесный молодняк по основным продуктивным показателям и биологическим свойствам стоят на уровне казахских курдючных полугрубошерстных.

В настоящее время метод криоконсервирования зародышей является наиболее перспективным при достаточном хранении генетического материала.

3.8. Разделение эмбрионов

Разделение эмбрионов с последующей их пересадкой реципиентам позволяет получать монозиготных (идентичных) животных, имеющих не только одинаковый пол, но и новый генотип. Это новый экспериментально разработанный метод, который уже используется в рамках работ по трансплантации эмбрионов, существенно повышает многоплодие крупного рогатого скота. Экспериментальному получению идентичных близнецов способствовали достижения фундаментальных исследований ранних стадий эмбриогенеза, показавших тотиногентность клеток (т. е. их способность развиваться в полноценный организм) ранних эмбрионов и возможность воздействия на них посредством микрохирургических манипуляций.

В настоящее время установлено, что основным методом хранения половинок эмбрионов, позволяющим надежно и долговременно их сохранять, является глубокое их замораживание. Этот метод дает возможность создавать большие массивы близнецов-двоен одновременно. Последнее обстоятельство имеет большое значение для селекции крупного рогатого скота, так как на больших массивах монозиготных двоен, полученных в короткие сроки, можно наиболее точно по сравнению с существующими методами оценить генетический прогресс в популяции на протяжении нескольких поколений и тем самым надежно определить эффективность применяемых селекционных методов.

При получении большого количества идентичных эмбрионов целесообразно часть их замораживать. Коров можно оценивать по собственной продуктивности и отбирать из них лучших в качестве матерей быков. Такой же метод пригоден и для воспроизводства ценных быков. После оценки генетические копии лучших быков можно извлечь из замороженного устройства и получить идентичных быков. Такая биотехнология позволяет получить чистую прибыль, которая была бы затрачена на содержание одного быка до его окончательной оценки по качеству потомства.

., [74] отмечают, что в последние десятилетия интенсивно велись работы по разделению эмбрионов сельскохозяйственных животных методами микроманипуляции. Согласно литературным источникам причиной развития однояйцевых двоен в естественных условиях является то, что в половом аппарате самки происходит разделение эмбриона на 2- и 8-клеточной стадиях на две равные половины, после чего они отделяются друг от друга и развиваются в отдельные эмбрионы, вследствие чего появляются двойни с одинаковыми генотипами. Следовательно, каждый бластомер имеет одинаковый набор хромосом. Этот фактор является основой предпосылкой для искусственного получения монозиготных двоен в практике животноводства.

В настоящее время искусственное получение однояйцевых близнецов на основе микроманипуляции с ранними эмбрионами приобретает в воспроизводстве и селекции сельскохозяйственных животных большое практическое значение и позволяет решить ряд таких вопросов как повышение эффективности трансплантации эмбрионов; создание идентичной, генетически ценной группы животных; создание резерва генов с известными генотипическими и фенотипическими признаками (один из эмбрионов оценивается после рождения, а другие находятся в эмбриобанке). В связи с этим проводятся научно-исследовательские работы по получению монозиготных двоен овец путем биопсии и культивирования (in vitro) изолированных бластомеров, извлеченных с эмбрионов на стадии 4; 6 клеток.

Материалом для проведения эксперимента послужили эмбрионы, полученные после процедуры экстракорпорального оплодотворения ооцитов овец, извлеченных с фолликулов яичника убойных овцематок.

Установлено, что микрохирургически выделенные из 4-6-клеточных эмбрионов бластомеры способны продолжать свое развитие. Был сделан вывод, что основным условием для успешного развития является наименьшее травмирование бластомеров при биопсии, скорость проведения микрохирургии, условия и состав среды для культивирования, а также качество отобранного эмбриона. Наибольший процент развития наблюдался при подсадке в пустую зону двух бластомеров. При биопсии из 6-клеточного эмбриона 4 бластомеров и подсадке их по 2 бластомера в зоны пеллюцида их развитие составляет в среднем 17-20 %, а оставленных в своей оболочке – 72-75 %.

Следует отметить, что при культивировании внутренняя масса (бластомеры) монозиготных эмбрионов по размеру меньше, т. е. внутренняя полость зоны Пеллюцида заполняется не полностью как у обычного эмбриона.

На данное время ведутся экспериментальные работы по усовершенствованию методики культивирования и биопсии бластомеров эмбрионов на разных стадиях развития, а также подбор и изготовление микроинструментов.

Все изложенные выше результаты исследований позволяют сделать заключение о возможности значительного повышения многоплодия на основе получения монозиготных близнецов посредством микроманипуляции разделения ранних эмбрионов.

ВЕТЕРИНАРНЫЕ АСПЕКТЫ БИОТЕХНОЛОГИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

С развитием биотехнологии появилась возможность использовать различные организмы, в том числе и растения, для производства вакцин, белков и ферментов, не существующих в природе. Принцип один: в организм вводится ген, который контролирует и обеспечивает синтез названных соединений.

Налажено производство генноинженерными методами сывороток для профилактики и терапии многих опасных болезней: препаратов для повышения иммунитета животных. В этом случае используют бактерии, чаще всего E. coli, в которые вводят гены, контролирующие образование соответствующих соединений. С помощью таких вакцин удалось решить проблему бешенства [75].

По сообщению и других [76] среди болезней опухолевой природы сельскохозяйственных животных наибольшую опасность представляет лейкоз крупного рогатого скота. Продукты, полученные от больных лейкозом животных, содержат аномальные метаболиты триптофана, лизина и других циклических аминокислот. Они обладают выраженными канцерогенными свойствами и являются вредными для здоровья человека. Поэтому лейкоз крупного рогатого скота представляет актуальную социальную, медицинскую и общебиологическую проблему, требующую научно обоснованного практического решения.

Существенным достижением является получение трансгенных кроликов с интегрированным геном антисмысловой РНК вируса лейкоза. В течение более восьми поколений эти животные при заражении их вирусом лейкоза не заболевают этой болезнью, контроль поражается на 100 %. Сейчас стоит задача получить крупный рогатый скот с интегрированной данной конструкцией. Попытка создания вакцины не увенчались успехом. Создание трансгенного крупного рогатого скота с данным геном может решить эту сложнейшую задачу. Интеграция антисмысловых РНК к другим вирусам позволит создать популяции, генетически устойчивые к этим вирусным заболеванием.

Направление по получению трансгенных животных, продуцирующих биологически активные вещества, получило практическое применение в медицинской, ветеринарной и пищевой промышленности. Хотя научные исследования в данном направлении ведутся и будут вестись. В центре биотехнологии ВИЖ получены трансгенные овцы, продуцирующие химозин в молочной железе, кролики, продуцирующие инсулин человека и т. д. [77].

Второе направление трансгенеза – получение трансгенных животных, генетически устойчивых к инфекционным заболеваниям. Примером служат трансгенные животные, полученные Центром биотехнологии ВИЖа. Полученные трансгенные кролики с интегророванными генами интерферона менее восприммчивы к вирусным болезням, в другом случае Мх ген мышей обеспечивает невосприимчивость их к гриппу.

В последнее время активно развивается направление по получению трансгенных животных с интегрированными генами антисмысловой РНК, которые блокируют воспроизведение определенных вирусов. В центре биотехнологии ВИЖ получены трансгенные кролики, более 10 поколений которых устойчивы к заражению лейкозом. Возможно, что именно этот путь перспективен в борьбе с лейкозом КРС. В этом направлении, вероятно, возможно интегрировать гены, продуцирующие антитела и другие биологически активные вещества, определяющие устойчивость животных к определенным заболеваниям [77].

Широкое распространение клеточных культур и постоянно возникающие новые аспекты их применения обусловлены бурным прогрессом техники культивирования и появлением все большего числа клеточных линий. В настоящее время культуры клеток тканей и органов человека и животных используются в биологических исследованиях самых различных направлений. Важную роль клеточные культуры играют в биотехнологии, в производстве средств диагностики и специфической профилактики болезней сельскохозяйственных животных и птиц. В настоящее время большинство противовирусных препаратов производится с использованием первичных культур клеток из нормальных тканей различных видов домашних и лабораторных животных. При этом особое внимание уделяется усовершенствованию методов получения первичных клеточных культур и наиболее важному и трудоемкому процессу трипсинизации органов и тканей. Так же большое значение придается отработке оптимальных условий культивирования того или иного вида культур клеток [78].

Получение трансгенных растений-продуцентов вакцин является одним из перспективных направлений генетической инженерии. Исследования последних лет показали, что белки различных микроорганизмов можно успешно производить в растительных системах с сохранением их иммуногенных свойств. При переносе в геном растения чужеродные гены стабильно интегрируются и передаются потомкам. В настоящее время во многих лабораториях мира на основе трансгенных растений разрабатываются вакцины против различных болезней человека и животных [79, 80, 81, 82], многие из которых проходят клинические испытания и готовы к практическому использованию [83, 84, 85, 86]. В связи с этим особый интерес представляет получение вакцин на основе трнсгенных растений против оспы овец. В результате проведенных исследований определены антигенно активные белки вируса оспы овец. Проведена ПЦР амплификация гена ЕЕV099 вируса с использованием модифицированных праймеров. Размер амплифицированного фрагмента ДНК составил 650 п. н. Конструирован рекомбинантный вектор pY-EEV-TMV, содержащий ген белка EEV099 вируса оспы овец, проведен компьютерный анализ на наличие последовательностей донорных и акцепторных сигналов сплайсинга. Проведено секвенирование и анализ клонированного гена. Показана наработка специфического белка вируса оспы овец в бесклеточной системе из зародышей пшеницы.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5