Была установлена зависимость оплодотворяемости от кратности осеменения. Двухкратное осеменение маток замороженным семенем в одну охоту с интервалом 8-10 часов, по сравнению с однократным в совхозе «Жиренкопинский» повысило результат ягнения на 7,3 %, в совхозе «Новая жизнь» на 4,1 %, а по контрольной группе соответственно на 3,9 и 2,1 %.

Для изучения влияния сезона года, особенностей овуляции на оплодотворяемость коров и определения оптимального времени осеменения были созданы 3 группы животных в количестве 24 коров. Животных осеменяли замороженно-оттаянной спермой. В эксперименте были использованы коровы черно-пестрой породы. Анализ первичной документации по искусственному осеменению коров, проведенный в хозяйствах Акмолинской области, показал, что в большинстве случаев от первого осеменения телятся 30-35 % коров. Вместе с тем в опытах с убоем животных, осемененных в аналогичных условиях и убитых на 3-7-й день после осеменения, в 85-90 % случаев в яйцеводах обнаруживались оплодотворенные яйцеклетки. Это значит, что часть оплодотворенных яйцеклеток приходится на пренатальные потери, которые составляют 35 %. Отмечено, что в разных хозяйствах среди животных разных видов влияние вышеперечисленных причин может быть различным, зависящим от видовой специфики, а также от физиологического состояния вида животного, хозяйственных условий [34].

3.4. Извлечение эмбрионов и их оценка

Метод извлечения зародышей у доноров является важнейшей составной частью общей технологии трансплантации эмбрионов у сельскохозяйственных животных, которые требуют тщательного и безошибочного осуществления. Эффективность метода трансплантации во многом осуществляется способом извлечения эмбрионов. Для трансплантации рекомендуется использовать бластоциты, поэтому эмбрионы извлекают между 7-8 сут. после первого искусственного осеменения. Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулировавших животных могут быть извлечены 3 способами: после убоя донора, хирургическим и нехирургическим.

Общий успех трансплантации эмбрионов зависит не только от уровня суперовуляции, но и от способности вымывать эмбрионы. Раньше вымывали эмбрионы с помощью металлической канюли с валиком, зафиксированной в яйцеводе. В результате фиксации канюли в яйцеводе у некоторых доноров в этом месте образовались послеоперационные спайки, которые препятствовали попаданию яйцеклетки в яйцевод при овуляции, и 20-30 % прооперированных доноров становились бесплодным. Авторы усовершенствовали процедуру вымывания эмбрионов для того, чтобы исключить манипуляции с яйцеводом. Вначале проводили лапароскопическое обследование яичников донора. В исследованиях результативность вымывания эмбрионов из рогов матки полулапароскопическим способом в среднем составила 61,5 %. Этот метод необходимо использовать для вымывания 5-6 дневных эмбрионов у овец для того, чтобы сохранить воспроизводительную способность доноров. Указано, что сезон, тип и доза генадотропного гормона, индивидуальные особенности донора, возраст эмбрионов и некоторые другие факторы оказывают определенное влияние на эффективность вымывания [35].

Отечественные ученые предлагают производить многократное извлечение эмбрионов овцематок - доноров каракульских овец в случной сезон года, подвергая их повторной обработке с целью получения от них большего числа эмбрионов [36, 37]. Однако, М. Калгимбаева [38] при введении повторной дозы препарата СЖК после случного сезона у 36,4 % доноров проявлялась высокая и средняя чувствительность к нему. Поэтому автор предлагает двукратное извлечение эмбрионов в течение одного года применять лишь в случаях острой потребности в сохранении или ускоренном размножении редчайших высокоценных генотипов.

В исследованиях по трансплантации применяют различные способы и сроки вымывания ранних эмбрионов из репродуктивных органов овцематок-доноров [39, 40].

и др. [41] вымывание эмбрионов овец производили на 6 сутки полового цикла из рога матки, при этом вымываемость составила 70,9 % от общего числа овуляций.

В исследованиях [42] вымывание эмбрионов гормонально обработанных овцематок производили из просвета яйцеводов в промежутке между 32-80 часами после выявления овцематок-доноров в стадии половой охоты (выявление овцематок в стадии половой охоты производили при помощи барана-пробника два раза в сутки – утром и вечером).

В результате исследований было установлено, что процент вымываемости ранних эмбрионов из просвета яйцеводов в определенной степени зависит от уровня полиовуляции в яичниках.

Зависимость процента вымываемости яйцеклеток и эмбрионов из яйцеводов овцематок-доноров от уровня полиовуляции показала, что наибольший процент вымываемости эмбрионов из яйцеводов был отмечен у доноров при невысоком уровне полиовуляции (3-6) 91,3 процентов. У животных с более высоким уровнем полиовуляции (7-10; 11-14; 15-18) наблюдается снижение процента вымываемости эмбрионов соответственно от 85,7; 84,0; 76,4 процента. У животных с более высоким уровнем полиовуляции (19 и более) процент вымываемости падает почти на половину (53,5 %). Эти данные свидетельствуют о том, что с повышением уровня полиовуляции процент вымываемости зародышей из яйцеводов снижается.

Данное явление можно объяснить тем, что при гормональной обработке самок наблюдается увеличение объема жидкости в половом тракте, усиливается его сократительная деятельность. Это ведет к нарушению баланса половых гормонов в организме, которое препятствует нормальному перемещению половых клеток.

Переход зародышей у каракульских овец в полость рогов матки в естественных условиях происходит в промежутке между 66-72 часами.

При индукции полиовуляции наблюдается некоторое сокращение сроков пребывания ранних эмбрионов в яйцеводах овцематок-доноров.

Исследования автора показали, что при промывании репродуктивных органов овцематок с полиовулированными яичниками по истечении 62-66 часов от времени выявления их (овцематок) в стадии половой охоты уже часть эмбрионов обнаруживается в полости рогов матки.

Данное явление объясняется тем, что овулировавшие яйцеклетки, попадая в яйцевод, не задерживаются в нем, в продолжение того времени, которое они находятся при естественной овуляции. Они переходят в полость рогов матки несколько раньше.

Было обнаружено, что при вымывании эмбрионов из яйцеводов овцематок между 32-48 часами от времени их выявления в стадии половой охоты до момента вымывания среднее число овуляций на одного полиовулировавшего донора составило 4,3; при вымывании в промежутке между 48-64 часами – составило 8,3; а в промежутке 64-80 часов – 8,5 овуляций. При том наибольший процент вымываемости наблюдался при вымывании в промежутке 32-48 часов (92,4 %). Но при этом число овуляций в среднем на одного донора составило всего 4,3; а наибольшее число овуляций в среднем на одного донора было обнаружено при вымывании в промежутке между 64-80 часов (8,5 %), но при этом процент вымываемости эмбрионов составил 31,8 %.

Наибольшее число вымытых эмбрионов (7,2) в среднем на одного донора обнаружено при вымывании яйцеводов в промежутке между 48-64 часов.

Следовательно, на процент вымываемости ранних эмбрионов из яйцеводов овцематок-доноров влияет срок их вымывания.

В результате проведенных исследований можно заключить, что на процент вымываемости ранних эмбрионов из яйцеводов овцематок-доноров влияют уровень полиовуляции в яичниках и сроки их вымывания.

Оптимальным сроком вымывания эмбрионов из яйцеводов гормонально обработанных овцематок является 48-64 часа от момента выявления овцематок в стадии половой охоты, при котором получено в среднем 7,2 яйцеклеток и ранних эмбрионов при вымываемости 86,7 процентов [43].

Основы трансплантации эмбрионов в каракулеводстве заложены в 1986 году сотрудниками КазНИИ каракулеводства Н. Алибаевым, О. Бекетауовым [44]. В ходе экспериментов были отработаны основные технологические приемы трансплантации эмбрионов и усовершенствованы некоторые из них. Так, например, анализ полученных данных показал, что лучшие результаты дает извлечение эмбрионов комбинированным способом, т. е. одновременным промыванием рога матки и яйцевода: от 12 доноров, имевших в среднем по 6,7 овуляций, извлечено 77,5 % эмбрионов, или 5,2 на каждого донора. Исследования в этом направлении продолжаются.

По результатам Н. Алибаева, , М. Калгимбаевой [45] на высокую эффективность вымывания эмбрионов доноров существенно влияет объем возвращенной жидкости. Они рекомендуют маточно-трубно-маточный способ вымывания эмбрионов, суть которого заключается в том, что перед промыванием блокируется маточно-трубное соединение завязыванием стерильной шелковой ниткой на уровне 1,0 - 1,5 см. до границы перехода рога матки к яйцепроводу и промывка производится поочередно от верхушки рога матки в сторону буфирикации, где вставлен двухканальный катетер Фоллея и от верхней точки нижнего блокированного участка в направлении бахромки, где вставлена промывная пластмассовая трубка. Причем при промывке рога матки набирают шприцом по 20 мл фосфатно-солевой среды и вводят в рог с последующим нагнетанием 20мл воздуха, а промывка яйцепровода осуществляется в такой же последовательности с нагнетанием 10мл промывной жидкости и 10 мл воздуха.

При этом установлено, что объем возвращенной жидкости при применении нового способа составил 91,3 %, что на 33,5 больше по сравнению с традиционными способами. И это увеличивает вымываемость на 20 % (Р<0,001).

Главным критерием оценки животных-доноров является количество и качество эмбриопродукции, получаемых от них. Приведены данные развития эмбрионов по стадиям у доноров, двукратно обработанных в течение одного случного сезона. Отмечено, что по некоторым отдельным стадиям наблюдается незначительное снижение показателей во 2-й цикл: бластомеров с 24,3 до 9,5 %, ранних морул – с 42,4 до 33,3 %. Эксперименты по многократному извлечению эмбрионов, проведенные в случной сезон года, позволили установить, что каракульские овцы, подвергнутые повторной гормональной обработке, могут воспроизводить большое число эмбрионов с высоким качеством. Следовательно, учитывая потенциал повторных обработок для стимуляции суперовуляции, приходится, что именно этот способ будет единственным гарантом, препятствующим исчезновению и способствующим сохранению особо редких генотипов каракульских овец [46].

Н. Алибаев., О. Бекетауов., К. Байтореев [47] отмечают, что результативность метода трансплантации и ее экономический эффект во многом зависит от качества эмбрионов, а материальной основой оценки эмбрионов является морфологическая разнокачественность структурных элементов эмбрионов, из которых они состоят. На качество эмбрионов существенно влияет воспроизводительная способность и уровень суперовуляции доноров. Исходя из этого, изучены качество эмбриопродукции доноров для определения доли влияния возраста доноров на степень получаемых от них эмбрионов.

Установлено, что молодые доноры (1,5 лет), отобранные и использованные в качестве репродукторов эмбриопродукции, в разные годы дали высококачественные эмбрионы с морфологической оценкой «5» и «4» в пределах от 62,5 до 90,0 %. Наибольшее число высококачественных эмбрионов были получены от доноров в возрасте 2,5-4,5 лет (от 73,1 до 92,9 %). Доноры 5,5- и 6,5-летнего возраста дали низкий процент эмбрионов, из всего количества полученной эмбриопродукции в этом возрасте почти половина была низкого качества (40,0-58,8 %). Наибольшее число полноценных эмбрионов было получено от доноров среднего возраста, а наименьшее – от доноров старшего возраста, хотя они содержались в одинаковых условиях. Следовательно, возраст доноров является одним из главных факторов повышения их эмбриопродуктивности при сохранении и ускоренном размножении высокоценных генотипов каракульских овец казахского внутрипородного типа окраски сур.

Длительное хранение эмбрионов животных в жидком азоте позволяет решить эту сложнейшую проблему в ближайшее время, но при этом возникают свои специфические проблемы. Например, необходимо определить продолжительность времени, в течение которого могут продержаться эмбрионы в жизнеспособном состоянии при низкотемпературном сохранении, в частности у каракульских овец. И хотя теоретические и экспериментальные основы криоконсервации эмбрионов животных заложены, но данная проблема пока полностью не раскрыта, режим криоконсервации гамет и эмбрионов разных животных неодинаков и его необходимо специально разрабатывать для каждого вида и породы. Эта проблема для нашей страны особенно актуальна.

Все вышеперечисленное послужило основанием для проведения исследований, поскольку чувствительность эмбрионов к низкой температуре является основным препятствием для практического использования большинства известных методов криоконсервации биоматериалов.

Проведена работа по проверке жизнеспособности эмбрионов после длительного хранения в низкотемпературном режиме. Оценивалась жизнеспособность замороженно-оттаянных эмбрионов каракульских овец разных оригинальных окрасок после хранения их в низкой температуре (-196 град. С) в течение 3; 6 и 12 месяцев.

Жизнеспособность эмбрионов после длительного хранения зависела не только от стадии развития, но и от их качества. При этом 100 %-ную сохранность продемонстрировали эмбрионы отличного и хорошего качества до 6-месячного хранения, затем данный показатель незначительно снизился, и после 12-месячного хранения он составил соответственно 93,3 и 87,5 %.

Малоэффективным оказалось хранение эмбрионов удовлетворительного качества. При этом сохранность после 3-месячного хранения составила 60,0 %, а 6- и 12-месячное криоконсервирование оказало губительное влияние на их жизнеспособность, т. е. не было обнаружено с жизнеспособными признаками ни одного эмбриона от общего числа замороженных, дегенерация – 100 %.

В целом эмбрионы на разных стадиях эмбрионального развития и разного качества отличаются неодинаковой криоустойчивостью к длительному хранению. При этом поздние эмбрионы отличного и хорошего качества лучше переносят длительное хранение.

Установлено, что уровень сохранности эмбрионов каракульских овец после 3-месячного хранения в среднем составляет 86,4 %, после 6-месячного – 84,8 и после 12 месяцев – 72,9 %. При этом криоустойчивость эмбрионов отличного и хорошего качества доходят до 97, 5 и 95,8 %. Это доказывают возможность хранения эмбрионов особо редких генотипов каракульских овец на длительное время. Ранние морулы можно сохранить в жизнеспособном состоянии до 3 месяцев, поздних бластоцист – до 6 месяцев, поздних морул и ранних бластоцист 12 и более месяцев [48].

Оценивают качество эмбрионов на основании определения стадий их развития, состояния оболочек и внутренних структур. Биологически полноценными принято считать такие эмбрионы, которые имеют правильную шарообразную форму, гомогенную светлую цитоплазму, неповрежденную прозрачную оболочку, одинакового размера бластомеры с плотным межклеточным контактом, Они должны соответствовать по уровню дробления возрасту от момента оплодотворения до их извлечения.

3.5. Пересадка эмбрионов

Пересадку обычно осуществляют реципиентам в рог матки на стороне яичника с желтым телом (ипсилатеральный рог). При определении пригодности реципиентов к пересадке эмбрионов учитывают наличие и выраженность желтого тела в яичнике. Отсутствие желтых тел или оставшиеся от предыдущих циклов желтые тела предполагают выбраковку реципиентов. Наличие желтого тела цикла совместно с фолликулом свидетельствует о пригодности реципиента. Яичник с желтым телом обычно несколько увеличен.

В настоящее время пересадка эмбрионов реципиентам осуществляется хирургическим и нехирургическим способами.

В последние годы пересадку делают через боковой разрез при местной анестезии в стоячем положении реципиента. Этот метод прост и менее трудоемок.

При нехирургическом (трансцервикальном) методе подготовка реципиентов производится также, как и доноров при нехирургическом извлечении эмбрионов. Преимущество метода заключается в простоте, экономичности и возможности многократно использовать реципиентов. Трансцервикальный метод пересадки эмбрионов по исполнению аналогичен искусственному осеменению, но требует большой квалификации, так как операции проводятся на 6-8-й дни после охоты, когда шейка матки уже закрыта и катетеры для пересадки необходимо проводить как можно дальше в рога матки, обычно на расстояние 5-6 см от шейки матки.

Для теоретического познания жизнеспособности эмбрионов и выработки практических приемов снижения эмбриональной смертности проведено исследование по изучению темпов дробления клеточных масс эмбрионов в эмбриогенезе. В целях пересадки к реципиентам, отобраны 87 эмбрионов на стадии морула ранняя, полученные от каракульских овцематок разных внутрипородных типов. Отобранные эмбрионы в зависимости от степени развития их внутриклеточных масс подразделены на 3 группы. Установлено, что подбирая для пересадок эмбрионы с высоким и со средними темпами дробления клеточных масс, можно существенно повысить их приживляемость после хирургической пересадки. При пересадке эмбрионов с высоким статусом развития (1 гр.) суягность овец-реципиентов, зафиксированная после пересадки составила 62,5 %, после пересадок эмбрионов со средним статусом (2 гр.) – 55,6 и с низким статусом развития (3 гр.) – 27,8 %. Эмбриональная смертность в 3 гр. была максимально высокой (72,2 %), во второй – 44,4 и заметнее меньше в первой – 37,5 %. В среднем приживляемость эмбрионов ставила 51,7 %. Исследования показали, что отбирая эмбрионы с высоким и со средним статусами отличного качества можно снизить потери эмбрионов до 26,7 %. Экспресс-метод отбора жизнеспособных эмбрионов по степени их развития позволяет выделять биологически полноценные эмбрионы и при пересадке их реципиентам прогнозировать приживляемость пересаженных эмбрионов. Следовательно, для снижения ранней эмбриональной смертности необходимо учитывать степень развития эмбрионов в период эмбриогенеза. Что существенно повысит приживляемость пересаженных эмбрионов и экономическую эффективность технологии трансплантации эмбрионов[49].

В настоящее время уже разработаны различные схемы гормональной обработки с целью получения яйцеклеток от живых овец-доноров и системы культивирования ин витро для оплодотворения яйцеклеток и культивирования их до стадии морулы и бластоцисты. У крупного рогатого скота получение яйцеклеток от живых доноров производится ректо-вагинально с помощью ультразвукового аппарата и вакуумного насоса, оплодотворение яйцеклеток и культивирование их ин витро до стадии морулы и бластоцисты является необходимостью, так как на коровах широко используется нехирургический метод пересадки эмбрионов. В отличие от крупного рогатого скота, у овец зиготы и эмбрионы можно пересадить только хирургически или с помощью лапароскопа. В данном исследовании авторы [50] хотели определить будет ли прямая пересадка яйцеклетки овце-реципиенту результировать рождение полноценного потомства, таким образом исключая созревание и оплодотворение яйцеклетки ин витро и культивирование ее до стадии морулы и бластоцисты. Авторы отмечают, что получили ягненка-трансплантанта от пересадки яйцеклетки. Результаты исследований показали, что прямая пересадка яйцеклетки реципиенту с интактным фолликулом и последующее осеменение реципиента результируют рождение полноценного потомства. Необходимы дополнительные исследования для изучения того, будет ли лапароскопическое получение и пересадка яйцеклеток таким же эффективным и менее травмирующим по сравнению с обычной пересадкой эмбрионов. Гормональные препараты и лабораторные материалы для этого исследования были представлены университетом Висконсин-Мадисон, США.

3.6. Криоконсервация (глубокое замораживание) эмбрионов

В странах с развитой технологией трансплантации эмбрионов половина получаемых зигот подвергается криоконсервации (глубокому замораживанию) и продолжительному их хранению, так как этот метод предлагает целый ряд выгод:

- отпадает необходимость в стадах синхронизированных реципиентов. Избыточное количество эмбрионов может быть заморожено для использования в будущем;

- большой выбор эмбрионов различных типов может быть собран и использован в любое время и в любом месте;

- хранение эмбрионов позволяет проводить различные тесты на состояние здоровья, осуществлять перевозку эмбрионов во всем мире с гарантией отсутствия заболеваний;

- сохраняет разнообразие генетического материала, включая в себя наследственность материнского и отцовского организмов до времени осуществления интенсивных программ селекции.

Существует несколько методов сохранения эмбрионов. Выбор метода зависит от качества эмбрионов и продолжительности хранения.

Самым эффективным и перспективным методом консервации эмбрионов является их глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 град. С.

В итоге многолетних исследований наметилось два направления в разработке методов криоконсервирования эмбрионов сельскохозяйственных животных:

- медленное охлаждение до -70;-80 град. С, при котором происходит дегидратация с последующим переходом в твердое состояние (метод медленного замораживания включает и медленное оттаивание эмбрионов, при котором дегидратация клеток протекает постепенно и их тонкая структура, а также биохимические и физиологические потенции остаются неповрежденными);

- медленное охлаждение до -38;-40 град. С и затем быстрое замораживание в жидком азоте или в другом хладагенте. При такой технологии полной дегидратации клеток не происходит, и поэтому их оттаивают с повышенной скоростью, помещая контейнеры с эмбрионами сразу же из жидкого азота в водяную баню с температурой +25;+37 град. С.

Весь процесс глубокого замораживания состоит из отдельных этапов, от которых зависит эффективность этого метода: получение эмбрионов, подготовка их к замораживанию, процесс замораживания, хранение в жидком азоте, оттаивание, оценка жизнеспособности эмбрионов по морфологическим признакам или культивированию и пересадка их реципиентам.

, [51] и другими изучалось влияние витрификации на приживляемость эмбрионов овец. Изучена жизнеспособность ранних эмбрионов овец при воздействии верификационных растворов и витрифика­ции. Полученные данные расширяют научные знания в фундаментальных аспектах криобиологии и призваны помочь в дальнейшем решить проблему сохранения ценных и исчезающих пород овец Казахстана, Как известно, для сохранения генетических ресурсов ценных и исчезающих пород животных изучаются различные аспекты криоконсервации гермаплазмы, в частности, криоконсервации эмбрионов овец. В настоящее время при криоконсервации эмбрионов изучается и разрабатывается новое направление - витрификация. Это направление существенно отличается от криоконсервации по температур­ному режиму охлаждения и составу криопротекторов. В результате морфологи­ческой оценки эмбрионов были получены следующие результаты: из общего количества витрифицированных эмбрионов после оттаивания пригодными для дальнейшей трансплантации были признаны 14 эмбрионов, что составило 43,7 % от общего количества витрифицированных эмбрионов, которые были трансплантированы реципиентам. Из четырнадцати трансплантированных эмбрионов семь развились до рождения живых ягнят, приживляемость трансплантированных витрифицированно-оттаянных эмбрионов составила 21,8 %. Таким образом, в результате исследований были получены научные данные о влиянии витрификации на морфологию эмбрионов овец. Несмотря на довольно низкий процент приживляемости эмбрионов (21,8 %), считаем необходимым продолжение исследований с применением различных витрифи-кационных растворов, влияющих на морфологию и приживляемость эмбрионов при витрификации, а также применением новейшего специального обо­рудования, позволяющего изменять скорость охлаждения при витрификации до ЗООООСо/мин, используемого учеными США и Европы. Дальнейшие исследова­ния в данном направлении расширят научные знания в фундаментальных аспектах криобиологии и помогут в дальнейшем решить проблему сохранения ценных и исчезающих пород овец Казахстана.

Таким образом, накопленный криобиологический опыт дает возможность целенаправленно совершенствовать метод глубокого замораживания и оттаива­ния, обеспечивающий высокий процент выживаемости эмбрионов.

В настоящее время для консервации эмбрионов применяют в основном два метода: криоконсервация и витрификация, которые различаются не только используемыми составами сред для замораживания, но и по скорости замораживания. [52] использована новая методика консервации эмбрионов овец при сверхнизкой температуре и ультрабыстрой витрификации. Изучена жизнеспособность ранних эмбрионов овец при воздействии сверхнизкой температуры и ультрабыстрой витрификации при использовании нового оборудования VIT-Master. Установлено, что ультрабыстрое замораживание уменьшает вероятность формирования кристаллов льда.

В этом исследовании показана эффективность витрификации при комбинированном использовании сверх охлажденного LN и криопетли (cryoIoop). Предложенный метод является быстродействующим и эффективным для криосохранения эмбрионов в программах по сохранению генетических ресурсов животных.

Исследования показали, что эмбрионы овец способны перескочить через опасную температурную зону при ультра быстрой скорости замораживания, сохраняя свою способность к дальнейшему развитию. Объем витрификационного раствора, используемый в витрификации с применением криопетли (cryoloop) является достаточно небольшим, чтобы усилить успех витрификации и также избежать возникновения потенциальных повреждений эмбрионов в течение процесса замораживания.

Как известно, для сохранения биоразнообразия генетических ресурсов животных большее внимание уделяется разработке метода сохранения ex situ – путем создания банков глубокозамороженного генетического материала (гамет и эмбрионов).

Для криоконсервации эмбрионов разрабатываются оптимальные составы криопротекторов и температурные режимы замораживания, которые позволят увеличить приживляемость криоконсервированных эмбрионов. Целью исследований было изучить влияние различных криопротекторов, в частности этиленгликоль (ЭГ) и диметилсульфоксид (ДМСО) на приживляемость замороженно-оттаянных эмбрионов овец. В качестве доноров эмбрионов были использованы ярки породы казахский архаромеринос в количестве 10 голов. В качестве реципиентов были использованы полновозрастные 3,5-4,5 летние овцематки едилбаевской породы. Были сформированы две группы замороженно-оттаянных эмбрионов, замороженные различными криопротекторами ЭГ и ДМСО: 1. Замороженно-оттаянные эмбрионы, замороженные с использованием криопротектора Этиленгликоль/глицерин (группа – Э/Г); 2. Замороженно-оттаянные эмбрионы, замороженные с использованием криопротектора Диметилсульфоксид/глицерин (группа – ДМСО).

Общее количество эмбрионов подвергшихся оттаиванию составило 34, из них: 17 эмбрионов замороженных с использованием криопротектора этиленгликоль/глицерин (Э/Г) и 17 эмбрионов замороженных с использованием криопротектора диметилсульфоксид (ДМСО). Была проведена морфологическая оценка качества эмбрионов после замораживания-оттаивания с целью выявления их полноценности для дальнейшей трансплантации. В результате чего было выявлено, что из 17 замороженно-оттаянных эмбрионов (группа Э/Г) после морфологической оценки были признаны пригодными для дальнейшей трансплантации 14 эмбрионов, что составляет 82,3 % от общего количества эмбрионов этой группы и признаны непригодными 3 эмбриона (17,7 %). Из группы ДМСО, состоящей из 17 замороженно-оттаянных эмбрионов, по морфологическим признакам выявлены 11 эмбрионов пригодных для трансплантации, что составило 64,7 % от общего количества эмбрионов данной группы и непригодными признаны 6 эмбрионов (35,3 %). Эмбрионы, пригодные морфологическим признакам, были трансплантированы хирургическим путем по одному эмбриону 25 реципиентам, находящимся на одинаковой стадии полового цикла по срокам развития трансплантируемых эмбрионов.

Тойшибекова [53] свидетельствуют о том, что применение при криоконсервации эмбрионов овец этиленкгиколя и глицерина на фосфатно-солевом буфере дает хорошие результаты. Группы эмбрионов замораживали с использованием в качестве криопротектора этиленгликоля (Sigma, USA) (концентрацию доводили до 1,5М) и глицерина (Sigma, USA) (концентрацию доводили до 1,ОМ) на фосфатно-солевом буфере Дюльбекко (DPBS, Sigma, USA). Для замораживания использовали программируемый замораживатель. Оттаивание производили на водяной бане при температуре +38°С. Затем эквилибрировали эмбрионы в растворах с понижающей концентрацией этилен-гликоля/глицерина и понижающей концентрацией сахарозы с экспозицией по 5 минут в каждом растворе. Отмытые эмбрионы суспензировали 20 минут в фосфатно-солевом буфере Дюльбекко при комнатной температуре. Затем проводили морфологическую оценку эмбрионов на разных стадиях развития. Количество эмбрионов, пригодных для дальнейшей трансплантации, на стадиях развития морула и бластоциста составило 64,3 и 66,7 процентов соответствен­но. Полученные результаты опыта свидетельствуют о том, что при криоконсервации эмбрионов на разных стадиях развития необходимо учитывать морфологические признаки и использовать для криоконсервации эмбрионы, находящиеся на стадиях морулов и бластоцистов. Это связано с тем, что у эмбрионов овцы весьма чувствительной областью к замораживанию является zona pellucida, которая часто повреждается. Однако если в процессе

криоконсервации морулы и бластоцисты их бластомеры не повреждаются, то частичное повреждение zona pellucida не влияет на трансплантацию эмбрионов, находящихся в названных стадиях, но оказывает отрицательное действие на эмбрионы, находящиеся на более ранних стадиях развития.

Изучение приживляемости эмбрионов различных групп проводилось на основе рождения полноценных ягнят от овцематок-реципиентов. Из общего количества реципиентов 14 голов, которым были трансплантированы замороженно-оттаянные эмбрионы (группа Э/Г), показали, что были рождены 7 голов ягнят-трансплантатов, что составляет от общего количества 17 эмбрионов 41,1 %. Из замороженно-оттаянных эмбрионов (группа ДМСО) родилось 5 голов, что составило 29,4 %. Таким образом, был выявлен процент приживляемости. Был проведен анализ приживляемости замороженно-оттаянных эмбрионов групп Э/Г и ДМСО, который наглядно показал, что применение криопротектора ДМСО имеет более низкий процент приживляемости эмбрионов овец на стадии морула. Авторы [54] считают, что наиболее целесообразным продолжить исследования по изучению влияния различных криопротекторов, а также концентраций их составляющих, для получения наиболее оптимальных криопротекторов для криоконсервации эмбрионов овец.

В работе . [55] обсуждаются проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных с ее основными разделами генной клеточной инженерии. Разработаны технологические приемы искусственного осеменения сельскохозяйственных животных который, позволил создать новые генотипы животных. Наилучшая технология криоконсервации семени быков, соответствующая мировому стандарту применяется в племенном центре «Асыл-Тулiк». Семя замораживается в маркированных паеттах обеспечивающий асептичность, высокую выживаемость и долговечность семени. Использование этого семени даст значительную прибавку молока у дочерей. Создана и работает специальная лаборатория по трансплантации эмбрионов коров. Отмечено, что будут начаты исследования по получению трансгенных животных, птиц и рыб. Планируется проведения комплекса работ по клонированию и генной инженерии. Это криоконсервация и оплодотворение ооцитов, определение пола ранних эмбрионов, ретовирусная система переноса гена в молочную железу, интеграция плазмидных генноинжинерных конструкции в геномы животных, будет создан банк данных выдающихся особей сельскохозяйственных животных. В целом это будет новый этап развития аграрной науки Казахстана, ориентированный на выход в международный рынок.

За последние 10 лет овцеводство республики пополнилось 5 новыми породами и 5 типами: казахская и акжаикская породы полутонкорунных овец, казахские курдючные овцы с осветленной шерстью 3 типов, австралийские мериносы, сарыаркинская порода, бирликский и суюндукский типы едилбаевских овец. Казахские полутонкорунные овцы созданы путем максимального использования баранов, полученных путем трансплантации эмбрионов, которые имели более высокие адаптивные свойства. Исследовательским центром овцеводства впервые были проведены эксперименты по трансплантации замороженных эмбрионов, доставленных из Австралии, и использованию замороженного семени баранов породы авасси, завезенной из Израиля [56].

Одной из отечественных локальных пород в нашей стране является каракульская порода овец, обладающая целым рядом ценнейших и уникальных генетических качеств, обеспечивающих их адаптацию к сложным, часто весьма экстремальным условиям среды. К сожалению, в настоящее время идет сокращение внутрипородного разнообразия, и эта уникальная порода овец нуждается в защите. Длительное хранение эмбрионов животных в жидком азоте позволяет решить эту сложнейшую проблему в ближайшее время. В результате проведенных исследований установлено, что уровень сохранности эмбрионов каракульских овец после 3-месячного хранения в среднем составляет 86,4 %, после 6-месячного – 84,8 и после 12-месячного – 72,9 %. При этом криоустойчивость эмбрионов отличного и хорошего качества доходит до 97,5 и 95,8 %. Это доказывает возможность хранения эмбрионов особо редких генотипов каракульских овец длительное время [57].

Исследовательский центр овцеводства проводит исследования по совершенствованию методов воспроизводства овец, которые включают разработку новых синтетических сред для кратковременного и длительного хранения спермы, совершенствование методов получения и криоконсервации эмбрионов и яйцеклеток. Предложен новый способ замораживания спермы в соломинках объемом 0,25 мл непосредственно в сосуде Дьюара, который позволил значительно сократить расход жидкого азота. Разрабатываются способы криоконсервации спермы в пластиковых пробирках и соломинках объемом 1,5-2,0 мл, которые позволят ускорить и упростить маркировку и фасовку семени и увеличить производительность. Представлен способ двукратного замораживания спермы, который позволяет более быстро и точно определять наиболее эффективные составы при разработке новых синтетических сред для криоконсервации спермы. В годах от высокопродуктивных баранов разных пород заготовлено 22,5 тыс. доз замороженного семени. Показана возможность получения ягнят-трансплантатов путем прямой пересадки яйцеклеток овце-реципиенту с интактным фолликулом и последующим осеменением реципиента [58].

Авторы [59] отмечают, что биотехнология в рамках воспроизводства животных охватывает целый ряд мероприятий, основанных на фундаментальных достижениях в исследованиях репродуктивной функции ее регуляции, и становится основой для ускоренного размножения высокопродуктивных животных с целью лучшего использования их биологических резервов. Проведена работа по трансплантации эмбрионов у овец дегересской, казахской грубошерстной и казахской тонкорунной пород. Изучение живой массы показало, что скорость роста у овец-трансплантатов за постнатальный период их развития проходила более интенсивно в сравнении с контрольной группой сверстников-полусибсов, полученных традиционным путем. Установлено, что в расчете на одну матку-донора от молодняка трансплантатов (баранчики и ярочки дегересской и казахской грубошерстной пород) в возрасте 5 мес. произведено молодой ягнятины больше, чем при обычном методе размножения.

Соблюдение правильной биотехнологии криоконсервации и пересадки эмбрионов позволит обеспечить стельность реципиентов на том уровне, что и при пересадке свежеполученных эмбрионов. Вместе с тем метод криоконсервации в будущем существенно может быть упрощен или вообще можно отказаться от удаления криопротектора и пересаживать эмбрионы реципиентам непосредственно после оттаивания без дальнейших манипуляций. По прогнозу специалистов, криоконсервированные эмбрионы могут храниться десятки и сотни лет.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5