Hur kan fotoakustisk flödescytometri användas för att identifiera bakterier med hjälp av bakteriofager?

Fotoakustisk flödescytometri möjliggör detektion av små partiklar i flöde genom deras optiska absorptionsförmåga. Genom att märka bakterieceller med deras specifika bakteriofager, som i sin tur bundits till en optiskt absorberande färg, kan vi särskilja och identifiera dessa celler i komplexa vätskemiljöer som blod eller PBS. Denna metod bygger på principen att laserpulser (532 nm) exciterar det absorberande färgämnet, vilket ger upphov till ultraljudsvågor som detekteras akustiskt.

Bakteriofager förbereds genom att suspenderas i en buffert och märkas med färgämnet Direct Red 81, vilket ger selektiv optisk absorption vid 532 nm. Överskottsfärg avlägsnas genom pelletering och resuspension. Spektralfotometri (t.ex. med Nanodrop) används för att verifiera absorptionen. Vidare kan bakteriofagernas svansar isoleras genom osmotisk chock efter CsCl-gradientrening. Detta steg tar bort kapsiderna och lämnar svansstrukturerna intakta. Svansarna renas ytterligare via HPLC, och proteinrenhet fastställs med optisk densitetsmätning vid 260 och 280 nm.

För att skapa en stabil och reproducerbar signal, kopplas de biotinylerade svansarna till streptavidinbelagda mikrosfärer, vilket ger jämn och definierad optisk absorption. Dessa komplex tvättas noggrant för att avlägsna obundna komponenter och säkerställa specifik interaktion.

Innan analysen startar behandlas systemet med en 1 % BSA-lösning som skapar en hydrofob barriär mot ospecifik vidhäftning. Laser och sprutpumpar startas, luftbubblor avlägsnas, och systemet kalibreras. Datan samlas in med hjälp av LabView och förstärks 50 gånger med Tegam 4040B-förstärkare. En 32 dB förstärkning och ett högpassfilter på 1 MHz tillämpas för att maximera signal-brusförhållandet.

Användningen av modifierade bakteriofager – där genetiskt material har avlägsnats men igenkänningsproteiner bevarats – eliminerar risken för cellys och tillåter längre analysfönster än med hela fager. Genom att kombinera dessa svansar med en homogen optisk bärare som mikrosfärer får man en kontrollerbar och reproducerbar fotoakustisk respons, vilket i sin tur förbättrar känslighet och specificitet vid bakteriell detektion.

Det är avgörande att förstå att metodens framgång inte enbart beror på märkningen utan även på en exakt kalibrerad optisk och akustisk detektionsmiljö. Systemets geometri, energinivåer och akustisk impedans måste samverka optimalt. Likaså kräver tvåfasflödet noggrann kontroll för att säkerställa konsekvent provleverans utan turbulens eller diffusion som kan påverka signalen. Teknikens potential sträcker sig långt bortom laboratoriet – med rätt klinisk validering kan detta bli ett verktyg för snabb, selektiv och minimalinvasiv diagnostik av bakteriella infektioner i patientnära miljöer.

Hur kan fotoakustisk avbildning användas för att visualisera frön och medicinska implantat?

Fotoakustisk (PA) avbildning har visat sig vara ett effektivt verktyg för att visualisera frön och andra små medicinska implantat i kroppsvävnader, vilket öppnar nya möjligheter för att guida minimalt invasiva medicinska procedurer. Frön, som kan vara utmanande att visualisera på grund av deras lilla storlek och reflekterande ytor, ger upphov till komet-svans eller akustiska reverberationsartefakter både i PA- och ultraljudsbilder (US). Dessa artefakter, som uppträder på grund av frönas starkt reflekterande ytor, kan försvåra korrekt visualisering om inte rätt metoder används.

För att undersöka hur PA och US avbildning kan användas för att visualisera frön från olika vinklar, genomfördes experiment där fröer roterades i olika grader. Vid en liten rotationsvinkel på 15° var en stor del av fröet synlig på PA-bilden, medan endast den proximala spetsen var synlig på US-bilden. När rotationsvinkeln ökades förlorade både PA och US sin förmåga att visualisera fröets mittdel. Dessa resultat bekräftar PA-bildens överlägsenhet i att fånga detaljer på större vinklar och djup.

Vid inbäddning av frön i exvivo prostata vävnad från nötkreatur visade PA avbildning förmåga att visualisera fröer på djup upp till 13 mm. Denna teknik medförde en signifikant förbättring i kontrast jämfört med US-bilder, med en förbättring på upp till 27,9 dB. PA avbildning visade också ett optimalt resultat vid användning av en lång våglängd på 1047 nm, vilket gav en fördelaktig balans mellan ljusabsorption i vävnaden och den optiska absorptionen av metaller som fröerna var tillverkade av.

Vid jämförelse av PA och US-bilder, visade PA avbildningen en överlägsen förmåga att korrekt identifiera fröerna, vilket gav en bättre prestanda för klassificering. En annan studie visade att PA-bilder av palladiumfrön, som implanterades i exvivo hundprostata vävnad, kunde ge en realistisk uppskattning av fröernas position och form. Denna forskning visar på den potentiella användningen av PA-teknik för att guida brachyterapi (BT) i klinisk praxis, särskilt när det gäller att visualisera små objekt i vävnad.

För att uppnå tillräcklig ljuspenetration för PA-avbildning vid större djup (5 cm eller mer), undersöktes olika ljusleveransmetoder. Transrektal ljusleverans, där ett optiskt fiber kopplas till en ultraljudssond, visade sig vara en effektiv metod, även om den är begränsad av optisk dämpning vid rektalväggen. För transperineal ljusleverans integrerades en optisk fiber i en BT-nål, vilket möjliggjorde exakt belysning nära fröerna under implantationen. En annan metod, transuretral ljusleverans, använde en optisk fiber placerad i en urinblåscateter som kunde riktas för att optimera ljusets inverkan på fröerna.

Trots fördelarna med PA-avbildning, visar det sig att det finns praktiska utmaningar när det gäller att nå tillräcklig ljusintensitet för att visualisera fröerna på djupare nivåer av vävnad. En studie visade att PA-bilder av frön på avstånd från ljuskällan var synliga vid en energitäthet på 123 mJ/cm², vilket precis överskred säkerhetsgränsen för laserexponering (100 mJ/cm² vid 1064 nm) enligt amerikanska standarder. Detta innebär att vid användning av PA-teknik är det viktigt att noggrant justera ljusintensiteten för att säkerställa säker användning i kliniska tillämpningar.

När det gäller att visualisera andra medicinska implantat, som koronara stenter, har PA-teknik också visat sig vara lovande. Koronara stenter, som används för att hålla förträngda artärer öppna vid behandling av hjärtsjukdomar, kräver noggrann bildbehandling vid placering och efterföljande bedömning för att säkerställa korrekt placering. Traditionellt används röntgenfluoroskopi för att vägleda proceduren, men denna metod har begränsningar när det gäller djupperception och innebär strålningsexponering. PA avbildning i kombination med intravaskulärt ultraljud (US) ger en djupare insikt i stenternas position och den omgivande vävnadens struktur, vilket förbättrar precisionen vid placeringen.

För att optimera användningen av PA-teknik vid stentplacering, genomfördes försök med PVC-baserade vävnadssimulatorer för att visualisera stenter i PA-bilder. Resultaten visade att PA-avbildning kunde ge hög specifikhet för att identifiera stenternas struktur, medan den intravaskulära US-bilden gav ytterligare morfologisk information om kärlväggen. Denna kombination av PA och US avbildning är ett lovande sätt att förbättra resultatet av stentplacering och postoperative bedömning, genom att minska risken för felaktig positionering eller komplikationer.