A microscopia de fluorescência de vida útil (FLIM) tem emergido como uma ferramenta essencial na biologia celular, proporcionando uma análise detalhada dos tempos de vida das moléculas fluorescentes. Uma das abordagens inovadoras que tem atraído grande atenção no campo das técnicas de super-resolução é o uso de phasores, que permitem a extração eficiente de informações espectrais e de tempo de vida em experimentos complexos. Em particular, a combinação de dados espectrais e de tempo de vida tem sido fundamental para aplicações como a desmistificação de múltiplos corantes fluorescentes e a análise de autofluorescência, oferecendo uma nova perspectiva na investigação celular.

Em experimentos de dual-color PAINT, por exemplo, os phasores demonstraram uma eficiência notável na classificação das emissões de fluorescência de moléculas individuais, como o Nile Red e o POPO-III. Esses corantes, com espectros de emissão amplamente sobrepostos, podem ser facilmente desmembrados quando analisados no espaço dos phasores. A representação espectral dos dados em coordenadas de phasor permite uma separação clara e eficiente, facilitando a identificação de diferentes fluoróforos, como ilustrado pelos resultados de Manko et al. (2024). A eficiência de espectros de fluorescência pode, assim, ser significativamente melhorada por meio dessa análise, proporcionando uma interpretação mais precisa dos fenômenos celulares em estudo.

O método de FLIM espectralmente resolvido (sFLIM) combina informações espectrais e de tempo de vida em uma única análise. Essa abordagem tem sido fundamental para uma variedade de aplicações, como a análise de transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET), desmistificação de múltiplos corantes e interpretação de autofluorescência. A capacidade de combinar essas duas fontes de dados oferece uma vantagem considerável, pois permite que os cientistas investiguem fenômenos dinâmicos e interações moleculares com uma resolução mais alta, como mostrado em estudos de Pelet et al. (2004) e Niehörster et al. (2016).

Além disso, a utilização de phasores em combinação com FLIM tem facilitado a análise de misturas complexas de sinais de fluorescência, proporcionando uma solução prática e eficiente para a resolução de múltiplos dados de vida útil e espectrais. O método phasor S-FLIM, por exemplo, tem sido empregado com sucesso para realizar o “unmixing” cego de assinaturas espectrais e de tempo de vida de espécies desconhecidas, conforme demonstrado por Scipioni et al. (2021). Essa técnica permite a separação de componentes espectrais e temporais de forma robusta, sem a necessidade de modelagem preditiva complexa, o que representa uma grande melhoria no processamento de dados em tempo real.

Um exemplo fascinante de como os phasores podem ser aplicados a dados espectrais e de vida útil é o uso da matriz completa de excitação e emissão, que resulta em um "Triângulo Universal" em vez de um "Círculo Universal". Isso expande a utilização de todos os comprimentos de onda de excitação e emissão, permitindo uma análise mais detalhada e precisa das assinaturas espectrais. Isso foi explorado por Socas e Ambroggio (2022), que mostraram como essa abordagem pode melhorar a resolução espectral sem sacrificar a precisão temporal dos dados.

A combinação de FLIM com a análise de phasores também foi aplicada de forma eficaz em citometria de fluxo de vida útil de fluorescência (FLFC), como evidenciado no trabalho de Alturkistany et al. (2019), para estudar a relação entre NAD(P)H livre e ligado durante a apoptose celular. A integração de phasores com FLIM permitiu a visualização dinâmica das mudanças na fluorescência em tempo real, proporcionando uma análise mais rápida e com maior resolução temporal.

Em sistemas mais avançados, como demonstrado por Sorrells et al. (2021), a análise em tempo real de FLIM utilizando aceleradores de GPU tem se tornado uma ferramenta poderosa, permitindo a análise em taxa de vídeo de dados FLIM. Essa velocidade de análise é crucial para a observação de processos celulares rápidos, como a captação de corantes, e para a observação da autofluorescência de NAD(P)H em tecidos ex vivo.

Além das aplicações mencionadas, a técnica de phasor associada ao FRET/FLIM tem sido empregada em estudos de rearranjos espaciais e temporais da arquitetura da cromatina durante a resposta ao dano no DNA, conforme exemplificado no estudo de Lou et al. (2019). A análise das variações na compactação da cromatina foi facilitada pelo uso de phasores, fornecendo uma maneira precisa de monitorar as mudanças dinâmicas na estrutura cromossômica com alta sensibilidade.

Portanto, a integração das abordagens de FLIM e phasor tem demonstrado ser uma ferramenta poderosa e altamente versátil, permitindo aos pesquisadores explorar aspectos fundamentais da biologia celular e molecular com uma resolução superior. O uso dessas técnicas não só tem ampliado o entendimento de processos celulares, como também tem levado a avanços significativos na área de diagnóstico e terapias baseadas em fluorescência.

Como o Mecanismo de Quenching Afeta a Fluorescência e o Que Isso Revela Sobre as Interações Moleculares

A análise do quenching da fluorescência, particularmente no contexto da interação entre fluoresceína e íon iodeto, é fundamental para compreender os processos que modulam a emissão luminosa em sistemas moleculares. O gráfico de Stern–Volmer, que representa a razão entre a fluorescência sem quenching (F0) e com quenching (F) em função da concentração do quencher ([Q]), revela uma relação linear cujo coeficiente angular corresponde à constante de quenching KSV. Essa constante, por sua vez, é o produto da constante de taxa de quenching bimolecular (kq) pelo tempo de vida do estado excitado sem quencher (τ0). No sistema fluoresceína/iodeto, KSV aproxima-se de 8,3 L mol⁻¹, com τ0 igual a 4 nanossegundos e kq em torno de 2 x 10⁹ M⁻¹ s⁻¹, valores que indicam uma eficiência elevada do processo de quenching dinâmico.

O quenching dinâmico resulta da colisão entre o fluoróforo no estado excitado e o quencher, levando à desativação não radiativa do fluoróforo e consequente diminuição da intensidade e do tempo de vida da fluorescência. O processo é dependente da difusão molecular e pode ser descrito pela constante de taxa kq, que é a multiplicação da eficiência do quenching γ pelo limite difusional bimolecular, calculado como kq = 4πaDN', onde "a" representa a soma dos raios moleculares do fluoróforo e do quencher, D a soma dos coeficientes de difusão, e N' o número de Avogadro ajustado para concentração em milimolar. A suposição comum de γ = 1, embora frequentemente válida, pode não abranger a diversidade dos mecanismos de quenching, que podem incluir troca de spin eletrônico, transferência eletrônica ou acoplamento spin-órbita, cada um influenciando de forma distinta a eficiência da desativação.

A redução do tempo de vida do estado excitado é explicada pelo fato de que moléculas de fluoróforo com maior duração no estado excitado têm maior probabilidade de interagir com o quencher, sendo desativadas preferencialmente. Assim, o decaimento da intensidade da fluorescência ocorre mais rapidamente na presença do quencher, evidenciado pela relação τ0/τ = 1 + kqτ0[Q] para quenching dinâmico puro, que pressupõe um decaimento monoexponencial do tempo de vida.

Contrariamente, o quenching estático ocorre quando o fluoróforo forma um complexo estável no estado fundamental com outra molécula não fluorescente, reduzindo a fluorescência sem alterar o tempo de vida do estado excitado. A relação para o quenching estático é F0/F = 1 + Ka[Q], onde Ka é a constante de associação do complexo. Quando ambos os mecanismos coexistem, a expressão combinada é dada por F0/F = (1 + kqτ[Q])(1 + Ka[Q]), resultando em uma curva ascendente característica no gráfico de Stern–Volmer, evidenciando a contribuição quadrática da concentração do quencher.

Alterações no espectro de absorção frequentemente acompanham a formação de complexos estáticos, e a análise da fluorescência em conjunto com medidas de tempo de vida permite discriminar entre os mecanismos de quenching. Em sistemas biológicos, a heterogeneidade estrutural dos fluoróforos, como os resíduos de triptofano em proteínas, pode gerar curvas não lineares de Stern–Volmer devido à acessibilidade diferencial dos sítios aos quenchers. Modelos que consideram populações acessíveis e inacessíveis, como o proposto por Sherwin Lehrer, ajustam as equações para refletir a fração de fluoróforos quenchados, permitindo uma interpretação mais precisa da dinâmica molecular em ambientes complexos.

Além disso, a interpretação dos dados deve levar em conta que a eficiência do quenching depende não só da interação física e química entre as moléculas, mas também da microestrutura do meio, como viscosidade, temperatura e presença de outros agentes interferentes. O estudo do quenching não é apenas um método para avaliar interações moleculares, mas também uma ferramenta para explorar propriedades intrínsecas das moléculas fluorescentes e suas dinâmicas em solução ou em ambientes biológicos.

É crucial entender que a fluorescência, por ser sensível a mudanças no ambiente molecular, pode servir como um indicador de conformações, associações e mudanças estruturais, e que o quenching, ao alterar intensidade e tempo de vida, fornece múltiplas camadas de informação complementar. O uso combinado de medidas de intensidade e de tempo de vida permite separar mecanismos dinâmicos e estáticos, oferecendo uma visão abrangente da natureza das interações em sistemas fluorescentes.

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